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肠道微生物群
原始研究
Bacteria-derived长链脂肪酸在结肠炎展品消炎
  1. 朱利安Pujo1,2,
  2. 卡米尔Petitfils1,
  3. 波林Le Faouder3,
  4. 凡妮莎Eeckhaut4,
  5. 流行Payros1,
  6. 莎拉Maurel1,
  7. 特蕾莎修女Perez-Berezo1,
  8. 马提亚·户5,
  9. 弗雷德里克Barreau1,
  10. 凯瑟琳伯兰1,
  11. Stephane Chavanas6,
  12. 菲利普·Immerseel4,
  13. 贾丝廷Bertrand-Michel3,
  14. 埃里克·奥斯瓦尔德1,7,
  15. 克劳德。可耐福1,8,
  16. Gilles迪特里希1,
  17. 帕特里斯·D Cani5,8,
  18. 尼古拉斯Cenac1
  1. 1IRSD,由INRA INP-ENVT,图卢兹大学3保罗Sabatier,图卢兹、法国
  2. 2Farncombe家庭消化健康研究所,麦克马斯特大学健康科学学院,汉密尔顿,安大略、加拿大
  3. 3MetaToulLipidomics设施,INSERM UMR1048,图卢兹、法国
  4. 4病理学,细菌学和禽流感疾病,根特大学兽医学院,Merelbeke、比利时
  5. 5瓦龙卓越生命科学和生物技术(WELBIO),鲁汶药物研究所、代谢和营养研究小组,UCLouvain,大学catholique de鲁汶,布鲁塞尔、比利时
  6. 6中心病理生理学Toulouse-Purpan (CPTP),图卢兹大学健康科学研究所,图卢兹、法国
  7. 7服务de bacteriologie-hygiene,友谊医院楚图卢兹Purpan,图卢兹、法国
  8. 8NeuroMicrobiota、欧洲相关实验室(EAL),INSERM / UCLouvain,图卢兹,布鲁塞尔、法国、比利时
  1. 对应到UMR1220尼古拉斯Cenac博士IRSD INSERM,图卢兹Occitanie,法国;nicolas.cenac在{}inserm.fr

文摘

客观的从临床研究数据表明,某些益生菌菌株有可能调节结肠炎症。尽管如此,这些数据在不同的研究由于使用的益生菌菌株和穷人知识机制的行动。

设计通过质谱仪,我们识别和量化自由长链脂肪酸(LCFAs)益生菌和评估其中之一在小鼠结肠炎的影响。

结果在所有的LCFAs量化质谱大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)益生菌用于治疗多种肠道疾病,3-hydroxyoctadecaenoic酸的浓度(C18-3OH)增加与其他相比,EcN大肠杆菌压力测试。口服C18-3OH减少结肠炎引起的葡聚糖硫酸酯钠在老鼠身上。确定其他微生物群组成的细菌能够产生C18-3OH,我们有针对性的小鼠的肠道微生物群与生命起源以前的fructooligosaccharides (FOS)提交。安全系数的抗炎特性与结肠C18-3OH浓度的增加有关。微生物群分析发现,C18-3OH的浓度与丰度的增加Allobaculum,Holdemanella和Parabacteroides。在文化、Holdemanella biformis高浓度的C18-3OH生产。最后,使用TR-FRET绑定分析和基因表达分析,我们证明了C18-3OH是过氧物酶体扩散国的受体激动剂激活受体γ。

结论生产C18-3OH由细菌可能是一个涉及益生菌的抗炎作用机制。由细菌生产LCFA-3OH可能涉及微生物群/主机交互。

  • 肠道细菌微生物区系
  • 益生菌
  • 脂质
  • 实验性结肠炎
  • PPARγ

数据可用性声明

所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2020 - 321173

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 临床使用的益生菌是antibiotic-associated和高效艰难梭状芽胞杆菌相关的腹泻和呼吸道感染。

    • 即使有效的动物模型结肠炎,益生菌的细菌疗法在人类肠道炎性疾病是不确定的。

    • 缺乏知识益生菌的作用机理。

    有什么新发现吗?

    • 两个益生菌,大肠杆菌Nissle 1917和Holdemanella biformis产生高浓度的一个免费的长链脂肪酸hyrdoxylated第三碳(LCFA-3OH): C18-3OH。

    • 口服治疗C18-3OH降低硫酸葡聚糖sodium-induced结肠炎在鼠标。

    • C18-3OH过氧物酶体扩散国的受体激动剂激活受体γ。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 细菌LCFA-3OH可能涉及微生物群/主机交互。

    • h . biformis有炎症性肠病(IBD)的治疗效果。

    • 生命起源以前的fructooligosaccharides相关h . biformis和/或大肠杆菌Nissle 1917可能是一个小说在炎症性肠病的治疗方法。

    Bacteria-derived长链脂肪酸在结肠炎展品消炎

    介绍

    最近的一次审查现有的荟萃分析透露,以证据为基础的临床使用益生菌益生菌的影响只是antibiotic-associated和艰难梭状芽胞杆菌相关的腹泻和呼吸道感染。1关于其他领域,包括肠道炎症,荟萃分析缺乏定义类型和益生菌菌株的生物效应。这种差异可能是由于使用的益生菌菌株和穷人知识机制的行动。理解的机制,因此益生菌对哺乳动物宿主的影响是很大的必要性。在益生菌,我们关注大肠杆菌Nissle 1917 (EcN),革兰氏阴性菌株(血清型O6: K5: H1)用作益生菌治疗腹泻、肠易激综合症和炎症性肠病(ibd)。2 - 4然而,即使在临床前模型其益生菌效果对比。口服EcN减少肠道炎症引起的慢性结肠炎CD4的转移+CD62L+小鼠T淋巴细胞严重联合免疫缺损。5在急性结肠炎引起的小鼠模型的葡聚糖硫酸酯钠(DSS)饮用水,EcN的影响取决于使用DSS的百分比。在2% DSS模型中,EcN政府没有对粘膜炎症的影响。5相比之下,剂量的3.5% DSS, EcN促进康复DSS-induced肠道损伤与减少炎性分子和黏蛋白的增加和紧密连接蛋白mRNA的表达。6这些例子EcN对结肠炎的影响突出当前知识的缺乏机制EcN益生菌的活动。体外,很少有研究关注于EcN paracellular渗透率降低的机理,证明了这种细菌的增加紧密连接蛋白,Zonula occludens(佐薇)1和ZO-2,表达在上皮细胞,减少CXCL8的生产。7 8在先前的研究中,我们确定了EcN-derived lipopeptide C12AsnGABA哦作为一个中介能够减轻内脏过敏而不影响paracellular渗透率。9

    本研究的目的是为了解读EcN的抗炎机制和调查它是否可能扩展到其他细菌。在这里,我们表明,细菌长链脂肪酸(LCFA)羟化第三碳,C18-3OH,减少小鼠结肠炎通过激活过氧物酶体扩散者激活受体γ(PPARγ)上皮细胞。

    方法

    动物

    C57BL / 6 j小鼠年龄在6 - 10周(Janvier、圣昆汀Fallavier、法国)。老鼠在卫生条件没有病原体与免费的水和食物,报12小时光明与黑暗的交替周期。研究设计开发在线补充材料。

    识别羟化LCFA

    羟化的描述LCFAs进行高性能液体(U3000热费希尔科学,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)耦合线一个傅里叶变换质谱计(QExactive +高分辨率质谱仪,热费希尔科学、不来梅、德国)后细菌脂质提取(在线补充方法)。

    结果

    羟化脂肪酸由EcN的量化

    基于质谱仪的质量分辨率允许精确的m / z测量和产品离子光谱的分析,我们确定了几个LCFA羟化第三碳与Cn = C10, C12 C12:1, C14, C14:1 C16或C16:1(见在线补充结果和在线补充图1)。脂肪酸的最大长度大肠杆菌是Cn = C18,10定量方法是在一个低分辨率的三重四极质谱仪耦合在线液相色谱同时量化LCFA,从8到18个碳,羟化第三碳(LCFA-3OH)。另外,亚油酸代谢物和亚麻酸代谢物已经被添加到我们的定量方法。LCFA-3OH都是可量化和C14-3OH最丰富(图1一个)。低浓度的亚油酸代谢物:trihydroxyoctadecanoic酸(10-TriHOME和12-TriHOME), dihydroxyoctadecanoic酸(9 10-DiHOME和12 13-DiHOME)和hydroxyoctadecadienoic酸(9-HODE和13-HODE),量化在EcN丸(图1 b)。相比之下,9-octadecadienoic和13-octadecadienoic酸(9-oxoODE和13-oxoODE)和亚麻酸代谢物,9-hydroxyoctadecatrienoic和13-hydroxyoctadecatrienoic酸没有检测到细菌颗粒。相同的脂质中量化EcN培养基(在线补充图2)。

    Quantification of hydroxylated long chain fatty acids by LC-QQQ in bacterial pellets. Quantification of long chain fatty acid (LCFA) hydroxylated on the third carbon (A) and of metabolites from linoleic acid (C18:2n-6) (B) in Escherichia coli Nissle 1917 (EcN). Data are represented as whiskers plot (min to max, centred value at median). N=5–10 experiments of three independent bacterial cultures per group. (C) Heat map of hydroxylated LCFA quantified by LC-QQQ. Data are shown in a matrix format: each row represents a single lipid, and each column represents a strain of E. coli. Each colour patch represents the normalised quantity of LCFA (row) in a strain of E. coli (column), with a continuum of quantity from bright green (lowest) to bright red (highest). The pattern and length of the branches in the dendrograms reflect the relatedness of the polyunsaturated fatty acid (PUFA) metabolites. The dashed red line is the dendrogram distance used to cluster PUFA metabolites. (D) Quantification of C18-3OH in the different strain of bacteria. Data are represented as whiskers plot (min to max, centred value at median). N=5–10 experiments of three independent bacterial cultures per group. (E) Quantification of C18-3OH in EcN clbP-S95R (S95R), EcN ΔclbP (ΔclbP), EcN ΔclbA ΔentD (ΔClbA ΔentD) and wild type (WT) bacteria. Data are represented as whiskers plot (min to max, centred value at median). N=2 experiments of five independent bacterial cultures per group. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis and subsequent Dunn’s post hoc test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, significantly different from EcN.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    LC-QQQ量化的羟化长链脂肪酸的细菌颗粒。量化的长链脂肪酸(LCFA)羟化代谢物的第三个碳(A)和亚油酸(C18:2n-6) (B)大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)。数据被表示为胡须情节(最小到最大,集中值中位数)。N = 5 - 10实验每组三个独立的细菌培养。(C)热图的羟化LCFA LC-QQQ量化。数据显示在一个矩阵形式:每一行代表一个脂质,每一列代表一个的大肠杆菌。每个颜色块代表的正常化数量LCFA(行)的应变大肠杆菌(列),连续的数量从亮绿色(最低)亮红色(最高)。树枝的模式和长度的亲缘系统树图反映了多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢产物。的虚线红线是用于集群系统树图的距离PUFA代谢物。(D)量化的C18-3OH细菌的不同菌株。数据被表示为胡须情节(最小到最大,集中值中位数)。N = 5 - 10实验每组三个独立的细菌培养。(E)量化的C18-3OH EcN clbP-S95R (S95R), EcNΔclbP(ΔclbP), EcNΔclbAΔentD(ΔclbAΔentD)和野生型(WT)细菌。数据被表示为胡须情节(最小到最大,集中值中位数)。N = 2实验每组五个独立的细菌培养。统计分析了利用克鲁斯卡尔-沃利斯和随后的邓恩的事后测试。 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, significantly different from EcN.

    LCFA代谢物被量化的大肠杆菌从系统发育A组(MG1655)11从系统发育组和八个菌株B2包括5个病原体(NC101 NU14,泌尿道感染、钢管、SP15),12日至16日一个无症状(阿布),17一个共生体(M1/5)18和一个益生菌(EcN)。19层次聚类数量LCFA量化的细菌颗粒(pg /毫克的蛋白质)被用来揭示它们之间的主要区别(图1 c)。LCFA形成五个不同的集群。第一个集群是由LCFA MG1655浓度上升和NC101相比其他菌株(图1 c)。值得注意的是,C14-3OH和12,13-DiHOME MG1655显著增加;C16-3OH和C16:1-3OH MG1655 NC101相比之下,EcN和NC101 C18:1-3OH (在线补充图3和图4)。第二个集群歧视LCFA MG1655生产的高度,SP15和M1/5 (图1 c)。只有C12-3OH SP15与EcN相比显著增加(在线补充图3)。C18-3OH划定EcN第三只集群,显著增加与其他菌株相比的大肠杆菌(图1 c, D)。第四个集群是由LCFA表示在客运优先,但在他们的浓度(无显著差异图1 c和在线补充图3和图4)。C10-3OH形成第五集群在SP15相比之下,EcN显著增加(图1 c和在线补充图3)。因此,在所有LCFA量化大肠杆菌,C18-3OH是唯一一个与其他菌株相比,EcN显著调节(图1 d),需要进一步调查。基因的缺失或突变组合与其岛C18-3OH合成(没有影响图1 e)。

    C18-3OH减少DSS-induced结肠炎

    EcN减少炎症在DSS-induced结肠炎大鼠模型19和老鼠,6我们评估的能力C18-3OH调节DSS-induced结肠炎。口服C18-3OH DSS的老鼠并没有改变体重与DSS老鼠强饲法与车辆(图2一个)。尽管对减肥没有任何影响,C18-3OH显著降低宏观的评分(图2 b),结肠厚度(图2 c)、微观分数(图2 d)和结肠长度增加(图2 e在DSS老鼠。C18-3OH也减少了paracellular渗透率DSS-induced结肠炎小鼠(图2 f)。因此,口服C18-3OH结肠炎引起的严重程度降低了DSS。多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢产物被量化在小鼠的结肠组织使用液相色谱/串联质谱(质/ MS)。Resolvin E1 (RvE1), 11 beta-prostaglandin F2α(11β-pgf2α)、RvD3 lipoxin B4 (LxB4)、RvD2 RvD1,白三烯B5(LTB51 (7),maresin mar1), 5、6-dihydroxyeicosatetraenoic酸(5 6-DiHETE), 15 dpgj212-EET和11日12-epoxyeicosatrienoic酸(11日)在我们的样品没有量化。层次聚类的PUFA代谢物大量量化在活检(pg /毫克的蛋白质)被用来揭示治疗之间的主要差异和PBS DSS-treated老鼠服用或C18-3OH (图2 g)。PUFA代谢物形成三个不同的集群。第一个集群包含产品来源于n-6 PUFA的促炎属性(铂族元素2凝血恶烷B2(TXB2),LtB4,PGF2α和6 kpgf1α)。这些代谢物的浓度组合第一集群高DSS老鼠与车辆管理(图2 g)。铂族元素2、6 kpgf1a TxB2,8-HETE LtB4 8-isoPGA2 DSS中显著增加小鼠减少C18-3OH治疗(在线补充图5)。组之间没有统计学差异观察其他代谢物组成集群。第二个集群,由主要由n - 3 PUFA代谢物,歧视代谢物的浓度增加了DSS和C18-3OH / DSS老鼠(图2 g)。六个代谢物组成这个集群在DSS显著增加小鼠相比,控制老鼠(在线补充图5)。其中,12-hydroxyeicosatetraenoic酸(12-HETE),合格Dx (PDx)和PGD2明显减少了治疗小鼠C18-3OH (在线补充图5)。遇见心仪的浓度(5 6-EET 8、9-EET和14日15-EET), LxA4,5-oxo-eicosatetraenoic酸(5-oxoETE)和18-hydroxyeicosapentaenoic酸(18-HEPE),描述第三集群,减少在控制和DSS C18-3OH治疗后小鼠(图2 g)。邂逅了浓度明显减少C18-3OH和C18-3OH / DSS的老鼠相比,控制和DSS的老鼠在线补充图5)。因此,量化的PUFA代谢物符合C18-3OH的消炎作用。进一步,我们观察到DSS老鼠增加表达的基因编码三叶草因子3 (Tff3)黏液层和抗菌肽的稳定器再生islet-derived蛋白质3γ(Reg3γ)(图2 h)。相比之下,粘蛋白2表达的基因编码(Muc2)和紧密连接蛋白occludin zonula occludens 1 (Tjp1)减少(图2 h)。表达的基因Reg3γ和Tjp1被C18-3OH正常化治疗(图2 h)。DSS-induced结肠炎也与增加mRNA水平相关的细胞因子(Tnfα,Tgfβ,Il1β和白细胞介素6)和趋化因子(Ccl5,处于受控和Cxcl2)。所示图2 h,政府的C18-3OH DSS结肠炎小鼠导致显著抑制趋化因子处于受控和Cxcl2。的表达Nfκb是不变的(图2 h)。综上所述,我们的研究结果表明,C18-3OH展品在结肠炎小鼠抗炎活动。

    Oral administration of C18-3OH reduces dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis. acute colitis was induced by adding 3% DSS into the drinking water for 7 days. Mice were gavaged every day for 9 days (2 days before and the 7 days during DSS treatment) with 100 µM of C18-3OH solubilised in 100 µL of PBS/ethanol 3% or with the vehicle (PBS/ethanol 3%). (A) Weight gain was observed in DSS-treated (black symbols) or control mice (white symbols) treated with C18-3OH (square) or its vehicle (PBS, circle). Data are expressed as mean±SEM. Statistical analysis was performed using repeated-measures two-way ANOVA and a Bonferroni’s multiple comparisons post hoc tests. ***p<0.001 significantly different from control group. Colitis severity was assessed by macroscopic damage scores (B), colon thickness (C), microscopic damage scores (D) and colon length (E) in 3% DSS mice gavaged with C18-3OH (black bars) or vehicle (PBS, white bars). Data are expressed as mean±SEM. Statistical analysis was performed using Mann-Whitney test. **p<0.01, ***p<0.001 significantly different from PBS group. (F) In order to determine intestinal paracellular permeability, 4 hours after oral administration of FITC dextran 4 kDa, FITC fluorescence was quantified in the serum of mice treated with the DSS (black bars) or their control (white bars) and treated with C18-3OH (right bars) or its vehicle (PBS, left bars). Data are expressed as mean±SEM. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis and subsequent Dunn’s post hoc test. **p<0.01, ***p<0.001, significantly different from control/PBS group and # p<0.05, significantly different from DSS/PBS group. (G) Heat map of polyunsaturated fatty acid (PUFA) metabolites quantified by LC-MS/MS. Data are shown in a matrix format: each row represents a single PUFA metabolite, and each column represents a group of mice: C, control; D, DSS; C18, C18-3OH and D/C18, C18-3OH/DSS. each colour patch represents the normalised quantity of PUFA metabolites (row) in a group of mice (column), with a continuum of quantity from bright green (lowest) to bright red (highest). The pattern and length of the branches in the dendrogram reflect the relatedness of the PUFA metabolites. The dashed red line is the dendrogram distance used to cluster PUFA metabolites. (H) mRNA of several genes were quantified in colon of mice treated with the DSS (black bars) or their control (white bars) and treated with C18-3OH (right bars) or its vehicle (PBS, left bars) by quantitative real-time PCR. mRNA content was normalised to HPRT mRNA and quantified relative to the control/PBS group. Data are expressed as mean±SEM. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis and subsequent Dunn’s post hoc test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, significantly different from control/PBS group and ## p<0.01, ### p<0.001 significantly different from DSS/PBS group.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    口服的C18-3OH减少全身的葡聚糖硫酸酯钠(DSS)结肠炎。急性结肠炎被在饮用水中添加3% DSS诱导了7天。老鼠强饲法每天9天(2天前7天在治疗DSS) 100µM C18-3OH水溶性100年µL PBS /乙醇3%或车辆(PBS /乙醇3%)。(A)体重增加在DSS-treated(黑点)或控制老鼠(白色符号)处理C18-3OH(广场)或其车辆(PBS,圆)。数据表示为±SEM。统计分析是使用重复测量双向方差分析和执行Bonferroni的事后多重比较测试。* * * p < 0.001显著不同于对照组。结肠炎严重程度是由宏观损伤评估分数(B),结肠厚度(C)、微观损伤分数(D)和结肠长度(E)与C18-3OH 3% DSS老鼠强饲法(黑条)或车辆(PBS,白色的酒吧)。数据表示为±SEM。统计分析是使用Mann-Whitney执行测试。 **p<0.01, ***p<0.001 significantly different from PBS group. (F) In order to determine intestinal paracellular permeability, 4 hours after oral administration of FITC dextran 4 kDa, FITC fluorescence was quantified in the serum of mice treated with the DSS (black bars) or their control (white bars) and treated with C18-3OH (right bars) or its vehicle (PBS, left bars). Data are expressed as mean±SEM. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis and subsequent Dunn’s post hoc test. **p<0.01, ***p<0.001, significantly different from control/PBS group and # p<0.05, significantly different from DSS/PBS group. (G) Heat map of polyunsaturated fatty acid (PUFA) metabolites quantified by LC-MS/MS. Data are shown in a matrix format: each row represents a single PUFA metabolite, and each column represents a group of mice: C, control; D, DSS; C18, C18-3OH and D/C18, C18-3OH/DSS. each colour patch represents the normalised quantity of PUFA metabolites (row) in a group of mice (column), with a continuum of quantity from bright green (lowest) to bright red (highest). The pattern and length of the branches in the dendrogram reflect the relatedness of the PUFA metabolites. The dashed red line is the dendrogram distance used to cluster PUFA metabolites. (H) mRNA of several genes were quantified in colon of mice treated with the DSS (black bars) or their control (white bars) and treated with C18-3OH (right bars) or its vehicle (PBS, left bars) by quantitative real-time PCR. mRNA content was normalised to HPRT mRNA and quantified relative to the control/PBS group. Data are expressed as mean±SEM. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis and subsequent Dunn’s post hoc test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, significantly different from control/PBS group and ## p<0.01, ### p<0.001 significantly different from DSS/PBS group.

    抑制DSS-induced结肠炎用益生元与增加C18-3OH和三个相关细菌属

    为了确定如果其他肠道细菌能够产生LCFA-3OH,老鼠服用益生元(即fructooligosaccharides (FOS)提交non-digestible碳水化合物水解只有通过肠道菌群主要集中在升结肠。20.如前所观察C18-3OH,安全系数对减肥没有影响(在线补充图6),但降低炎症参数(在线补充图6中)和结肠炎小鼠paracellular渗透率(在线补充图6 f)。量化C18-3OH LCFA-3OH显示显著增加的安全系数/ DSS组相比,控制或DSS组(图3一)。在所有其他脂质检测中,只有C16-3OH显示增加浓度在DSS /安全系数组与控制(在线补充图7),但它的浓度也增加了DSS组与控制。因此,C16-3OH可能不太可能占饮食安全系数的抗炎效果。因此,安全系数只与相关的抗炎效应的增加C18-3OH DSS老鼠。层次聚类的PUFA代谢物显示四个集群(图3 b)。有趣的是,不同的构成集群与集群获得在C18-3OH实验中,除了一个新的集群(集群2,图3 b)。这个集群是由RvD5和PDx pro-resolving生物活性脂质,21DSS /安全系数组显著增加与控制(在线补充图5)表明他们可以参与生命起源以前的的消炎治疗。治疗”丛书DSS-induced结肠炎小鼠促炎症前列腺素的浓度下降(铂族元素2,PGD2和PGF2α),LtB4和TxB2(在线补充图7)作为观察与治疗C18-3OH (在线补充图5)。同意C18-3OH角色的安全系数的影响,遇见心仪的浓度减少DSS /安全系数组相比,控制和DSS组(在线补充图7 dC18-3OH)如图所示(在线补充图5 c和7 d)。调节基因表达的小鼠接受安全系数与C18-3OH / DSS老鼠也发现了相似之处。的确,安全系数降低Reg3g,Tjp1,处于受控和Il1β基因表达在DSS-induced结肠炎(在线补充图8)。为了识别细菌可能涉及C18-3OH浓度的增加,我们进行了微生物群分析。%的分层聚类属显示6个集群(图3 c)。第一个集群是由属与大量增加安全系数/ DSS老鼠(图3 c)。丰度在Akkermansia,Holdemanella,Allobaculum,Parabacteroides,Intestinimonas,Blautia和Christensenella在安全系数显著增加/ DSS组与控制(在线补充图9)。丰度在Akkermansia,Holdemanella,Allobaculum和Parabacteroides在安全系数也显著增加/ DSS组与DSS组(在线补充图9)。第二个集群歧视丰度在DSS集团属下降。相比之下,在属的细菌丰度组成第三集群提高DSS集团(图3 c)。丰度在Odoribacter,埃希氏杆菌属,Turicibacter和Coprococcus在DSS组与对照组相比显著增加(在线补充图9 b),丰度Turicibacter和Coprococcus降低安全系数/ DSS组与DSS组(在线补充图9 b)。第四集群是由丰度在属降低安全系数/ DSS,丰度增加控制的第五和第六丰度增加安全系数组(图3 c)。丰富的显著差异观察Barnesiella,Alistipes,乳酸菌,脱磷孤菌属,丁酸弧菌属,Nubsella和PedobacterDSS组和控制集群5之间,Kopriimonas和双歧杆菌属安全系数之间的组织和控制集群6 (在线补充图9 c, D)。唯一的丰度Akkermansia,Holdemanella,Allobaculum和Parabacteroides增加安全系数/ DSS组相比,控制和DSS的老鼠图3 c和在线补充图9)作为观察C18-3OH的浓度(图3一)。为了确定哪些属的细菌可能涉及C18-3OH的生产,我们研究之间的关系这四个属的丰度和C18-3OH的浓度。C18-3OH的浓度与丰富Holdemanella,Allobaculum和Parabacteroides但不是Akkermansia(图3 d)。我们培养Holdemanella biformis量化LCFA-3OH细菌颗粒和上层清液。所有LCFA-3OH,除了C16:1-3OH,是可以量化的h . biformis在其上层清液(在线补充图10)。C18-3OH的浓度h . biformis是高于EcN (图3 e)。因此,属的细菌Holdemanella可能涉及C18-3OH浓度的增加安全系数/ DSS中观察到老鼠。

    Fructooligosaccharides (FOS) diet increases C18-3OH concentration in colitis and gut microbiota analysis. Acute colitis was induced by adding 3% dextran sulfate sodium (DSS) into the drinking water for 7 days. FOS (10%) was added to the drinking water for 10 days (3 days before and the 7 days during DSS treatment). (A) Quantification of C18-3OH in colon of mice treated with the DSS (black symbols) or their control (white symbols) and treated with FOS (right) or not (left). Data are expressed as mean±SEM. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis and subsequent Dunn’s post hoc test. *p<0.05, ***p<0.001, significantly different from control/water group and #p<0.05, significantly different from DSS/water group. (B) Heat map of polyunsaturated fatty acid (PUFA) metabolites quantified by LC-MS/MS. Data are shown in a matrix format: each row represents a single PUFA metabolite, and each column represents a group of mice: C, control; D, DSS, F, FOS and F/D, FOS/DSS. Each colour patch represents the normalised quantity of PUFA metabolites (row) in a group of mice (column), with a continuum of quantity from bright green (lowest) to bright red (highest). The pattern and length of the branches in the dendrogram reflect the relatedness of the PUFA metabolites. The dashed red line is the dendrogram distance used to cluster PUFA metabolites. (C) Heat map of % of abundance in genus determinate by Illumina sequencing method. Data are shown in a matrix format: each row represents a single genus, and each column represents a group of mice: C, control; D, DSS, F, Fos and F/D, FOS/DSS. Each colour patch represents the normalised quantity of PUFA metabolites (row) in a group of mice (column), with a continuum of quantity from bright green (lowest) to bright red (highest). The pattern and length of the branches in the dendrogram reflect the relatedness of the PUFA metabolites. The dashed red line is the dendrogram distance used to cluster PUFA metabolites. (D) Correlation between the concentration of C18-3OH in the colonic tissue and % of abundance in Akkermansia, Holdemanella, Allobaculum and Parabacteroides. C18-3OH and % of abundance were determined for each mouse (black circle). Coefficient of correlation (r) between the % of abundance and the concentration of C18-3OH in the colonic tissue of mice was calculated. Data are represented as aligned dot plot with mean and errors linear regression lines. The significance of each correlation is indicated on each graphic by the p value. (E) Quantification of long chain fatty acid hydroxylated on the third carbon in bacterial pellets and culture medium of Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) and Holdemanella biformis. Data are expressed as mean±SEM. Statistical analysis was performed using Mann-Whitney test. *p<0.05, **p<0.01, significantly different from EcN group.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    Fructooligosaccharides (FOS)提交的饮食增加C18-3OH浓度结肠炎和肠道微生物群分析。急性结肠炎诱导通过添加3%葡聚糖硫酸酯钠(DSS)到7天的饮用水。安全系数(10%)被添加到饮用水10天(前3天,7天在DSS治疗)。(一)量化C18-3OH与DSS治疗组小鼠的结肠(黑点)或其控制(白色符号)和处理安全系数(右)(左)。数据表示为±SEM。统计分析了利用克鲁斯卡尔-沃利斯和随后的邓恩的事后测试。* * * * p < 0.05, p < 0.001,明显不同于控制/水和# p < 0.05,从DSS /水组明显不同。(B)热图的多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢物量化质/女士。数据显示在一个矩阵形式:每一行代表一个单一的PUFA代谢物,每一列表示一组老鼠:C,控制;D, DSS, F,安全系数和F / D,安全系数/ DSS。 Each colour patch represents the normalised quantity of PUFA metabolites (row) in a group of mice (column), with a continuum of quantity from bright green (lowest) to bright red (highest). The pattern and length of the branches in the dendrogram reflect the relatedness of the PUFA metabolites. The dashed red line is the dendrogram distance used to cluster PUFA metabolites. (C) Heat map of % of abundance in genus determinate by Illumina sequencing method. Data are shown in a matrix format: each row represents a single genus, and each column represents a group of mice: C, control; D, DSS, F, Fos and F/D, FOS/DSS. Each colour patch represents the normalised quantity of PUFA metabolites (row) in a group of mice (column), with a continuum of quantity from bright green (lowest) to bright red (highest). The pattern and length of the branches in the dendrogram reflect the relatedness of the PUFA metabolites. The dashed red line is the dendrogram distance used to cluster PUFA metabolites. (D) Correlation between the concentration of C18-3OH in the colonic tissue and % of abundance inAkkermansia,Holdemanella,Allobaculum和Parabacteroides。C18-3OH和%的丰度测定每个鼠标(黑圈)。之间的相关系数(r) %的丰度和浓度C18-3OH小鼠的结肠组织中计算。数据被表示为对齐点阴谋与线性回归均值和错误行。每个相关的意义上注明每个图形的p值。(E)量化的长链脂肪酸羟化第三碳的细菌颗粒和培养基大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)和Holdemanella biformis。数据表示为±SEM。统计分析是使用Mann-Whitney执行测试。* * * p < 0.05, p < 0.01,从EcN组明显不同。

    C18-3OH进入上皮细胞结合并激活PPARγ

    为了研究C18-3OH结肠炎下降的机制,我们研究这个分子是否能够穿过肠上皮屏障(IEB)。在第一组实验中,融合性的人类肠道上皮细胞(caco2)分化Transwell钱伯斯被C18-3OH在顶端端在不同浓度(0µM 1µM 10µM和100µM) (在线补充方法)。C18-3OH浓度显著增加细胞治疗后24小时10µM或100µM C18-3OH (图4一)。进一步的动力学实验表明,C18-3OH是最佳的积累在6小时(图4 b)。所有的实验条件测试,C18-3OH从未恢复在基底外侧间室(图4 a, B)。在协议,治疗C18-3OH没有修改paracellular caco2细胞单层(的渗透性在线补充图11)。这些发现表明,C18-3OH进入肠道细胞,但似乎并不能够穿过肠道屏障。在第二组实验中,我们评估了通过C18-3OH通过肠道上皮细胞使用我们室腔的腔室和浆膜腔室在哪里划定由结肠活检回肠或集合淋巴结补丁体外(在线补充方法)。一小时后添加C18-3OH(1µM和100µM)腔的腔室,其浓度增加结肠组织(图4 c)、回肠或集合淋巴结补丁组织(在线补充图11 b, C),但仍处在低水平浆膜腔室(图4 c,在线补充图11 b, C)。paracellular渗透率不修改C18-3OH(1µM和100µM)治疗的组织样本(在线补充图11 d)。最后,通过C18-3OH体内评估(在线补充方法)。小鼠口服接种100µM C18-3OH每天7天。血液、结肠、回肠和集合淋巴结补丁被收集量化C18-3OH质/ 30分钟女士,2小时,4小时后最后填喂法。C18-3OH浓度只是增加结肠组织2小时后过去填喂法(图4 d)。没有观察到C18-3OH浓度的变化在所有其他器官的任何时间点(图4 d,在线补充图12)。因此,作为评估体外,体外和体内,C18-3OH IEB不交叉。

    C18-3OH does not cross the epithelial barrier and penetrates the epithelial cells. Caco2 cells were cultivated into Transwell chambers. After 24 hours treatment with C18-3OH (0 µM white bar, 1 µM light grey bar, 10 µM dark grey bar or 100 µM black bar) at the apical side (A) or 0.5, 2, 6, 12 and 24 hours after C18-3OH treatment (100 µM, (B), C18-3OH was quantified inside the cells and at both the apical and basolateral compartments by LC-MS/MS. n=5 experiments of three wells per condition. (C) One hour after treatment with C18-3OH (0 µM white bar, 1 µM grey bar or 100 µM black bar) at the luminal side of a colonic biopsy mounted in Ussing chamber, C18-3OH was quantified in the luminal and serosal compartment and in the tissue. n=12–15 experiments. (D) Mice were orally treated with C18-3OH (0 µM white bar or 100 µM black bar) every day during 7 days and C18-3OH was quantified 30 min, 2 hours and 4 hours after the last gavage in the colonic tissue. Data are represented as mean±SEM. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis and subsequent Dunn’s post hoc test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, significantly different from 0 µM of C18-3OH condition.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    C18-3OH不穿过上皮屏障,穿透上皮细胞。Caco2细胞被培养成Transwell室。24小时后治疗C18-3OH(0µM白色酒吧,1µM浅灰色酒吧,100µMµM深灰色酒吧或者黑条)在顶端端(A)或0.5,2、6、12、24小时C18-3OH治疗后(100µM, (B), C18-3OH量化内部细胞和基底在顶端和间质/ MS。n = 5实验三个井/条件。C18-3OH (C)在治疗后1小时(0µM白色酒吧,100µMµM灰色酒吧或者黑条)在结肠活检的细胞腔的一侧安装在我们室,C18-3OH在腔的量化和浆膜腔室和组织。n = 12 - 15实验。(D)小鼠口服治疗C18-3OH(0µM白色栏或100µM黑栏)和C18-3OH量化7天期间每天30分钟,最后2小时,4小时后在结肠组织填喂法。数据被表示为±SEM。统计分析了利用克鲁斯卡尔-沃利斯和随后的邓恩的事后测试。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001,从0µM C18-3OH条件明显不同。

    C18-3OH进入上皮细胞,我们假设,它可能与细胞内受体如PPARγ交互。研究C18-3OH PPARγ结合的能力,我们进行了竞争力TR-FRET配体结合试验。C18-3OH直接绑定到净化人类PPARγ小黑裙的IC50 1.11µM,这是弱于罗格列酮作为积极的控制(IC50 = 0.22µM) (图5一个)。C18-3OH(10µM)显著降低TR-FRET比率,以及两个已知PPARγ受体激动剂罗格列酮(10µM)和GW1929(1µM) (图5 b)。相比之下,C14-3OH(10µM)和C16-3OH(10µM)无法绑定到PPARγ(图5 b)。这些发现表明,C18-3OH能够专门PPARγ绑定。然后,我们调查是否绑定的PPARγC18-3OH监管已知PPARγ目标基因的表达。老鼠强饲法由C18-3OH的表达增加Lfabp和Fiaf基因,减少的处于受控并没有影响Cd36(图5 c)。此外,由特定PPARγ拮抗剂治疗的老鼠,GW9662,废除C18-3OH对基因表达的影响(图5 c)。总之,我们的研究结果表明C18-3OH PPARγ激活配体,并强烈建议激活PPARγ有关键作用的抗炎效果C18-3OH。

    C18-3OH and peroxisome proliferator-activated receptor gamma interactions. (A) The binding affinity of 0.001, 0.01, 0.1, 1 and 10 µM of C18-3OH or rosiglitazone for peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) was determined by the competitive binding assay. Data are expressed as mean±SEM. n=5 independent experiments. (B) The binding affinity of C14-3OH (10 µM), C16-3OH (10 µM), C18-3OH (10 µM), rosiglitazone (10 µM), GW1929 (1 µM) or their vehicle (dimethyl sulfoxide (DMSO) 2%) was determined by the competitive binding assay. Data are expressed as mean±SEM. n=3–5 independent experiments. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis and subsequent Dunn’s post hoc test. **p<0.01, ***p<0.001, significantly different from vehicle. (C) mRNA of Lfabp, Cxcl1 and Fiaf were quantified in colon of mice gavaged during 7 days with C18-3OH (100 µM/ 100 µL; black and grey bars) or its vehicle (control, white bars) and treated by intraperitoneal injection of GW9662 (1 mg/kg, grey bar) or its vehicle (black bar) by quantitative real-time PCR. mRNA content was normalised to hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) mRNA and quantified relative to the control group. Data are expressed as mean±SEM. Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis and subsequent Dunn’s post hoc test. **p<0.01, significantly different from control group and ## p<0.01, significantly different from C18-3OH group.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    C18-3OH和过氧物酶体proliferator-activated受体γ交互。(A)的亲和力,0.001,0.01,0.1,1和10µM C18-3OH或罗格列酮过氧物酶体扩散者激活受体γ(PPARγ)是由竞争结合试验。数据表示为±SEM。n = 5个独立的实验。(B)的亲和力C14-3OH(10µM), C16-3OH(10µM), C18-3OH(10µM),罗格列酮(10µM), GW1929(1µM)或他们的车辆(二甲亚砜(DMSO) 2%)是由竞争结合试验。数据表示为±SEM。n = 3 - 5个独立的实验。统计分析了利用克鲁斯卡尔-沃利斯和随后的邓恩的事后测试。* * * * * p < 0.01, p < 0.001,显著不同。(C)的mRNALfabp,处于受控和Fiaf量化在结肠的老鼠强饲法与C18-3OH在7天(100µM / 100µL;黑色和灰色的酒吧)或其车辆(控制、白酒吧)和治疗GW9662腹腔注射(1毫克/公斤,灰条)或其车辆实时定量PCR(黑条)。信使rna含量超标是正常化hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase(产生HPRT) mRNA和量化相对于对照组。数据表示为±SEM。统计分析了利用克鲁斯卡尔-沃利斯和随后的邓恩的事后测试。* * p < 0.01,明显不同于对照组,# #从C18-3OH组p < 0.01,明显不同。

    讨论

    EcN的管理与标准治疗溃疡性结肠炎(UC)患者没有增加缓解诱导率,而这个益生菌治疗mesalazine维持缓解期也有相似的效果。22自2011年以来,EcN的使用建议缓解人类UC的维护。23EcN的抗炎机制主要是与干扰的能力不同的细胞通路NF-κB或调节MAPKs的活动。24日25日在这项研究中,我们表明,C18-3OH的生产大肠杆菌在EcN与致病性增强,无症状和同桌的吗大肠杆菌,使其成为潜在的抗炎效应组件。为了研究C18-3OH的潜在的抗炎效果,我们在DSS-induced结肠炎C18-3OH预处理的效果评估,建立了脂质减少结肠炎。为了评估如果EcN心怀战岛,这可能涉及C18-3OH的生产,我们量化EcN肽酶编码的删除clbP(EcNΔclbP)或突变肽酶的催化部位(EcN clbP-S95R)和EcN无法生产enterobactin salmochelin, yersiniabactin colibactin (EcNΔclbAΔentD)。这些不同的突变损害EcN益生菌的活动26并没有改变生产C18-3OH与野生型相比,细菌即伊斯兰公正福利党岛并不涉及C18-3OH合成。在大肠杆菌,生成LCFA合成酶、脱水酶和还原酶,并纳入细胞膜27或分泌在中在我们的研究中所示。的分泌机制涉及LCFA-3OH仍然需要研究。

    类似于益生菌的方法,使用安全系数作为生命起源以前的曾被证明有抗炎作用在结肠炎的啮齿动物模型,28 - 30和改善肠道屏障功能。28日31日这些效应相关的微生物群落的变化和微生物代谢产物引起的安全系数。20日31日在这些细菌代谢产物中,我们评估了饮食对C18-3OH生产安全系数的影响。我们表明,口服安全系数在DSS减少诱发小鼠结肠炎与改善肠道通透性有关。此外,它是伴随着增加结肠C18-3OH生产组织和微生物分类的变化。特别是,我们展示了大量的增加Akkermansia,Holdemanella,Allobaculum和Parabacteroides属DSS小鼠盲肠的安全系数。在先前的研究中,我们表明,安全系数喂养专门增加了大量的三个属(即Akkermansia,Allobaculum和Parabacteroides),减少炎症和强化了肠道屏障功能食源性肥胖和糖尿病。32在当前的研究中,大量的Holdemanella,Allobaculum和Parabacteroides生产C18-3OH呈正相关,在结肠。在这三个属,Holdemanella是最丰富的,h . biformis以前并被错误地归类为真细菌biforme,33是唯一的应变本属中描述。这种细菌,存在于人类的粪便,34 35含有高浓度的脂肪酸与18个碳与他们更紧密的系统相比邻国的家庭Erysipelotrichaceae。33有趣的是,h . biformis能够在大量生产C18-3OH EcN,暗示h . biformis关于C18-3OH-mediated抗炎活动可能更有效。

    然后我们调查,参与C18-3OH的抗炎作用机制。许多临床前炎症小鼠模型包括DSS-induced结肠炎报道,炎症参数(例如,处于受控和Reg3γ)治疗后减少LCFA 18个碳以及PPARγ体内受体激动剂。36-38作为C18-3OH进入上皮细胞,我们提出,与PPARγ交互,这是一种细胞内受体强烈表达了在结肠39这可能结合羟化LCFA 18个碳。40与我们的假设一致,C18-3OH治疗和饮食安全系数在结肠炎(图2和图3和在线补充图5,7)的浓度降低的特点发布由细胞色素epoxygenases花生四烯酸的代谢41在脂肪细胞减少overexpressing PPARγ或治疗后肝细胞的主要文化PPARγ受体激动剂。使此外,丰富的显著增加埃希氏杆菌属在炎症条件并不是出现在安全系数/ DSS集团(图3 c和在线补充图9如图所示)在最近的一项研究表明,增加肠道微生物群调节PPARγ活动减少肠杆菌科46(如致病性大肠杆菌)结肠炎。TR-FRET实验表明,C18-3OH PPARγ配体。强饲法天真的小鼠C18-3OH戒律的后果的药理和生理激活PPARγ上皮细胞或结肠组织报道。37 38 47然而,是否激活PPARγ肠道上皮细胞的信号驱动机制有待进一步的研究。

    C18-3OH管理可能是一个治疗IBD患者肠道炎症缓解期期间的控制,如与其他PPARγ受体激动剂如5-aminosalicylic酸(5-ASA)。22 48 49此外,C18-3OH不穿过肠上皮屏障导致局部抗炎效应,因此,不应该导致系统性不良反应报道通过与5-ASA IBD患者,如头痛、皮疹或支气管炎。50使用益生菌与药物相比的优势是,它可以通过不同的机制发挥其抗炎效果,因此如果一个抗炎通路不是功能,由于组织损伤,例如,他们仍然可以影响结肠炎。此外,益生菌与副作用小于药物用于治疗炎症。虽然EcN UC患者的使用被描述,的治疗效果h . biformis从来没有研究在临床前或临床研究治疗结肠炎症。我们的研究首次表明,这一毒株可能已经在炎症性肠病治疗效果。有趣的是,这两个h . biformisPPARγ,最近报道anti-tumourigenic效应在结肠,因此暗示也许C18-3OH可以有一个更广泛的益生菌的作用和在结直肠癌治疗起到有益的作用。51最近,一个试点试验表明,该协会”丛书的生命起源以前的混合益生菌双歧杆菌longum导致外观的改善UC患者的慢性炎症的活跃。52 53同样的方法使用EcN和/或安全系数耦合h . biformis可能是一个有趣的治疗方法在IBD相关的抗炎作用在我们的研究中发现的。

    一起我们的研究结果,强调了LCFA-3OH的含义在宿主肠道微生物群的影响。LCFA-3OH的释放,而不是仅仅C18-3OH的细菌,可以参与细菌和宿主之间的对话,并可能代表一个新的有益的耀斑和维持缓解期治疗IBD患者。

    数据可用性声明

    所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。

    伦理语句

    伦理批准

    所有程序依法进行指导的护理和使用实验动物的欧洲委员会和动物保健和伦理委员会批准US006 / CREFE (ceea - 122;申请号APAFIS # 7762 - ce2016112509278235v2)。

    确认

    我们感激地承认动物保健设施、Genetoul anexplo, US006 / INSERM,图卢兹的图卢兹INSERM Metatoul-Lipidomique核心Facility-MetaboHub anr - 11号- 010,lipidomic分析进行,和EquipEx平台Aninfimip(设备d 'Excellence)支持的法国政府通过未来的投资计划(anr - 11 - eqpx - 0003)。

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    脚注

    • 摩根大通和CP是共同第一作者。

    • 推特@MicrObesity

    • 贡献者JLFP和CP设计并进行实验,进行数据采集、分析和解释,并写了手稿。PLF设计并进行实验,进行数据采集、分析和解释和起草的手稿。VE、全科医生、SM TP-B MVH, FB和CB进行实验,进行数据采集、分析。SC和FVI进行了实验和起草的手稿。JB-M EO导致数据分析和解释版的手稿。GD参与写作手稿。PDC设计实验,进行解释的数据,帮助文稿起草和监督微生物群研究。执行数控设计并进行实验,分析和解释数据,写的手稿和指导项目。

    • 资金数控是一个收件人的格兰特ANR (ANR - 18 - ce14 - 0039 - 01)。PDC是一个高级研究员FRS-FNRS(昏聩de la任职)和赠款接受者从FNRS (welbio - cr - 2019 c - 02 r,科学的卓越:EOS 30770923)和基金Baillet拉图(批准用于医学研究2015)。CK是收件人的格兰特ANR (ANR ENDIABAC——18 - ce14 - 0007 - 01)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人和公众参与病人和/或公众没有参与设计,或行为,或报告,或传播本研究计划。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。