前沿:统计激活IL-19, IL-20和mda-7 IL-20受体复合物的两种类型¹

最近,一个家庭的其他细胞因子il - 10的同源有限描述(1)。第一个il - 10同族体被称为黑色素瘤differentiation-associated基因7 (mda-7)³因为它的表达上调在黑素瘤细胞系的体外分化(2)。虽然这种蛋白质氨基酸身份与il - 10显示22%,这不是最初被认为是一种分泌蛋白,及其生物活性仍然知之甚少。鼠标直接同源mda-7被确认最近的th2特异性细胞因子,称为FISP IL-4-induced分泌蛋白(3)。鼠同行,称为mob5,建议扮演一个角色在ras oncogene-mediated肿瘤(4)。

的IL10和MDA71号染色体q31-32基因已经被映射,在一个地区两个附加IL-10-related基因,IL19和IL20,也。IL-19是知之甚少,除了这个LPS-activated单核细胞表达的基因(5)。IL-20的生物活性研究了利用转基因小鼠overexpressing这细胞因子。这些老鼠的特点是新生儿杀伤力皮肤异常,包括异常的表皮分化人类(让人想起牛皮癣病变6)。IL-20R复杂被形容为两个孤儿的异质二聚体二类细胞因子受体亚基:促肾上腺皮质激素的释放因子(CRF) 2 - 8,提出更名为IL-20Rα,DIRS1,指定IL-20Rβ(6)。

除了染色体1 q31-32集群,另外两个IL-10-related细胞因子,AK155和il - 22生成时,位于人类染色体12最喜欢,IFN-γ附近的基因。已知AK155上调疱疹saimiri感染的T淋巴细胞,但其活动和受体仍然是未知的(7)。il - 22生成最初被描述为一个IL-9-inducible基因,称为IL-TIF IL-10-related T细胞衍生诱导因子(8)。il - 22生成活动包括诱导的急性期反应肝细胞并通过heterodimeric受体介导CRF2-9 / IL-22R亚基组成的β-chain IL-10R (9,10,11)。除了细胞受体,分泌il - 22生成绑定到一个二类细胞因子受体家族的成员,被称为IL-22BP,似乎作为自然il - 22生成拮抗剂(12,13)。

HT-29肠上皮细胞生长在IMDM中补充10% FCS, 0.55毫米l精氨酸,0.24毫米l天冬酰胺和1.25毫米l谷氨酰胺。人类胚胎肾(HEK) 293 - ebv核Ag)细胞在DMEM培养基补充FCS为10%。il - 10同系物是由2000 Lipofectamine HEK293-EBNA细胞中瞬时表达方法(生命技术、绅士、比利时)。mda-7的编码序列,IL-19, il - 22生成放大由核糖核酸rt - pcr的T细胞刺激抗CD3 Ab。IL-20编码序列从皮肤RNA放大。这些cdna克隆到pCEP4质粒(表达载体,格罗宁根、荷兰)巨细胞病毒启动子的控制下。mda-7-Flag、IL-19-flag IL-20-flag和IL-22-flag pCEP4-cytokine构造产生的变异终止密码子,引入序列编码c端国旗:Gly-Gly-Gly-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。像之前描述的那样IL-22BP-Ig融合互补脱氧核糖核酸是(12)。免疫印迹分析,10μl HEK293上层清液混合Laemmli样品缓冲和煮5分钟后sds - page和转移到聚乙二烯二氟化物膜(Amersham,阿灵顿高地,IL)。膜与生物素化的探索anti-flag Ab(25μg /毫升)和streptavidin-HRP (1/5000;Amersham)。发射极耦合逻辑检测设备(Amersham)被用于化学发光的表情。化学发光信号检测和量化的柯达(罗彻斯特,纽约)数字科学形象站440 cf。Anti-phospho-STAT3西方的屁股如前所述执行(8)。

DIRS1 / IL-20RβcDNA放大了rt - pcr和K562白血病细胞克隆成pCEP4质粒。HepG2的IL-22R cDNA放大了rt - pcr肝癌细胞株在克隆pEF-BOSpuro之前表达载体(14)。CRF2-8 / IL-20RαcDNA放大了PCR从人类胎盘cDNA文库(Clontech实验室,帕洛阿尔托,CA)和克隆到pCDEF3质粒。Anti-IL-10Rβ和anti-flag Abs买来Peprotech(英国伦敦)和从σ(Bornem、比利时),分别。生产anti-hIL-22R Abs,转染P815细胞肥大细胞瘤的hIL-22R cDNA pEF-BOS注入DBA / 2小鼠前质粒。拒绝后肿瘤,这些小鼠的血清高滴度的中和anti-hIL-22R Abs和1/500稀释使用。

细胞因子的反应评估通过测量荧光素酶生产通过细胞转染pGRR5构造,(p . Brennan博士提供的帝国癌症研究基金,伦敦,英国)。这个结构包含五份STAT-binding FcγRI基因插入的上游TK启动子荧光素酶基因控制的。转染HT29和HEK293细胞进行如下。

HT-29细胞electroporated (10⁷细胞400μl, 250 V, 192Ω,1200μF) 15μg pGRR5 15μg每个受体cDNA,单独或合并使用。转染细胞被播种在96 -孔板,孵化5 h在37°C,然后preincubated与否,1 h和anti-IL-22R抗血清(1/500)或anti-IL-10RβAbs(6μg /毫升)。接下来,这些细胞被刺激与每个细胞因子2 h。荧光素酶活性与Luclite +分析系统测量工具(Canberra-Packard梅里登,CT)最高计数微型板块闪烁计数器(Canberra-Packard)。

HEK293-EBNA细胞被播种在24-well板块(Nunc、鲁开德、丹麦)24 h。转染由使用Lipofectamine方法(生命技术、绅士、比利时),500 ng的质粒编码IL-22R IL-20Rβ或IL-20RαpGRR5 100 ng。作为内部控制中,我们使用100 ng pRL-TK向量(Promega,麦迪逊,WI)包含Renilla荧光素酶基因TK启动子的控制下。20 h后,转染细胞与细胞因子刺激,和2 h后,细胞颗粒状,细胞溶解。荧光素酶活性与Dual-Luciferase记者分析系统监控工具(Promega)。

具体IL-22BP和cytokine-flag融合蛋白之间的相互作用进行了评估直接或间接ELISA,如下。Reacti-Bind顺丁烯二酸酐活性聚苯乙烯板(皮尔斯,罗克福德,IL)涂在一夜之间在4°C 12.5μg /毫升anti-flag Ab在PBS。盘子被孵化2 h在37°C 50μl cytokine-flag融合蛋白(HEK293上层清液)。总共10%的上层清液IL-22BP-Ig添加2 h,并绑定IL-22BP-Ig发现通过使用anti-mouse IgG3多克隆Abs与过氧化物酶(生物技术协会南部、伯明翰、AL)。前面描述的酶活性测定(12)。间接测定,我们测试了il - 10的抑制效果同系物的绑定IL-22BP il - 22生成。为此,IL-22BP-Ig(10%)和il - 10 preincubated同系物2 h在孵化Reacti-Bind板块(皮尔斯),涂上rIL-22如前所述(12)。

的il - 10同系物和受体之间的相互作用属于二类细胞因子受体家族,我们表示mda-7 IL-19, IL-20和il - 22生成融合蛋白c端国旗序列的瞬时转染HEK293细胞。蛋白质生产检查通过免疫印迹的Ab特定标志肽(图。1一个)。HEK293细胞分泌mda-7 IL-19, il - 22生成蛋白质的异构MW 23-30 kDa,最有可能产生的糖基化。IL-20-flag蛋白分泌是一个乐队的大小∼18 kDa,表明该细胞因子不是糖化。化学发光信号的量化表示,IL-19和il - 22生成生产在一个相似的水平,而IL-20和mda-7少了7倍。

这些HEK293浮层被用来评估与二类细胞因子受体。第一组实验进行HT-29细胞,从内部表达IL-22R IL-10Rβ。统计激活诱导il - 22生成与pGRR5监测荧光素酶(记者9)。如无花果所示。1,B(左上角),这些细胞未能应对其他il - 10同系物。当HT-29细胞转染IL-20RβcDNA, mda-7和IL-20诱导荧光素酶生产。有趣的是,这种效果是完全被一个anti-IL-22R抗血清,表明mda-7 IL-20可以激活统计因素通过一个新的IL-20R复杂的由IL-22R和IL-20Rβ(无花果。1B,左下)。

当细胞转染IL-20Rα和IL-20Rβ互补,他们成了响应mda-7, IL-20 IL-19,荧光素酶生产被anti-IL-22R Abs(图不再受影响。1,B,右下角),这表明这个活动是独立于这个链。最后,在转染IL-20RαcDNA,我们未能发现任何响应mda-7, IL-19, IL-20(无花果。1B,右上方),确认IL-20Rβ需要这个过程。

进一步描述不同类型的受体复合物,我们使用HEK293细胞表达内源性IL-10Rβ但不是IL-22R。Untransfected HEK293细胞没有回应任何il - 10同族体(数据没有显示)。IL-22R cDNA转染时,只有il - 22生成诱导荧光素酶生产和STAT-3磷酸化(无花果。2,一个)。细胞转染和IL-22R IL-20Rβ不仅回应了il - 22生成而且IL-20和mda-7(无花果。2,B),而独自IL-20Rβ没有授予任何细胞因子反应(数据没有显示)。转染IL-20Rα和IL-20Rβ互补允许统计激活mda-7, IL-19, IL-20,但不是il - 22生成(无花果。2,C)。没有反应是观察到的细胞转染IL-20RαcDNA(数据未显示)。在所有情况下,荧光素酶诱导与磷酸化STAT-3,分析了西方墨点法(无花果。2)。类似的结果HEK293上层清液包含野生型细胞因子。

观察到两个不同的受体复合物允许响应IL-20 mda-7提出了这样的可能性,每个复杂会优先响应一个细胞因子。为了验证这个假设,我们分析了HT-29的反应细胞,转染或单独使用IL-20RβIL-20Rα和IL-20Rβmda-7不同稀释,IL-19, IL-20上层清液。IL-20Rα和IL-20Rβ转染时,mda-7和IL-20稀释显示类似的剂量反应曲线,表明细胞因子(图类似的敏感性。3,底)。IL-19的活动,但不是那些mda-7 IL-20,可以检测到0.1%的上层清液,与更高浓度的协议IL-19上层清液。只有IL-20Rβ转染时,HT-29细胞表现出更好的应对mda-7 nonsaturating稀释上层清液(1%和0.1%),表明这种类型的复杂更敏感mda-7(无花果。3前)。类似的结果在HEK293细胞中(数据没有显示)。

发现IL-22R可以将不仅与IL-10Rβ如前所述,还有IL-20Rβ提出的复杂与IL-22R IL-20Rβ可能调解il - 22生成反应。因为IL-10Rβ广泛表达,我们不能解决这个问题通过直接转染,但IL-10Rβ的作用是评估anti-IL-10RβAb。如图所示。4Ab,这可能会阻止il - 22生成活动在控制HT-29细胞和细胞转染IL-20RβcDNA,表明IL-20Rβ不能代替IL-10Rβ当后者链是il - 22生成时无法访问。相同的Ab并不影响mda-7或IL-20在同一细胞的活动(数据没有显示)。

IL-22BP已经绑定显示il - 22生成(12,13),但没有什么是已知的有关其绑定其他il - 10同系物的能力。这个可溶性受体展品同等程度的同源性的细胞外域IL-22R IL-20Rα促使我们测试假设IL-22BP还可以绑定IL-20。在第一组实验中,我们测试了il - 10同系物的能力竞争的绑定IL-22BP insolubilized il - 22生成。微量滴定板被涂上一层rIL-22和孵化IL-22BP-Ig融合蛋白的存在il - 10同系物。发现il - 22生成之间的交互和IL-22BP anti-Ig Ab。如图所示。5,一个,只有il - 22生成上层清液能够阻止IL-22BP绑定。直接测定il - 10同源染色体之间的交互和IL-22BP,我们涂微量滴定板anti-flag Ab在孵化flag-tagged il - 10同系物。IL-22BP-Ig添加和交互检查anti-Ig Ab。如图所示。5B,只有il - 22生成绑定IL-22BP-Ig,和任何其他il - 10同族体显示相同的活动。

分享受体亚基是一个著名的特征在类细胞因子受体,并允许定义亚科基于子单元的参与,如βc gp130, IL-2Rγ。在二类细胞因子受体,到目前为止唯一一个共享的受体的例子是IL-10Rβ链,参与il - 10、il - 22生成信号(9,10,11)。在本文中,我们表明,IL-22R和DIRS1 / IL-20Rβ也由不同的受体复合物共享。与IL-20RαIL-20Rβ亚基可以关联,导致功能IL-19受体,IL-20, mda-7(我IL-20R复杂类型)。IL-20Rβ也可以联想到IL-22R亚基,导致功能受体IL-20 mda-7,但不是IL-19 (II型IL-20R复杂),图的示意图表示。6。额外的实验需要确定哪些链作为一个实际的配体绑定组件或Jak-recruiting亚基。另外,这些受体亚基可以表示为preassociated复合物表面的细胞。

IL-20-transgenic老鼠显示新生儿杀伤力和皮肤异常,包括增厚表皮增生和表达的标记(6)。我们的观察表明,IL-19 mda-7可以有类似的活动。有趣的是,IL-19行为只在I型IL-20R因此应该概括只有部分IL-20活动。相比之下,IL-20关于两种复合物和mda-7似乎有类似的表现。明显,表达鼠直接同源mda-7似乎上调在伤口愈合过程中,这一过程肯定是角化细胞增殖(15)。

尽管mda-7最初几年前确认(2),它的活动和行动模式仍然知之甚少。据说这种蛋白质表达的细胞,并显示在某些肿瘤细胞系诱导细胞凋亡的一个未知的机制(16,17)。在转染mda-7 cDNA在HEK293细胞中,我们发现大部分的蛋白质在上层清液,表明它可以分泌,至少在这个细胞类型。分泌的老鼠和鼠标直接同源mda-7在不同细胞类型也有报道(3,4)。连同我们的观察外源性mda-7 IL-20R复合物结合,这些数据支持了假设mda-7作为旁分泌和自分泌因子。然而,它仍然可能mda-7表达作为细胞质蛋白,诱导细胞生长抑制和凋亡,或分泌蛋白通过IL-20R复合物作用于各种细胞类型。