文摘gydF4y2Ba
Lipoarabinomannans (LAM)和lipomannans (LM)分枝杆菌细胞壁的一部分被细胞参与先天免疫反应和调节细胞因子的反应被发现。通常,mannosylated林从致病性分枝杆菌抗炎,已报告而不致病的物种的phosphoinositol-substituted LAM促炎的分子。在这项研究中,我们表明,LM从几个分枝杆菌物种,包括gydF4y2Ba分枝杆菌chelonaegydF4y2Ba,gydF4y2Ba分枝杆菌kansasiigydF4y2Ba,gydF4y2Ba牛结核分枝杆菌gydF4y2Ba卡介苗,显示一个双功能通过刺激或抑制促炎细胞因子合成通过不同途径在小鼠巨噬细胞。LM,但没有相应的LAM诱导巨噬细胞激活的特点是细胞表面表达CD40和CD86和TNF分泌。这个激活依赖toll样受体的存在(TLR) 2,通过适配器蛋白介导的骨髓分化因子88 (MyD88),但独立的TLR4或TLR6认可。令人惊讶的是,LM施加强有力的抑制作用在肿瘤坏死因子,通过LPS-activated巨噬细胞IL-12p40,没有生产。这TLR2、TLR6, MyD88-independent抑制作用也由林gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba卡介苗但不是林来自gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba和gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba。本研究提供的证据表明,分枝杆菌LM熊结构图案容易与不同的交互模式识别受体与赞成或抗炎作用。因此,主持人的最终响应可能会因此取决于现行LM或林分枝杆菌信封和本地宿主细胞受体的可用性。gydF4y2Ba
免疫gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba是一个复杂的过程,需要巨噬细胞和T细胞介导免疫反应(参了。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。解决幸存的病原体的感染通常涉及到封存在巨噬细胞内的复杂和动态结构肉芽肿。基因小鼠的使用和研究使用Ab中和帮助识别许多介质的控制至关重要gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染,包括IFN-γ,il - 12、IL-23 TNF,淋巴毒素α,淋巴毒素β,和没有(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。这些介质也很重要的几个控制延迟期间感染,肿瘤坏死因子的中和或诱导没有合酶抑制导致感染的耀斑(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。我们建议一个连续,阴燃的激活吞噬细胞需要保持一个活跃的免疫压力和分枝杆菌lipoglycans,如lipomannan (LM)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和lipoarabinomannan (LAM),可能导致巨噬细胞和树突状细胞激活的规定通过modulin对炎症反应的影响。gydF4y2Ba
分枝杆菌的初始识别组件由先天免疫系统可能包括几种不同的模式识别受体(PRR)包括toll样受体(TLR),其中每个有助于宿主抵抗和损失的其中一个可能在对主机(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。一些报告已经描述了一个由分枝杆菌细胞壁lipoglycans TLR2-dependent细胞激活(phosphoinositol-capped LAM (PILAM),磷脂gydF4y2BamyogydF4y2Ba肌醇甘露糖苷(PIM)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,PIMgydF4y2Ba6gydF4y2Ba)或19-kDa分枝杆菌脂蛋白(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)和直接抗活动(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),这表明TLR2和分枝杆菌至关重要的是参与先天反应。TLR4还可以调解细胞激活可溶性细胞相关分枝杆菌因素有别于分枝杆菌细胞壁LAM (gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba全身的肿瘤坏死因子生产通过小鼠巨噬细胞被TLR4拮抗剂(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。老鼠缺乏TLR4或TLR2在其长期的控制缺陷gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。此外,其他PRR如甘露糖受体,人类肺表面活性物质蛋白或树突特异性细胞粘附分子3 (DC-SIGN)与绑定和/或关键分子参与抗炎转导信号mannose-capped LAM (ManLAM)在树突细胞(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
林是lipoglycans无所不在地发现分枝杆菌的信封。他们是由碳水化合物制成的支柱gydF4y2BadgydF4y2Ba甘露聚糖核心和一个gydF4y2BadgydF4y2Ba-arabinan域,mannosyl-phosphatidylinositol (MPI)锚在减少甘露聚糖的核心和限制主题(见图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba;参考文献。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba和gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。arabinan域名是限制通过mannosyl (ManLAM)或磷酸肌醇残留(PILAM)。ManLAM一直在增长缓慢的分枝杆菌,包括gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),gydF4y2Ba牛结核分枝杆菌gydF4y2Ba卡介苗(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),gydF4y2Ba鸟型分支杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),gydF4y2Ba分枝杆菌kansasiigydF4y2Ba(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),而PILAM已确定在快速发展和无毒的物种,如gydF4y2Ba分枝杆菌smegmatisgydF4y2Ba(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。无上限AraLAM分子的新家庭,最近没有甘露糖和phosphoinositol帽,被描述的识别和结构测定林gydF4y2Ba分枝杆菌chelonaegydF4y2Ba(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。LAM是异构的大小,根据结构特点如arabinosyl的数量或mannosyl单位组成homopolysaccharides、或MPI锚的结构和限制主题(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
有一种新兴共识,PILAM促炎的分子刺激生产TNF和il - 12,而ManLAM抗炎分子抑制il - 12的生产和TNF和il - 10的生产增加树突细胞或单核细胞的细胞系(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。PILAM TLR-2-dependent方式激活巨噬细胞通过激活NF-κB信号通路(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),而ManLAM的抗炎效应归因于他们绑定到甘露糖受体(gydF4y2Ba19gydF4y2BaDC-SIGN)或(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。这种模式提供了一个有趣的林结构之间的相关性及其免疫调节作用。gydF4y2Ba
然而,相对是知之甚少的监管作用分枝杆菌细胞wall-derived LM在巨噬细胞激活。由于LM LAM和代表丰富的细胞壁的生物合成的前体分子,描述他们的赞成和/或抗炎性质以及所涉及的途径传达他们的信号可能提供新的见解致病性分枝杆菌在原发感染的免疫调节信号还在“稳态”潜伏性感染。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们调查了监管LM在巨噬细胞的先天免疫反应的性质。我们比较了pro - LM和抗炎活动和林各分枝杆菌物种:gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba作为一个无上限的LAM的原型,gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba作为一个新兴分支杆菌的临床相关性与特定lipoglycan结构特点最近瓦解,以及gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司和gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba作为典型的ManLAM-containing物种。使用初级巨噬细胞来源于TLR MyD88-deficent老鼠,我们将演示一个双重LM潜力来自不同分枝杆菌起源、深刻的促炎和抗炎作用。LM TNF和il - 12的刺激效果生产由TLR2和MyD88,而他们的抑制作用在LPS-induced TNF生产TLR MyD88独立和可能通过其他PRRs介导的。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
净化的LM和林gydF4y2Ba
Lipoglycans从gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba和gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba被后来的洗涤剂和苯酚纯化拔牙导致获得的蛋白质、脂质、核酸无酸的物质,如前所述(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。三羟甲基氨基甲烷脱氧胆酸盐缓冲液后再悬浮(10毫米Tris-HCl (pH值8.0),10毫米EDTA, 0.2 M氯化钠,和0.25%脱氧胆酸盐),林和LM被凝胶过滤分离和广泛透析Sephacryl 200列。制剂的纯度是评估通过气相色谱/质谱和sds - page分析。LM的内毒素含量和林准备< 20 pg有限合伙人/ 10μg,显色来衡量gydF4y2Ba鲎gydF4y2Ba溶菌产物分析。LM和ManLAMgydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2BaBCG准备如前所述(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。LM从gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2BaH37Rv被j . Belisle请提供(科罗拉多州立大学、柯林斯堡有限公司;内毒素含量17.6 pg / 10μg)或准备如前所述(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
制备m . kansasiigydF4y2Ba总可溶性AgsgydF4y2Ba
可溶性gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2BaAgs细胞提取总额由声波降解法的分枝杆菌在PBS,紧随其后的是离心27000×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C和100000×30分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 90分钟。可溶性部分恢复,和总蛋白浓度测定用BCA蛋白测定试剂盒(Oud-Beijerland皮尔斯欧洲,荷兰)。gydF4y2Ba
老鼠gydF4y2Ba
6 - 12-wk-old老鼠缺乏TLR4和/或TLR2,通过交叉从TLR4-deficient老鼠(Akira (gydF4y2Ba37gydF4y2Ba从c . kirsch))和TLR2-deficient老鼠((gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)),TLR6-deficient老鼠(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)和MyD88-deficient老鼠(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)及其控制特定的无菌条件下的同胞被培育Transgenose研究所动物饲养设施(法国奥尔良)。gydF4y2Ba
原代巨噬细胞培养gydF4y2Ba
小鼠骨髓细胞分离股骨和培养(10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在DMEM /毫升)7天补充2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺和2×10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba我,20%马血清,30% L929 cell-conditioned介质(csf的来源,如裁判所述。gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。后再悬浮在寒冷的PBS、洗涤和reculturing 3天的新鲜培养基,细胞制备包含同质人口巨噬细胞(定期验证染色染色和CD11b表达式)。gydF4y2Ba
骨骨髓来源的巨噬细胞被镀在96 - 10微量细胞培养板的密度gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞在DMEM /补充2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺和2×10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba我和刺激100 ng / ml有限合伙人(gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,O111血清型:B4;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),0.5μg /毫升合成细菌lipopeptide PamgydF4y2Ba3gydF4y2Ba埋头gydF4y2Ba4gydF4y2Ba((S -(2,3 -二- - - - - - - (2 - (palmitoyloxy)gydF4y2BaRSgydF4y2Ba)丙基]-gydF4y2BaNgydF4y2Ba棕榈酰- (gydF4y2BaRgydF4y2Ba)半胱氨酸- (gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)-Ser-LysgydF4y2Ba4gydF4y2Ba-哦,三盐酸化物;EMC Microcollections、图宾根、德国),10μg /毫升(LTA从lipoteichoic酸gydF4y2Ba链球菌gydF4y2Basp。Lunamed、巴塞尔、瑞士)、LM、或林(在浓度表示)。巨噬细胞被激活与IFN-γ(500 U /毫升)研究白介素表达式。6日到24日,h的刺激后上层清液立即被收集和分析或储存在−20°C到进一步使用。没有使用MTT掺入刺激控制的细胞毒性。gydF4y2Ba
细胞因子ELISAgydF4y2Ba
亚硝酸盐测量gydF4y2Ba
亚硝酸盐浓度在细胞上清液测定使用格里斯反应(3%磷酸,1%gydF4y2BapgydF4y2Ba-aminobenzenesulfonamide, 1%gydF4y2BaNgydF4y2Ba——(1-napthyl) ethylenediamide)如前所述(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
流式细胞术分析gydF4y2Ba
巨噬细胞培养上nontissue culture-treated培养皿中收获了冷PBS和温柔的吸量。细胞被染色的细胞表面标记对CD11b耦合使用Abs PerCP-Cy5.5(克隆M1/70) CD40-PE或CD86-PE。Abs是用于0.2μg / 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞和从BD PharMingen (CA)圣地亚哥。染色过程进行了PBS中含0.1% BSA,叠氮化钠和0.1% 20分钟在4°C。细胞和4%多聚甲醛固定至少1 h和流式细胞术分析了使用CellQuest软件(BD Immunocytometry系统,圣何塞,CA)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
LM,但不是LAM刺激初级巨噬细胞释放肿瘤坏死因子和IL-12p40gydF4y2Ba
ManLAM是一个复杂的lipoglycan视为分枝杆菌细胞壁的主要毒力因子在免疫系统中扮演着关键角色通过其相互作用与各种细胞(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)。尽管LM被认为是一个直接的生物合成的前体LAM (gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),使用LM进行一些免疫学的研究(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba)。因此,我们探索的可能性LM孤立的从不同的物种(图。1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba分枝杆菌)modulins /毒性因素。在这项研究中,我们第一次测试noncapped LAM和LM的能力gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba(分别指定CheLAM和CheLM)和mannose-capped LAM和LMgydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba(分别指定KanLAM和KanLM)主要刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子。骨骨髓来源的巨噬细胞与不同lipoglycans刺激体外和细胞上清液对肿瘤坏死因子生产进行评估。如图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2BaKanLM和CheLM主要刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子,尽管没有发现肿瘤坏死因子刺激后各自的林。gydF4y2Ba
调查是否LM的强刺激效应林是一个普遍现象在不同分枝杆菌物种或可能被限制在一些特定的物种,我们测试了LM vs LAM的能力gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司(分别指定BCGLAM和BCGLM)和gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2BaH37Rv(分别指定H37LAM和H37LM),主要以刺激小鼠巨噬细胞。BCGLM和H37LM能够刺激巨噬细胞产生高水平的肿瘤坏死因子(图。2gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba)和IL-12p40(图2所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。相比之下,少量的TNF和il - 12 p40可以检测到细胞刺激后与各自H37LAM BCGLAM分子,与之前的研究结果相一致(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)。因此,与各自LAM, LMgydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba,gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba,gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2BaBCG,所有缺乏arabinan域和终端覆盖图案,是强有力的刺激器主要巨噬细胞的促炎细胞因子的分泌。gydF4y2Ba
LM功能激活的巨噬细胞gydF4y2Ba
我们接下来解决LM对巨噬细胞活化的影响和效应功能CD40和CD86表达和释放。流式细胞仪分析显示,BCGLM CD11b刺激非常有效gydF4y2Ba+gydF4y2Ba骨骨髓来源的巨噬细胞(> 97%的人口)激活标记CD40表达水平接近达成在感染后的细胞gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。相比之下,BCGLAM只差激活细胞群的限制分数(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。如图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba卡介苗感染诱导高costimulatory分子CD86的表达水平。刺激的细胞与BCGLM或BCGLAM还导致CD86表达,虽然一定程度上比gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba卡介苗感染。同样,CheLM和KanLM刺激巨噬细胞CD40表达,而各自LAM在本质上是不活跃(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。CD86表达略CheLM和KanLM但不是通过各自的林(数据未显示)。gydF4y2Ba
因为活性氮中间体的控制中发挥重要作用分枝杆菌感染(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba),我们下一个调查是否LM LAM可能诱发主要小鼠巨噬细胞分泌的。如图2所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaDgydF4y2Ba,BCGLM H37LM刺激强劲的生产没有,而实质上不刺激与BCGLAM或H37LAM后检测。这些结果表明,LM,主要功能激活巨噬细胞而不是各自LAM就是明证costimulatory分子CD40和CD86的表达效应分子的合成。gydF4y2Ba
LM-stimulated巨噬细胞分泌的细胞因子是TLR2和MyD88依赖,但TLR4和TLR6独立gydF4y2Ba
识别受体主要存在于巨噬细胞识别LM和细胞因子释放传递一个积极的信号,我们分析了这种反应的TLR的依赖。巨噬细胞从老鼠缺乏TLR2、TLR4或TLR2和TLR4与KanLM或CheLM刺激。与LM刺激后,没有TNF能被探测到的上层清液中巨噬细胞TLR2不足,而肿瘤坏死因子是有效地释放TLR4-deficient的上层清液中巨噬细胞(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。这些结果表明,LM通过TLR2-dependent途径诱导肿瘤坏死因子的分泌。正如所料,没有细胞因子生产的上层清液中检测巨噬细胞分离双TLR2和TLR4-deficient老鼠。TNF浓度实现了在LM刺激相对较高,与参考刺激由有限合伙人(0.1μg /毫升)或总可溶性Ags隔绝gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba细胞。后者分数可能会包含所有可溶性蛋白质的复杂混合物gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba一起,pim KanLM KanLAM,想必其他lipoglycans。图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba清楚地表明,这个分数激活巨噬细胞通过TLR2-dependent机制。我们下一个评估是否TLR6,形式与TLR2形成(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba),可能参与LM的免疫反应。巨噬细胞缺乏TLR6回应KanLM和CheLM一样有效地控制野生型细胞(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba),这表明TNF LM TLR6独立生产。最近的研究表明,适配器MyD88可能参与最通常的信号通路(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba),尽管MyD88-independent途径也被确定(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)。使用巨噬细胞缺乏MyD88,我们表明,KanLM和CheLM无法传输信号导致TNF的生产(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba)或没有(数据未显示)在缺乏MyD88,表明MyD88参与LM-induced信号通路。gydF4y2Ba
同样,TNF诱导,IL-12p40,没有被BCGLM强烈依赖于TLR2和MyD88,但独立的TLR4和TLR6(见图7gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba和数据未显示)。因此,促炎细胞因子的释放,没有通过与CheLM主要小鼠巨噬细胞刺激,KanLM,或BCGLM依赖TLR2和MyD88信号,但似乎TLR4和TLR6独立的。gydF4y2Ba
LM从gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba和gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba在巨噬细胞抑制LPS-induced IL-12p40gydF4y2Ba
ManLAM从gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2BaBCG据报道在人类树突状细胞刺激抑制IL-12p40有限合伙人(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。我们下一个解决是否LMgydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba和gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba,以及相应的LAM同行,也可以显示抑制效应对IL-12p40原发性巨噬细胞与LPS刺激后分泌。如图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,由LPS-stimulated IL-12p40巨噬细胞分泌的强烈抑制KanLM和CheLM而KanLAM和CheLAM基本上没有效果。没有细胞毒性效应的LM和林准备,单独或结合有限合伙人,巨噬细胞在文化上验证(数据没有显示)。有趣的是,巨噬细胞释放出来的IL-12p40回应刺激与已知TLR2受体激动剂等合成细菌lipopeptide PamgydF4y2Ba3gydF4y2Ba埋头gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)或英国网球协会(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba)不是由任何LM或抑制LAM测试(数据没有显示)。因此,IL-12p40由巨噬细胞分泌,以应对有限合伙人被KanLM和CheLM强有力地抑制,而各自LAM分子被发现是不活跃的。gydF4y2Ba
由LM的抑制LPS-induced IL-12p40 TLR2和TLR6独立gydF4y2Ba
我们的研究结果表明,KanLM和CheLM诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子通过TLR2信号。然后我们问LM的抑制作用是否il - 12 p40通过toll样受体激动剂LPS诱导释放是通过TLR介导结扎。KanLM和CheLM强有力地抑制释放IL-12p40 LPS诱导的TLR2-deficient巨噬细胞(图5所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。正如所料,没有分泌IL-12p40检测TLR4或TLR2和TLR4 double-deficient细胞与LPS刺激后(数据没有显示)。此外,KanLM和CheLM抑制LPS-induced IL-12p40分泌TLR6-deficient尽可能有效地在野生型巨噬细胞(图5所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。因此,抑制LPS-induced IL-12p40释放KanLM和CheLM功能TLR2和TLR6无关。gydF4y2Ba
LM从gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba和gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba抑制LPS-induced TNF分泌gydF4y2Ba
我们下一个解决LM的抑制作用是否仅限于IL-12p40是否也可以与另一个肿瘤坏死因子等促炎细胞因子。释放肿瘤坏死因子通过与LPS刺激巨噬细胞显著地抑制了KanLM CheLM,但不是由KanLAM和CheLAM(图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。值得注意的是,抑制肿瘤坏死因子明显低于观察了il - 12 p40分泌。这个相对较低的效果观察TNF vs IL-12p40分泌可能归因于这样一个事实:KanLM和CheLM也强烈TNF-inducing因素如上所示(图2所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),高水平的肿瘤坏死因子,通常比IL-12p40高10倍,在这些文化中产生。帕姆gydF4y2Ba3gydF4y2Ba埋头gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,另一个TLR2配体,不抑制LPS-induced TNF分泌(数据没有显示)。LPS-induced没有生产也部分地抑制了KanLM和KanLAM CheLM但不是CheLAM(图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。当巨噬细胞被刺激与生活gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba卡介苗或HKH37Rv,没有降低TNF水平可以发现与LM coincubation后或林(数据未显示)。因此,KanLM和CheLM,但不是各自LAM抑制LPS-induced肿瘤坏死因子的分泌也没有。gydF4y2Ba
LPS-induced肿瘤坏死因子的抑制LM独立于TLR2 TLR6, MyD88。gydF4y2Ba
使用TLR4受体激动剂LPS作为肿瘤坏死因子的刺激巨噬细胞释放,我们下一个调查是否LM在肿瘤坏死因子释放的抑制作用是通过TLR2或TLR6介导的。图6gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba表明,即使在TLR2-deficient巨噬细胞,KanLM CheLM抑制肿瘤坏死因子释放。正如所料,TNF释放在TLR4和废除TLR2和TLR4 double-deficient细胞(数据未显示)。缺乏功能性TLR6 TLR6-deficient巨噬细胞,并不影响CheLM LPS-induced抑制肿瘤坏死因子释放,尽管KanLM略的抑制活性降低(图。6gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。有限合伙人是刺激巨噬细胞通过TLR4通过至少两个独立的信号通路(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)。适配器MyD88蛋白参与最通常的信号,但有些有限合伙人响应MyD88独立(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)。因此,我们问LM的抑制作用是否LPS-induced TNF是MyD88介导的。同意发表的结果(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba),一小部分LPS-induced TNF释放被发现MyD88独立当比较从MyD88-deficient和野生型小鼠巨噬细胞(图4所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。MyD88-deficient巨噬细胞产生的TNF水平非常低,代表最多6%的水平由野生型细胞。有趣的是,MyD88-independent TNF应对有限合伙人可以完全抑制KanLM和CheLM(数据没有显示)。在一起,这些结果表明KanLM和CheLM产生双重影响肿瘤坏死因子的释放主要巨噬细胞,通过TLR2刺激效应,对肿瘤坏死因子诱导的抑制作用和一个有限合伙人,是独立的功能TLR2, TLR4 TLR6, MyD88信号通路。gydF4y2Ba
BCGLM熊都TLR2-dependent刺激和TLR-2-independent抑制促炎细胞因子分泌的图案gydF4y2Ba
自KanLAM CheLAM现在没有抑制对原发性巨噬细胞释放的细胞因子的影响,我们下一个检查ManLAM的效果gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司和gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2BaH37Rv,之前报道有抑制作用,以及相应的LM的潜在的调节细胞因子释放(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)。BCGLM强刺激的巨噬细胞肿瘤坏死因子释放,LPS诱导后相似的水平,而BCGLAM不活跃(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。这种刺激效应被发现TLR2依赖,从TLR2-deficient小鼠巨噬细胞不刺激BCGLM(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba),TLR4独立,BCGLM一样刺激TLR4-deficient巨噬细胞(数据没有显示)。相对于他们的抑制效果,BCGLAM强烈抑制肿瘤坏死因子的分泌与LPS刺激巨噬细胞后,而本质上没有相应的LM效果明显(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。我们假设的潜在抑制作用BCGLM可能掩饰了其强大的刺激效应和测试这一假说在TLR2-deficient巨噬细胞。在缺乏功能性TLR2 BCGLM没有刺激活动(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba),它的内在LPS-induced肿瘤坏死因子的抑制作用明显(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。也出现了类似的调制模式IL-12p40生产(数据没有显示)。BCGLM的刺激影响TNF和IL-12p40分泌已经可见浓度降到1μg /毫升和BCGLAM的抑制性影响TNF和IL-12p40 3μg /毫升的浓度(图8所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
H37LAM部分抑制分泌的IL-12p40 LPS-stimulated巨噬细胞而H37LM没有明显的抑制作用(数据没有显示)。BCGLM相似,缺乏H37LM的抑制作用可能归因于H37LM以来强大的刺激效应并减少巨噬细胞缺乏IL-12p40分泌功能TLR2(数据没有显示)。gydF4y2Ba
因此,BCGLM熊图案产生抑制肿瘤坏死因子和IL-12p40由巨噬细胞分泌LPS刺激后,一个TLR2的抑制作用掩盖了独立和似乎强烈TLR2-dependent免疫刺激性的效果。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
目前的数据首次证明LM显示双重调节功能,TLR2-dependent刺激和/或TLR2-independent细胞激活和抑制促炎细胞因子合成在初选小鼠巨噬细胞。LM被认为是前兆LAM和由一个gydF4y2BadgydF4y2Ba甘露聚糖碳水化合物核心骨干和MPI锚。林包含一个额外的gydF4y2BadgydF4y2Ba-arabinan并最终限制主题。根据这些限制主题,林被分为三种类型。第一,ManLAM mannosyl帽的存在,被发现gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba麻风杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司,gydF4y2Bam . aviumgydF4y2Ba,gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。第二,PILAM,特点是缺乏mannooligosaccharide帽和phosphoinositol帽的存在已经隔绝不致病的物种,gydF4y2Ba分枝杆菌gydF4y2Basp.和gydF4y2Bam . smegmatisgydF4y2Ba(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。第三,林最近隔绝gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba,快速增长的致病性分枝杆菌物种,似乎没有甘露糖和phosphoinositol帽,因此指定一个新家庭的无上限AraLAM (gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。不同的LM和林gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司,gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba,或gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba在本研究中使用和他们的主要结构特点总结了图1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba。差异问题的三个结构域,主要是脂肪酸的性质必然MPI锚,连杆的性质和取代度的mannopyranosyl侧链与甘露聚糖核心,以及缺乏描述CheLAM的甘露糖帽。gydF4y2Ba
LM检验,不管他们的分枝杆菌起源、被诱导强烈的促炎的分子被发现丰富的肿瘤坏死因子水平和腹腔巨噬细胞功能激活因素,包括CD40和CD86 costimulatory分子,以及没有分泌。的刺激效果不同的LM缺席各自LAM表明arabinan一半封锁了LM的刺激活动。这个结果与LM的事实一致,但不是LAMgydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba和gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba发现诱导肿瘤坏死因子的释放和引发分化的单核细胞的THP-1细胞系,arabinan KanLAM恢复领域的化学降解cytokine-inducing活动水平相似KanLM (gydF4y2Ba55gydF4y2Ba)。LM从gydF4y2Ba分枝杆菌gydF4y2Ba以前曾有报道称,sp.促炎细胞因子的诱导表达和引发(gydF4y2Ba56gydF4y2Ba)。ManLAM从毒性gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2BaH37Rv或者只Erdman菌株诱导小TNF、il - 1、il - 6,从快速增长的分枝杆菌菌株与PILAM相比,尽管ManLAM发现诱导TGFβ(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)。在这项研究中,我们的观察Vignal et al。(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba在LM的积极影响)gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司和gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba缺席的各自林:我们表明,LM刺激TNF的表达不仅而且IL-12p40和聚集有关分子的装甲运兵车,适应性免疫和生产相关的不,一种抗结核菌的效应分子。gydF4y2Ba
对TLR信号,我们这里展示LM-induced TNF和IL12p40生产依赖于功能TLR2的存在,但独立TLR4或TLR6识别,也通过适配器MyD88蛋白介导的。我们最近显示了PIMgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和PIMgydF4y2Ba6gydF4y2Ba从gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询集团是由巨噬细胞TLR2受体激动剂产生TNF较低生产(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。因为各自的林没有刺激,这里给出的数据支持假设arabinan基的位阻块PIM的TLR2受体激动剂活性基,加上其他甘露糖残基在LM TLR2可识别,从刺激细胞因子的分泌。gydF4y2Ba
第二,我们表明,KanLM和CheLM施加强有力的抑制作用IL-12p40在巨噬细胞和肿瘤坏死因子的生产与TLR4受体激动剂LPS刺激。这种抑制作用是由TLR2和TLR6和似乎也是MyD88独立。gydF4y2Ba
林从gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司或gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba,但不是林gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba和gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba,抑制TNF和LPS-induced IL-12p40由巨噬细胞分泌。这与先前的报道证明是一个强烈抑制TNF和il - 12的ManLAM发布gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司和gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba在人类树突细胞或THP-1与LPS刺激(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。然而,还是激活的巨噬细胞CD40表达(数据未显示)。有趣的是,相应的BCGLM在该系统基本上没有明显的抑制作用。我们进一步特征BCGLM的潜力和BCGLAM调节初级巨噬细胞释放的细胞因子,发现LM强刺激的巨噬细胞激活和释放肿瘤坏死因子水平与LPS诱导后,而BCGLAM,正如预期的那样,不活跃。的刺激效果BCGLM TLR2依赖。这使我们假设BCGLM的抑制作用可能是蒙面的强烈的刺激效应。的确,在缺乏功能性TLR2 BCGLM无法触发任何促炎细胞因子分泌及其对LPS-induced TNF分泌的抑制作用明显。同样,CheLM的抑制效果和KanLM LPS-induced TLR2-deficient巨噬细胞中细胞因子更明显有一个熔化的促炎反应(见图5gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。因此,双重TLR2-dependent、刺激和抑制LPS-induced TLR2-independent细胞因子分泌似乎是常见的各种分枝杆菌LM的研究。gydF4y2Ba
因此,BCGLM BCGLAM不同,赞成和抗炎图案。巨噬细胞活化和细胞因子生产LPS刺激后观察BCGLAM的存在是有限合伙人之间的相互作用的结果炎性刺激由抑制和TLR2和TLR4和BCGLAM MyD88-independent信号。这个相声似乎承担一些TLR4特异性由于巨噬细胞刺激通过TLR2受体激动剂PamgydF4y2Ba3gydF4y2Ba埋头gydF4y2Ba4gydF4y2Ba或由BCGLAM LTA不抑制。LM的情况更复杂的细胞活化和细胞因子生产LPS刺激后观察LM的存在是由有限合伙人TLR4受体激动剂刺激的结果,由LM TLR2受体激动剂刺激,加上TLR - LM MyD88-independent抑制。最终结果,赞成或抗炎细胞反应,因此将取决于平衡的细胞表达不同的TLR PRR受体有关。LM抑制作用似乎并不是一个单纯的交叉抗性/脱敏以来TLR2和TLR4受体激动剂之间有限合伙人和LM加在一起为了避免脱敏,和LM抑制发生在TLR2-deficient巨噬细胞。gydF4y2Ba
甘露糖受体结扎可以抑制il - 12生产由人类树突细胞和甘露糖受体本身已经推断出参与ManLAM在树突细胞的抑制作用(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。这里描述的LM和林的抑制效应可能由甘露糖受体介导,如甘露聚糖gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba甘露糖受体的配体和结构非常相似的甘露聚糖核心LM,显示部分LPS-induced肿瘤坏死因子释放的抑制小鼠巨噬细胞(数据没有显示)。然而,早期的研究使用包覆聚苯乙烯珠表明ManLAM,但无论是PILAM还是LM,绑定到甘露糖受体(gydF4y2Ba57gydF4y2Ba)。另一个受体,DC-SIGN,最近被证明参与ManLAM分枝杆菌——或者LPS-induced抑制树突状细胞成熟(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。ManLAM,但不是PILAM,抑制gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba绑定DC-SIGN (gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。我们在这里展示,尽管ManLAMgydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司或gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba强有力的抑制剂LPS-induced巨噬细胞活化和细胞因子分泌之前报道(gydF4y2Ba19gydF4y2BaLAM),这个活动是不能共享的gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba或gydF4y2Bam . kansasii。gydF4y2BaCheLAM没有能力抑制LPS-induced细胞因子分泌与事实一致CheLAM没有甘露糖的帽子(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。事实上,之前已经证明了甘露糖帽是至关重要的元素PILAM以来林抑制活动或ManLAM缺乏甘露糖帽α-mannosidase治疗后不抑制(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)由于无法绑定和/或DC-SIGN(甘露糖受体gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。关于这些数据,这是值得注意的gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba不绑定到DC-SIGN-expressing海拉细胞(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。关于KanLAM,情况还不清楚,因为它的确拥有甘露糖帽(见图1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和裁判。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。一个精确的解释方面的功能数据结构是受这一事实LAM和LM是多分散的,复杂的分子,其精细结构的决心是容易与可用的性能分析技术发展。gydF4y2Ba
尽管缺乏oligomannosyl上限的情况下,我们在这里展示,LM也强烈的促炎细胞因子抑制剂。这可以解释为c型凝集素结合的能力通过侧链终端甘露糖单位为LM的约束力的证明gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司和gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba到C-lectins SP-A (gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)或DC-SIGN (g .普佐j . Nigou o . Neyrolles,未公开的数据)。ManLAM而言,只有终端帽的甘露糖单位参与绑定,甘露聚糖的核心被arabinan隐藏域(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
PILAM炎性分子的共识,而ManLAM抗炎分子,已经相关的intramacrophagic命运相应的分枝杆菌。事实上,无能gydF4y2Bam . smegmatisgydF4y2Ba激活巨噬细胞内存活与PILAM的促炎效应有关。同样地,的能力gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2BaBCG巨噬细胞内生存和繁殖同意ManLAM的抗炎效果。因此,ManLAM成为贡献的主要毒力因子通过免疫抑制效果的持久性gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2BaBCG在吞噬细胞。自从LM林被认为是一个直接的生物合成的前体,一些研究目的是分析其潜在的生物功能(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba)。在这项研究中,我们提供了证据表明,LM从几个物种有能力显示促炎和刺激的活动,而ManLAM主要有抗炎活动TLR4受体激动剂LPS的存在。因此,林也可能被视为“减”形式的LM。可以推测,分枝杆菌可能会影响细胞因子的环境有利于LAM和LM合成、表达细胞壁,并释放出分枝杆菌细胞吞噬体介质和旁观者正如前面所示LAM和PIM (gydF4y2Ba58gydF4y2Ba)。LM:林比似乎变量在不同的分枝杆菌,9:1(摩尔:摩尔)gydF4y2Bam . chelonaegydF4y2Ba(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba),3:1gydF4y2Bam . kansasiigydF4y2Ba(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),1:1gydF4y2Ba牛分枝杆菌gydF4y2Ba波士顿咨询公司(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。许多arabinosyltransferases可能参与arabinan域的合成。然而,它仍然可能编码这些酶的基因表达的调节,在特定的情况下,他们是过表达,以确保arabinan合成。因此,生产过剩的arabinosyltransferases可能导致重要的变化对LM /林平衡,这可能是一个关键的步骤对分枝杆菌导演先天免疫的结果。它最近被证明gydF4y2BaembC -gydF4y2Ba有缺陷的gydF4y2Bam . smegmatisgydF4y2Ba应变影响arabinosylation LAM (gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)。失活的gydF4y2BaembCgydF4y2Ba基因导致完全停止林生物合成虽然LM和PIMs仍合成。因此,这样一个有缺陷的突变gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba将是一个有吸引力的工具地址是否LM /林分枝杆菌发病机制的平衡是一个关键因素。决心LM /林组成的gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba细胞壁在急性或潜伏性感染,以及合并感染期间,将有助于衡量LM的生物学意义和林modulins建立和持久性的宿主免疫反应在肺结核感染。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢美国博士彰(宿主防御、微生物研究所疾病,大阪大学,大阪,日本)和c . Kirschning博士(医学微生物学研究所免疫学和卫生,慕尼黑工业大学,慕尼黑,德国)请提供TLR - MyD88-deficient老鼠用于这项研究。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这项工作是支持Franco-South-African格兰特研究合作项目(V.J.Q.)和国家卫生研究所et de la医学研究院(L.K.)和中心国家(V.J.Q. de la任职,开国元勋之一B.R.安贝德卡对,J.N.,G.P.).
↵gydF4y2Ba2gydF4y2Ba当前地址:生物化学研究所、台湾中央研究院,学术界路128秒2,出门,115年台北,台湾,中华民国。gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba3gydF4y2Ba地址的信件和重印请求Bernhard Ryffel博士,分子免疫学和胚胎,中心国家de la任职3 b街Ferollerie, f - 45071奥尔良Cedex 2,法国。电子邮件地址:gydF4y2Babryffel在{}cnrs-orleans.frgydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba4gydF4y2Ba这篇论文使用的缩写:LM, lipomannan;LAM lipoarabinomannan;AraLAM无上限,林;DC-SIGN,树突特异性细胞粘附分子3;ManLAM mannose-capped林;MPI, mannosyl-phosphatidylinositol;MyD88,骨髓分化因子88;PILAM phosphoinositol-capped林;PRR、模式识别受体;TLR, toll样受体; BCG, bacillus Calmette-Guérin; LTA, lipoteichoic acid; PIM, phosphatidylmyo -gydF4y2Ba肌醇甘露糖苷。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2003年9月30日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2004年1月16日。gydF4y2Ba
- 版权©2004年由美国免疫学家协会gydF4y2Ba
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