益生菌改善复发Th1-Mediated小鼠结肠炎诱导il - 10和IL-10-Dependent TGF-β-Bearing监管细胞¹

在克罗恩病(CD),⁴遗传和环境因素相互作用产生一个immunopathogenic过程,导致慢性,复发肠道炎症(1)。最近对这种疾病的性质,主要是从研究的实验模型结肠炎症,强烈建议,它可以导致免疫耐受的丧失Ags的细菌微生物区系。反过来,这可能发生的后果绝对或相对缺陷调节性T细胞的功能或过度免疫反应这些Ags无法正常控制的调节性T细胞的功能(2,3)。很合适,这些免疫病理学机制集中注意力集中在细菌微生物区系本身的可能性,尽管一些疾病的细菌是诱发者,其他人,被称为益生菌生物(益生菌),预防疾病。

基于后一种可能性,治疗方法旨在调节局部微环境使用益生菌检测在结肠炎动物模型和人类炎症性肠病(IBD) (4)。因此,在对老鼠的研究,表明直肠管理这种乳酸菌(5)或口服乳杆菌299 v(6)IL-10-deficient老鼠预防结肠炎的发展(5)或变弱的严重性建立结肠炎(6)。同样,益生菌混合的管理:# 3(双歧杆菌、乳酸杆菌,唾液链球菌)小鼠il - 10的缺乏导致减少炎症的微观证据以及减少粘膜分泌TNF-α和IFN-γ(7)。相比之下,而:# 3和乳酸菌应变GG益生菌改善iodoacetamide-induced结肠炎,他们没有影响二硝基苯磺酸acid-colitis (8)。同样的,l。杆菌的物种299没有能力改善肠道通透性的三硝基苯磺酸(TNBS)全身结肠炎(TNBS-colitis)并没有减少严重的结肠炎模型(9)。

人类研究益生菌的治疗效果与炎症性肠病通常,但不总是,是积极的。因此,它是可行的非病原的表明,口服大肠杆菌应变Nissle 1917与低剂量mesalazine维持缓解和预防复发溃疡性结肠炎患者(10,11);同样,在一个小,短期开放性试验,Guslandi et al。(12)发现mesalazine患者CD +Saccharomycetes boulardii维持缓解期患者比mesalazine孤单。相反,在另一项研究的能力乳酸菌GC政府为了防止手术后复发CD测试,发现这个益生菌未能阻止内窥镜复发或减少复发病变的严重程度(13)。

虽然现在有一个相当大的身体的信息关于益生菌的临床疗效,知识的作用机理仍相对不完整。在目前的研究中,我们解决这个不足进行研究,我们分析两种效应和监管方面的小鼠的免疫反应发生复发Th1-mediated结肠炎引起TNBS有或没有口服益生菌制剂的临床疗效,:# 3。我们发现日常管理这些益生菌3周后老鼠恢复初始体重结肠炎的第一感应,结果在一个温和的结肠炎后第二个TNBS管理,特点是早些时候体重恢复,减少死亡率,降低微炎症水平,减少粘膜IFN-γ的生产。与此同时,这种保护是伴随着监管细胞和细胞因子的诱导。

结肠炎的研究被执行在5 - SJL 6-wk-old雄性老鼠从查尔斯河实验室获得从哈伦(Calco)和实验室,在动物设施维护史Superiore di Sanità。7天内进行了实验动物的到来。所有的研究都是通过动物保健和使用委员会史Superiore di Sanità和意大利卫生部。结肠炎的感应,TNBS (Sigma-Aldrich;丙烯酰胺米兰)50%的乙醇是管理/直肠轻度麻醉老鼠通过3.5 - f导管插入直肠。导管尖端插入4厘米近端肛门边缘;150μl流体(TNBS /乙醇)慢慢灌输进入结肠,和鼠标在30年代的垂直位置。图中列出。1150年,老鼠最初管理intrarectallyμl包含0.5 - -2.5毫克的TNBS在50%乙醇,以及随后的结肠炎是评估通过观察动物的体重变化。8 - 10天后,老鼠恢复初始体重被分成两组。一组:# 3:制药),2毫克50μl PBS /操作系统,每天总共3周,另一组只收到50μl PBS。3-wk时期结束时,三到五个老鼠每组的牺牲来评估生产由结肠组织淋巴细胞分离、细胞因子和剩下的小鼠组第二intrarectal政府150μl含有2.5毫克的TNBS在50%乙醇。在一些实验中,额外的每组小鼠anti-IL-10R马伯0.5毫克(1 b1.3;DNAX ip)的研究注入的150年第二intrarectal政府μl含有2.5毫克的TNBS 50%乙醇。在一些实验中,从两组(即附加的老鼠。,PBS treated or VSL-3 treated) received 1 mg of a neutralizing anti-TGF-β 1,2,3 Ab by i.p. injection, and TNBS colitis was induced as described above. Occurrence and course of “recurrent colitis” in the two groups of animals was evaluated by observing the weight changes, mortality, and gross and microscopic appearance of the colons, and by evaluation of isolated colonic mononuclear cell cytokine production.

:# 3:制药)是一种益生菌混合物3×10¹¹/ g的可行的冻干菌包括双歧杆菌(双歧杆菌longum,双歧杆菌属对象,双歧杆菌谕令),乳酸杆菌(嗜酸乳杆菌,干酪乳杆菌,乳酸菌delbrueckii无性系种群。乳酸菌bulgaricus,l .杆菌),唾液链球菌无性系种群。酸奶。

组织从死亡的老鼠在表示时间固定在10%中性缓冲福尔马林溶液(Sigma-Aldrich),然后嵌入在石蜡,切成组织部分,沾染了)。彩色部分检查的证据使用以下标准:结肠炎的淋巴细胞浸润,伸长和/或失真的蓄水池,弗兰克溃疡,肠道壁的增厚。在微观操作的结肠炎症的程度从0到4级配半定量的如下:0,没有证据表明炎症;1,低水平的淋巴细胞浸润和渗透在< 10%高功率领域(高通滤波器),没有结构性变化观察;2、温和的淋巴细胞浸润和渗透在10 - 25%高通滤波器,地穴伸长,肠壁增厚,不超越粘膜层,没有证据表明溃疡;3,高水平的淋巴细胞浸润和渗透在25 - 50%的高通滤波器,血管密度高,肠壁增厚,超过粘膜层;4,淋巴细胞浸润程度与渗透在高通滤波器> 50%,血管密度高,地穴伸长变形,透壁的肠壁增厚和溃疡。

LPMC刚获得结肠标本中分离的使用修改描述的方法由范德Heijden和斯多克(14)。总之,结肠标本洗HBSS-calcium镁自由(BioWhittaker),切成0.5厘米块,在哈佛商学院孵化两次含有EDTA(0.37毫克/毫升)和德勤(0.145毫克/毫升)37°C为两个周期15分钟。然后组织进一步消化RPMI 1640包含胶原酶D (400 U /毫升)和DNase(0.01毫克/毫升)(勃林格曼海姆,生化药剂)摇动孵化器在37°C。最后,释放细胞分层在40 - 100% Percoll梯度(法玛西亚)获取lymphocyte-enriched人口40 - 100%的接口。

LPMC被隔绝冒号:# 3或PBS-fed老鼠3天后完成最后的喂养。LPMC (3.0×10⁵)然后向正常SJL小鼠尾静脉注入了静脉输液。TNBS是管理接受者老鼠LPMC转移后5 - 7天。在一些实验中,额外的每组小鼠被LPMC耗尽的大腿上⁺细胞通过使用CELLection生物素绑定工具包(Dynal生物技术),在珠涂有山羊anti-LAP生物素化的Ab (affinity-purified生物素化的山羊anti-latency-associated肽(圈)多克隆Ab;研发系统)被用来直接选择圈⁺LPMC细胞悬浮液按照制造商的指示;或CD4 LPMC耗尽⁺腿上⁺细胞通过细胞排序后染色细胞anti-mouse CD4-allophycocyanin (BD Pharmingen)和使用FACS-ARIA anti-LAP-PE (BD生物科学)。最后,在一些实验中,额外的每组小鼠接种anti-IL-10R马伯的ip注入0.5毫克(1 b1.3;DNAX研究)的时候intrarectal管理150μl含有2.5毫克的TNBS在50%乙醇。

LPMC细胞培养是在完全培养基组成的RPMI 1640 (BioWhittaker)补充2毫米l谷氨酰胺,10毫米消息灵通的缓冲区,10μg / ml庆大霉素,100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升、0.05毫米我(Sigma-Aldrich),和10% FCS (HyClone欧洲)。

测量孤立LPMC产生细胞因子的能力,LPMC种群是在完全培养基培养1×10⁶细胞/毫升48-well板块(配角;康宁)涂布或裸anti-CD3εAb(克隆145 - 2 - c11;BD Pharmingen)。涂料是通过接触前的个别井10μg /毫升murine-anti-CD3εAb在碳酸盐缓冲(pH值9.6)1 h在37°C。培养液的细胞群涂井也包含1μg /毫升可溶性anti-CD28 Ab(克隆37.51;BD Pharmingen)。文化在这些条件下,48 h后文化上层清液被移除和化验的存在细胞因子通过ELISA (IFN-γ、il - 4、il - 10)。

细胞因子浓度商用具体使用duo-paired ELISA测定小鼠细胞因子/制造商的建议(BD Pharmingen)。光密度测量在Bio-Rad Novapath ELISA读者波长450纳米。分析了数据生成的标准曲线的线性部分。

新孤立LPMC在PBS / 2% FCS洗两次,和货代被孵化anti-CD16 / CD32 (Fc块;BD Pharmingen)。细胞与生物素化的第一次染色anti-LAP Ab(研发系统)或生物素化的正常山羊免疫球蛋白(研发系统)。孵化30分钟后,这些细胞被洗,和streptavidin-PE anti-mouse-CD3 PerCP(克隆145 - 2 - c11),和anti-mouse CD4 allophycocyanin(克隆RM4-5)添加和孵化30分钟。然后细胞被洗两次,和荧光细胞的百分比量化使用FACSCalibur (BD生物科学)。评估IL-10-producing细胞的百分比,LPMC在完全培养基培养48小时没有任何兴奋剂或anti-CD3和anti-CD28马伯的存在。莫能菌素(GolgiStop;BD Pharmingen)增加了在过去的8 h的文化。潜伏期结束时,这些细胞被洗了,贴上Ab对表面Ags (anti-mouse CD3-PerCP, anti-mouse CD4-allophycocyanin,和streptavidin-FITC-biotinylated anti-LAP Ab)。细胞被固定和permeabilized (Cytofix / Cytoperm;BD Pharmingen) 20分钟,洗WashPerm (BD Pharmingen),并贴上PE-anti-IL-10 mAb (BD Pharmingen)或isotype-matched Ig控制(BD Pharmingen)。

评估是由学生的统计差异t测试或χ_c²在适当的地方。

模仿益生菌的影响在人类复发性结肠炎小鼠结肠炎模型的上下文中,我们第一次测试这样的政府是否经过第一道菜TNBS-colitis能够调节第二课程TNBS-colitis(“复发性结肠炎”)(见图的研究协议,无花果。1)。如无花果所示。2,每日:# 3管理局(以下称为益生菌管理)在3-wk两门课程之间的时间间隔结肠炎导致了体重显著减少在结肠炎复发和死亡率与小鼠相比收到PBS在相同的时间间隔。此外,如无花果所示。3摄老鼠组织显示那么严重等级的结肠炎症与接受pbs老鼠组织相比,正如图所示。4的老鼠,他们LPMC孤立后第四天TNBS-colitis reinduction在体外刺激表现出显著减少IFN-γ和il - 10分泌il - 4分泌(但没有变化)。因此,益生菌管理第一道菜结肠炎能够改善后的严重性第二(复发)结肠炎。

在进一步的研究中,我们评估的保护作用是否益生菌对TNBS-colitis政府转移到天真的老鼠。为此,我们转移LPMC隔绝摄老鼠以及LPMC隔绝接受pbs老鼠进组天真的老鼠,然后,1周后细胞转移,诱导TNBS-colitis。如无花果所示。5,一个,尽管接受细胞摄老鼠体重改变仅略低于接受接受pbs的老鼠,他们表现远低于死亡率;此外,如无花果所示。5,B和CLPMC隔绝收件人老鼠后第四天TNBS-colitis感应IFN-γ和il - 10分泌展出。这些数据表明,益生菌治疗的保护作用与单核细胞人口和驻留在很大程度上,后者使鼠标抗结肠炎归纳。

这种阻力的一种可能的机制是益生菌诱导的免疫调节作用。评估这种可能性,我们确定anti-CD3 / anti-CD28-induced体外细胞因子的生产从小鼠结肠LPMC孤立的3-wk治疗期与益生菌或PBS。在结肠炎reinduction之前的时期。如无花果所示。6一个与显著增加相关,益生菌政府LPMC il - 10生产在此期间与PBS管理。

然后我们决定anti-CD3 / anti-CD28-induced体外小鼠il - 10的LPMC获得生产在第一次结肠炎reinduction后4天,也就是说。后,在结肠炎被TNBS reinduced管理。如无花果所示。6,B,我们发现LPMC摄老鼠隔绝,与接受pbs的老鼠相比,表现出更强的il - 10生产后的头几天,结肠炎reinduction;这是特别明显的结肠炎reinduction后第二天,那时LPMC隔绝摄老鼠产生四倍比接受pbs小鼠il - 10。然而,在这一天,il - 10的水平生产下降,关联,在第四天炎症几乎已经消退,如图所示的体重恢复展出的老鼠(图。2,一个),组织学外观的冒号(无花果。3生产(图),他们的细胞因子。4)。相比之下,LPMC隔绝接受pbs老鼠表现出低水平的il - 10生产早期结肠炎reinduction后只会增加4天与自发的复苏结肠炎的发病,此时il - 10生产超过摄小鼠il - 10(一致的生产在这个时间点在无花果。4和5)。应该注意,LPMC IFN-γ生产没有显示相同的趋势是低细胞il - 10生产摄老鼠比细胞接受pbs老鼠在所有天研究(数据没有显示)。

最后,我们研究了il - 10分泌的作用保护作用的益生菌治疗使用马伯IL-10R il - 10块使用。如无花果所示。7、管理的Ab在结肠炎reinduction废除益生菌的能力改善复发性结肠炎小鼠摄。因此,在摄老鼠管理时anti-IL10R结肠炎reinduction,结肠炎的程度(以百分比表示身体减肥一天3)(84±3%)没有不同于观察要么接受PBS老鼠服用anti-IL-10R(85±2%)或没有管理的老鼠接受PBS anti-IL10R Ab (87±3%)。类似的结果在上述细胞转移的研究,在anti-IL10R政府阻止细胞的保护作用摄老鼠转移到未经处理的接受者老鼠(数据未显示)。综上所述,这些数据提供了强有力的证据表明一个涉及il - 10介导免疫调节效应的能力益生菌治疗预防复发性结肠炎的发展。

进一步调查可能的免疫调节作用的益生菌,我们确定后者诱导调控细胞。在这些研究中,我们利用这一事实,最近表明,调节性T细胞可以识别能力的形式表达TGF-β圈在细胞表面和最近的演示这样的大腿上⁺细胞可以抑制CD4细胞⁺CD45Rb^高全身的结肠炎(15,16)。因此,我们孤立LPMC从结肠标本收集的益生菌或PBS结肠炎治疗期,又在3 - 4天后reinduction和玷污了孤立的细胞检测圈表达式(见材料和方法)。尽管在治疗期的结束和结肠炎reinduction之前,我们发现CD3的百分比⁺和CD4⁺以及CD3⁺腿上⁺细胞LPMC益生菌没有差异,接受pbs老鼠(CD3⁺:58±8 vs 53±8%;CD4⁺:32±11 vs 27±6%;CD3⁺腿上⁺:6±3和5±2%),增加CD4的百分比⁺腿上⁺老鼠细胞摄老鼠相比,接受pbs (3.4±0.2 vs 1±0.3%)(相当于8.5±3.5 vs 3.5±1.2%的大腿上⁺在CD3阳性细胞⁺CD4⁺关联到一个封闭的细胞)p= 0.06水平。更重要的是,如无花果所示。8在时间进程研究CD4的百分比⁺腿上⁺细胞结肠炎reinduction后,我们观察到持续增加CD4的百分比⁺腿上⁺小鼠细胞摄vs接受pbs小鼠结肠炎reinduction后第三天达到高峰,此时显著增加CD4水平⁺腿上⁺细胞检测(15±3.3 vs 6±1.1;p< 0.05)。以进一步确定圈的本质特征⁺细胞在固有层的益生菌政府时期,我们执行流仪细胞内染色的研究如果和刺激了这些老鼠的LPMC估计CD4的能力⁺腿上⁺分组人口产生il - 10(见材料和方法)。我们发现之前和之后的刺激与anti-CD3 / anti-CD28, CD4的分别为3.1%和1.5⁺腿上⁺LPMC细胞获得摄老鼠,而CD4的5.4%和4.4⁺腿上⁺细胞LPMC隔绝接受pbs老鼠,含有胞内il - 10。因此,CD4⁺腿上⁺细胞摄老鼠包含,如果有的话,人口IL-10-producing细胞低于类似细胞接受pbs老鼠,因此不太可能这人口保护,因为一个更大的能力来产生il - 10。最后,我们管理anti-IL-10R摄小鼠结肠炎reinduction确定il - 10的封锁使用后会影响CD4水平⁺腿上⁺在这样的老鼠的细胞培养。如无花果所示。9,我们发现老鼠anti-IL-10R体现CD4管理⁺腿上⁺细胞水平与观察小鼠接受pbs。因此,很明显,CD4的扩张⁺腿上⁺复发性结肠炎是依赖于活动期间细胞il - 10。

评估的监管活动圈⁺益生菌治疗后细胞出现,我们使用两种不同的实验方法。第一圈是基于事实⁺细胞已被证明调解监管功能通过细胞表面或分泌TGF-β(15,16与CD25),共同之处⁺监管细胞一般来说,可能需要TGF-β扩张。因此,我们认为,我们可以阻止的大腿上⁺细胞由政府监管活动期间复发性结肠炎(见anti-TGF-βAb的老鼠材料和方法)结肠炎reinduction时。如无花果所示。10,anti-TGF-β政府确实防止益生菌改善摄小鼠结肠炎的能力。

第二种方法是确定LPMC种群是否来源于摄老鼠,然后进行选择性耗尽的大腿上⁺细胞会导致细胞无法转移保护结肠炎。我们从老鼠因此过继转移LPMC益生菌(或PBS)已经耗尽的大腿上⁺细胞使用anti-LAP Ab绑定到磁珠(见材料和方法)天真的老鼠,然后诱导TNBS-colitis在后一种老鼠。如无花果所示。11,一个和B,因为体重变化和组织学状态评估的结肠组织,老鼠LPMC耗尽的大腿上⁺细胞捐献者美联储益生菌开发出一种更严重的结肠炎小鼠相比,收到nondepleted LPMC。沿着这条路在第二个实验中,我们耗尽LPMC隔绝摄CD4的老鼠⁺腿上⁺细胞流仪排序的细胞表达CD4和大腿上。此后,我们转移未用尽的LPMC或CD4细胞⁺腿上⁺耗尽LPMC天真的老鼠,然后接受后者TNBS-colitis归纳。天真的小白鼠转移LPMC隔绝接受pbs老鼠作为额外的控制。如无花果所示。12,一个,排序过程导致几乎所有CD4的损耗⁺腿上⁺细胞。此外,如无花果所示。12,B和C、鼠标LPMC耗尽CD4的接受者⁺腿上⁺细胞表现出没有保护TNBS-colitis感应,而收件人未用尽的细胞在很大程度上受这样的感应。和之前一样,LPMC孤立的接受者接受pbs老鼠不受结肠炎归纳。综上所述,这些数据提供了强有力的证据表明膝上⁺(更具体地说,CD4细胞⁺腿上⁺细胞)直接参与保护作用的益生菌引起的。

在目前的研究中,我们表明,益生菌的日常管理:# 3,老鼠3-wk间隔从一个初始复苏后诱导TNBS-colitis之前第二感应(复发)TNBS-colitis导致复发性TNBS-colitis温和的形式。这种保护性活动可归因于对单核细胞在固有层的影响,因为它可以从小鼠摄LPMC转移到天真的老鼠。此外,这个活动是由于IL-10-dependent监管细胞,因为它是与il - 10的生产,anti-IL-10R可以被管理的,与CD4的IL-10-dependent外观⁺腿上⁺细胞CD4先前已被证明有监管活动⁺CD45RB^高全身的细胞转移(SCID)结肠炎模型(15,16)。最后,监管细胞之间的关系,建立了保护作用,保护活动被anti-TGF-β管理和损耗的大腿上⁺细胞(CD4⁺腿上⁺细胞)过继转移LPMC否则能够赋予保护结肠炎等的细胞的发展。

监管的概念,益生菌通过诱导细胞本来就有吸引力,因为它似乎是不可能的,他们可以通过充分的行动取代所有细菌在肠道微生物区系,能够导致实验小鼠炎症/个人容易IBD-like炎症或炎症性肠病。支持这一观点的事实很少或没有证据表明潜在的病理细菌是局限于任何一个细菌物种,所以如果替换机制,益生菌会取代很多不同的细菌填充不同生态位的细菌粘膜环境。在最近的研究轴承在这个问题上,Rachmilewitz et al。17)表明,免疫刺激性的DNA序列(包含unmethylated CpG的DNA序列)一致,作为免疫佐剂矛盾能防止各种形式的实验粘膜炎症的发展,包括诱导炎症,如葡聚糖钠sulfate-colitis TNBS-colitis以及自发结肠炎与il - 10的缺乏有关。正如所料,这种效果是伴随着诱导的抑制炎性细胞因子和趋化因子(17)。在最近的一项研究中,他们发现,两个nonprobiotic大肠杆菌DNA和益生菌:# 3 DNA通过胃内的或南卡罗来纳州路线能够抑制正常小鼠中的葡聚糖钠sulfate-colitis但不是TLR9-deficient老鼠,即。、老鼠缺乏toll样受体可以识别细菌的DNA。相反,他们能够抑制这种TLR2和TLR4-deficient小鼠结肠炎(18)。在此基础上,他们建议益生菌生物信号通过TLR9识别树突状细胞诱导调节性T细胞。在最近的研究,间接地说这种可能性,龙等人表明,益生菌:# 3)显示一些差异大肠杆菌诱导的人类骨骨髓来源树突状细胞表面标记,不提高树突状细胞诱导同种异体T细胞增殖的能力一样大肠杆菌。此外,益生菌更容易诱导il - 10生产树突细胞大肠杆菌添加时,虽然都可以诱导il - 12在文化(19)。这些研究提示在益生菌可能会引起一个类诱导调节性T细胞的树突细胞。

所建议的其他益生菌的研究活动,机制以外涉及影响调节性T细胞可能起带动保护粘膜炎症。提出的一个替代机制马德森et al。7),是益生菌(在这种情况下,在这项研究中,使用的一样:# 3)增强上皮屏障功能IL-10-deficient老鼠和分泌因子,增加了阻力沙门氏菌单层上皮体外的入侵。这些数据提供了一个解释,益生菌功能没有il - 10的情况下,一个关键的细胞因子参与监管cell-dependent机制提出。第二个替代机制是益生菌抑制趋化因子生产(如引发)上皮细胞,从而抑制粘膜细菌的先天反应(20.)。然而,这被认为与一个益生菌制剂:# 3)而不是另一个(大肠杆菌Nissle 1917)。最后,初步数据显示益生菌可能诱发defensin生产,从而提高控制细菌生长在肠道隐窝(21)。应该注意的是,这些替代的解释涉及益生菌对上皮细胞功能的影响,而在目前的研究中,这是与细胞转移的研究表明,益生菌效果与LPMC驻留。尽管如此,这些发现并不是相互排斥的,因为它仍然是可能的,益生菌有几个发挥抗炎作用,并影响上皮细胞功能和感应监管细胞协同作用的益生菌活动的机制。

如上所示,这里给出的数据清楚地证实益生菌政府的保护作用对复发性TNBS-colitis依赖增加摄小鼠il - 10生产。这个结论是符合先前的研究复发性结肠炎的HLA-B27 monoassociated老鼠拟杆菌vulgatus然后使用抗生素治疗和/或益生菌。这些研究表明,益生菌(乳酸菌GG)治疗可以预防复发性结肠炎在这些老鼠,这样的预防与增加il - 10(但没有改变TGF-β)分泌的化验检测盲肠的匀浆(22)。同样,益生菌的DNA来自某些组件:# 3细菌诱导il - 10在人类PBMCs体外生产增加(23)。其他数据影响il - 10的肠道炎症的关系来自于最近的示威,il - 10基因疗法防止TNBS-colitis (24),小鼠脾脏CD4细胞⁺淋巴细胞转导与逆转录病毒载体表达il - 10可以预防结肠炎的细胞转移的发展(SCID)转移结肠炎模型(25)。然而,应该注意的是,il - 10的增加生产中观察到小鼠摄和相关保护发生在益生菌治疗期的结束,在TNBS-colitis复发的最初阶段。因此,它发生之前建立全面的结肠炎。这是与这一事实相一致,在TNBS-colitis,虽然il - 10能预防结肠炎之前如果有炎症的发展发展,就是无效的如果有炎症已成为建立之后(24,25,26,27)。后面的观察并不是冲突与SCID-transfer结肠炎的研究(25),它已经表明,il - 10转导CD4细胞⁺T细胞能够有效预防结肠炎即使管理转移后的14天colitogenic CD45RB^高T细胞,因为在这个模型中结肠炎尚未完全建立在一个月后细胞转移。

进一步的解释早期增加il - 10的意义生产益生菌的活动,我们需要参考先前的研究中,我们分析了预防TNBS-colitis通过喂养trinitrophenol-haptenated蛋白质在结肠炎感应(28)。在这些研究中,我们第一次发现这样的喂养诱导可转让的调节性T细胞的生产。然后,我们表明,尽管anti-TGF-β政府导致TGF-β生产和减少损失的监管效果,它没有影响il - 10生产;相比之下,anti-IL-10管理导致降低il - 10分泌和TGF -β生产。这些后者发现表明il - 10在这种背景下的角色是支持细胞生产TGF-β和il - 10的发展几乎没有监管本身的影响。最后,在细胞转移的研究中,我们表明,il - 10的影响并不发生在最初的感应TGF-β-producing监管细胞因为这些细胞也可能诱导il - 10活动时被阻塞,而是扩张期间(28)。因此,这些先前的研究表明,il - 10在固有层诱导的功能益生菌是支持发展的监管TGF-β-producing T细胞的近端抑制剂是复发性结肠炎。益生菌治疗引起的il - 10可能也不排除有直接的抑制效果的研究报道,因为这只能确定进行研究与纯化监管细胞IL-10-deficient老鼠是非常不切实际的,因为低数量的监管LPMC细胞,即使在摄老鼠。然而,这种可能性似乎不太可能,因为CD4细胞⁺腿上⁺细胞群获得摄老鼠保护天真的接受者的老鼠受到TNBS-colitis感应控制,如果有的话,IL-10-producing细胞比类似的人口获得接受pbs老鼠不是保护;此外,如前所述,il - 10在老鼠的增加转移LPMC后摄老鼠被认为早期转移和不持续,正如所料,如果它是一个主要的抑制因素。

把重点从TGF-βil - 10,这里的重要观察是益生菌治疗结果增加固有层IL-10-dependent CD4的数量⁺腿上⁺T细胞,这似乎是结肠炎的改善至关重要。如前所述,CD4细胞⁺腿上⁺T细胞是T细胞,潜伏TGF-β细胞表面。这些细胞CD25是相似的(如果不是完全相同)⁺“自然”监管细胞之前,他们已经被证明能够抑制细胞转移结肠炎TGF-β-dependent机制(15,16)。这些细胞的重要性对实验性结肠炎益生菌的影响被封锁的强烈支持这些细胞的功能管理anti-TGF-β或者,的确,这些损耗的细胞的细胞群,取消了结肠炎益生菌的保护作用。anti-TGF-β这种效应可以将两个独立但Ab互动活动。首先,Ab可能会阻止这些细胞的效应函数,通过防止抑制信息交互涉及到细胞表面TGF-β或防止抑制由TGF-β的分泌。第二,最近出现的证据表明TGF-β可以诱导天真CD25⁻细胞合成Foxp3 forkhead转录因子,作为主控开关的表达导致监管的新创感应细胞外围组织(29日,30.);此外,它已被证明,Foxp3下调Smad7,蛋白质通常由TGF-β抑制TGF-β信号(30.)。这些数据表明,由监管细胞生产TGF-β允许自分泌或旁分泌信号,导致监管细胞的扩张,因此,anti-TGF-β在现在的环境下还可以通过阻断调节性T细胞的生成。

有待讨论的一个问题是,如前所述,益生菌(包括:# 3)已被证明在il - 10 KO小鼠改善粘膜炎症,这似乎与事实在这里强调,il - 10是益生菌调节细胞反应所必需的行动。这个明显的矛盾可以通过一项研究可以解释上面所讨论的,我们已经表明,初始代TGF-β-producing监管细胞可以发生在缺乏il - 10 (28),上述研究表明监管细胞群的扩张可以由TGF-β本身。因为Th1细胞因子反对监管细胞发展,这可能不会发生在一个飞速发展和激烈的Th1反应发生在TNBS-colitis研究等;然而,它可能会发生在慢慢发展,最初的存在弱Th1响应特性的il - 10 KO小鼠结肠炎。这个想法的数据从Sheil et al。(31日)表明,系统性益生菌管理局(唾液乳杆菌)il - 10 KO小鼠导致减少炎症和炎性细胞因子的生产下降,伴随着TGF-β生产增加了脾细胞。然而,我们需要更多的信息是否增加TGF-β生产KO小鼠il - 10的原因是益生菌的效果在这些小鼠建立这种可能性。

总之,在这里获得的数据表明,益生菌,在这种情况下,益生菌:# 3,导致那么严重复发性TNBS-colitis和建议IL-10-dependent监管的感应圈⁺T细胞的保护作用的主要机制。临床相关的信息中摆脱这种研究益生菌诱导调控细胞似乎主要是有效缓解疾病的阶段时,炎症过程仍未在峰值。因此,益生菌在CD患者中可能是最有效的管理在临床缓解期和益生菌的作用可能是限于防止复发性炎症的重要任务。

作者没有财务利益冲突。

我们感谢教授c·德·西蒙(拉奎拉大学)提供:。感谢Nazzareno迪卡洛(部分免疫介导的疾病,传染病、寄生虫,和免疫介导性疾病,史Superiore Di Sanità)动物保健和技术援助。