体内电穿孔提高丙型肝炎病毒的免疫原性非结构化3/4A DNA通过增加当地DNA吸收蛋白质表达,炎症,和CD3的渗透⁺T细胞¹

它已经表明,持续控制和清除丙肝病毒(HCV)³相关感染是一种有效的免疫反应,特别是针对非结构T细胞反应(NS) 3蛋白(1,2,3)。两个CD4⁺和CD8⁺T细胞被发现是一个关键重要的控制和清除丙肝病毒模型系统(4,5)。它也表明,病毒持久性可以提升免疫逃避T细胞识别(6,7),但病毒进行逃生的能力可能会受到病毒的健康(8)。因此,宿主T细胞所扮演的关键角色,进化压力放在病毒逃避这些机制表明一个增强的丙肝病毒的T细胞反应应该支持病毒清除。

NS3蛋白参与了丙肝病毒前体的处理多蛋白以及解除复制dsRNA (9)。这些双酶功能解释,至少部分的守恒性质蛋白(8,10)。丙肝病毒复制的特性是一代极。丙肝病毒感染肝细胞通过至少两个受体,提出研究和Claudin-1 (9,11)。感染细胞有多种感官系统检测dsRNA期间生成的病毒复制,可以触发一个细胞抗病毒状态(12,13)。NS3/4A复杂可以干扰信号通过裂开适配器分子TRIF (14)和Cardif / IPS-1 /签证/小牛(15)。因此,NS3/4A复杂是一个守恒的复杂的执行在病毒复制周期的关键功能。此外,hcv感染的免疫反应NS3蛋白清除感染的患者已经研究的很透彻(1)。这些观察结果支持plasmid-based治疗性疫苗的开发编码NS3/4A蛋白质复杂。

目前治疗慢性HCV基因型1菌株引起的感染,很大程度上是不成功的,而且代表了主要的未满足的需要一个治疗性疫苗(16)。新疗法与蛋白酶抑制剂针对NS3蛋白酶看起来有前途,虽然抗突变和毒性问题已经报告(17,18)。NS3/4A-based治疗性疫苗,如果安全有效的,也被认为是第一线治疗在治疗天真的主题和作为一个附加到现有的联合疗法治疗的患者未能维持反应常规治疗。此外,疫苗也可以预防慢性感染的发展严重感染患者或被用作预防性疫苗在天真的个体,因为研究黑猩猩使用疫苗也包括NS3建议有前途的预防(19)。

治疗性疫苗的理论是肝感染可能会提供一个小于最优启动的T细胞(20.)。因此,通过接种疫苗通过激活T细胞在肝,一个可能允许补充或重塑现有的T细胞。尽管肝脏可能并不总是充当tolerogen (21),抑制分子配体等程序性死亡1表示在肝脏和主动抑制激活T细胞(22,23)。因此,治疗性疫苗接种方法需要测试在各种传染病、转基因动物模型或人类全面理解的潜在机制。

目前NS3/4A plasmid-based疫苗已经在各小鼠模型的测试,发现诱导功能体内免疫反应是能够进入肝脏、明确肝细胞表达HCV NS3/4A蛋白质复杂(8,24,25,26)。然而,一个主要障碍关于DNA疫苗的免疫原性大大降低当搬到更大的动物(27)。体内电穿孔(EP)被用于人类和大型动物提高抗癌药物的吸收和DNA质粒(28,29日,30.,31日)。体内EP即时消息后立即注射DNA质粒是暂时性的打开毛孔肌细胞的细胞膜,质粒是有效了细胞核和表达(28,32)。一致的发现是,体内EP主要增强了DNA吸收和感兴趣的基因的表达(28,32)。我们现在描述进一步机制体内EP提高了DNA疫苗的免疫原性通过使用高免疫原性,codon-optimized NS3/4A (coNS3/4A)基因(25)。我们表明,体内EP coNS3/4A的增强了免疫原性增加蛋白质表达水平和表达的持续时间和提高CD3的渗透⁺T细胞和局部炎症反应在注射部位出现的。

男性和女性的C57BL / 6小鼠饲养和安置单位的胚胎学和遗传学卡罗林斯卡医学院,瑞典卡罗琳斯卡大学医院Huddinge。动物被关在笼子里的五个老鼠每笼和美联储商业饮食(收款(p) PL IRR饮食;特殊饮食服务)免费的食物和水。所有的动物都开始前至少6周的年龄实验。新西兰白兔重2.5 - -3.5公斤,从商业供应商和购买都保持在Visionar AB。区域动物伦理委员会批准了实验性的协议。

SV40-luciferase质粒(pGL4.13 - [Luc2-SV40];Promega)是生产内部的标准技术。coNS3/4A质粒(25)是产生在Vecura AB良好生产规范规定。

coNS3/4A DNA疫苗是由一个即时注入在老鼠和兔子0.3毫升(0.05毫升)与27-gauge针进入右胫骨前肌(TA)。剂量范围从0.5到50μg DNA在小鼠和从70年到700年μg DNA的兔子。立即注入体内后,EP使用MedPulser DNA应用交付系统(Inovio生物医学),0.5厘米针阵列将提供两个60 ms脉冲246 V / cm注射部位。一个双针电极头(老鼠)或一个four-needle电极头(兔子)每注入和动物。过程重复了三次五次在老鼠和兔子在每月的间隔。

早期的药物动力学和biodistribution第一次研究质粒DNA和基因表达的老鼠。组小鼠免疫贝聿铭在合适的助教与50μg pGL4.13 - [Luc2-SV40]质粒或50μg coNS3/4A质粒。记者的存在基因表达是由在麻醉小鼠使用体内生物发光成像系统100(创建Xenogen)。荧光素(创建Xenogen)底物注入,5 - 10分钟后,老鼠和图像分析和评估的发射光与生活进行图像软件(版本2.50;创建Xenogen)。

并行组老鼠,biodistribution coNS3/4A质粒的两后腿的横纹肌组织决心使用定量PCR (qPCR)。小鼠免疫与50μg coNS3/4A DNA TA有或没有,立即体内EP治疗使用MedPulser DNA交付系统双针阵列脉冲给两个60年代246 V /厘米。肌肉组织被移除和总DNA提取DNA提取使用一个自动化的过程(麦格纳纯信用证;罗氏公司)。质粒被量化的水平通过使用一个自动化qPCR过程(TaqMan;应用生物系统公司)按照生产厂家的说明书,使用以下引物和探针:5′-AGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGA-3′(正向引物),5′-GTCGCGGCCGGTCAGGCTGGTGATGATGCA-3′(反向引物),和6-FAM-AACCCAC-dabcyl-dT-GCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATA-phosphate(探测器)。寡核苷酸合成由斯堪的纳维亚基因合成。qPCR优化使用标准协议,有九个质粒拷贝每毫克组织的敏感性。使用标准稀释的质粒,质粒拷贝数每毫克组织可以计算。

整个身体的药物动力学和biodistribution coNS3/4A DNA质粒由体内EP决心总共30新西兰白兔分成五组每组的三个男人和三个女人。所有的动物都收到70μg coNS3/4A DNA在0.3毫升的生理盐水由贝聿铭注入正确的TA肌肉。后立即注射,体内EP和两个60 ms的246 V / cm应用脉冲four-needle数组使用MedPulser DNA输送系统。天1、3、7、14和28疫苗接种后,2毫升的血从耳动脉,获得后的动物被安乐死。样本肝、肾(左和右)、脾脏、心脏、卵巢、睾丸、回肠、肠系膜淋巴结,大脑,和左、右TA肌肉解剖,分成两部分,0.5∼1 g组织的每个部分。立即组织样本在干冰冷冻。血液和组织样本存储在−70°C到分析。coNS3/4A质粒DNA的存在被qPCR量化在血液、血清和所有器官组织,收集了如上所述。

左、右鼠标TA的渗透CD3肌肉进行了分析⁺T细胞通过免疫组织化学和NS3蛋白表达。助教的肌肉在缓冲4%甲醛溶液固定,脱水,嵌入在石蜡。嵌入组织被分组为4 - 6-μm部分。部分被安装到玻璃幻灯片,沾着他走时,一个Ab CD3(克隆A0452;DakoCytomation),或从coNS3/4A血清DNA-immunized兔子如前所述(24)。

NS3蛋白的表达在左翼和右翼TA分析了兔子的肌肉肌肉组织使用一个immunoprecipitation-Western污点过程前面描述的(24)。NS3蛋白的存在被发现后,可见乐队紧张不溶性底物。墨迹与GeneGenius凝胶文档相机拍摄(Syngenic)和带强度测定使用GeneTools微。根据乐队每个乐队都归一化强度的积极控制。< 20%的积极控制的强度由小仓鼠肾(博鸿泰)瞬变coNS3/4A质粒转染的细胞被认为是- NS3蛋白。

急性毒理学研究中使用了24只兔子(新西兰白色)组成的12个女性和12个男性分成三个小组每组四个女性和四个男性。coNS3/4A DNA(70或700μg)在盐水或生理盐水就由一个即时注入(0.3毫升)如上所述。同样,所有动物的体温测量研究和前两次在0,4,疫苗接种后24小时跟着重复测量每24小时7天。疫苗接种后7天,血从耳朵获得动脉和收集在钾EDTA管或血清管使安乐死。白细胞的血液样本进行了分析,血红蛋白、红细胞比容、血小板(昆泰)。天冬氨酸转氨酶的血清样本进行了测试,丙氨酸转氨酶、胆红素、白蛋白、肌酐,乳酸脱氢酶,γ-glutamyl转移酶,钾,钠,葡萄糖(昆泰)。同时,肝、肾、心、脑、脾、卵巢、睾丸、回肠,肺癌、肠系膜和腋窝淋巴结,注射部位进行组织学评价。器官在缓冲4%福尔马林固定,脱水,石蜡和嵌入。嵌入组织被分组为4 - 6-μm部分。的部分被安装到玻璃幻灯片和沾染了)。 All sections were evaluated for histopathological changes that could be related to the treatment by an experienced pathologist.

在重复的毒理学研究中,八组男性或女性兔子免疫如上表示总共五次在每月的间隔。一个月后过去的疫苗接种,动脉血液之前获得了安乐死。血液样本,血清样本,分析了器官一样的急性毒性研究。

四组小鼠接种一次正确的助教肌肉工作0和0.5所述,5,或50μg的DNA。在一组小鼠免疫皮肤2μg coNS3/4A DNA通过基因枪如前所述(26),一组老鼠收到即时消息注入生理盐水。同时,一群老鼠收到50μg coNS3/4A-DNA贝聿铭没有接受体内EP。两周后接种疫苗的老鼠接受了水动力喷射coNS3/4A质粒,如前面描述的(24)。通过这种治疗肝细胞(主要是肝细胞)是permeabilized的质粒和表达NS3/4A复杂(24)。存在NS3/4A表达决心72 h后immunoprecipitation-Western吸干如前所述(24)。墨迹与GeneGenius凝胶文档相机拍摄(SynGene)和带强度测定微使用GeneTools (SynGene)。根据乐队每个乐队都归一化强度的积极控制(100%;细胞溶解产物从NS3/4A-transfected博鸿泰)。强度的< 20%的积极控制被认为是消极NS3蛋白。NS3/4A-positive肝脏被数的组之间的比较。

老鼠和兔子Abs NS3的检测酶免疫分析法进行了基本描述(25,26)。Ab滴度测定最后血清稀释给三倍的OD在405 nm OD在同一没有免疫动物血清的稀释。

裂解的ctl免疫小鼠中发现个别老鼠脾脏使用标准4 - h⁵¹Cr-release化验使用NS3 peptide-loaded RMA-S靶细胞如前所述(25)。γ-IFN-producing ctl和Th细胞NS3合并脾细胞和淋巴结中发现文化的有关酶联免疫斑点试验商用描述(8)。总之,每组的脾脏和淋巴结汇集并立即检测丙肝病毒NS3-specific T细胞的存在。的能力NS3-specific Th和ctlγ-IFN被重组NS3蛋白(rNS3;请提供d·l·彼得森博士,里士满,弗吉尼亚州联邦大学)和H-2k^b限制NS3-derived CTL肽,如前所述(33),是由使用有关酶联免疫斑点试验商用。γ-IFN-producing细胞或斑点的数量确定在每个蛋白质或肽的浓度,结果得到每10γ-IFN-producing细胞的数量⁶细胞。平均数量的γ-IFN-producing细胞< 50每10⁶细胞被认为是消极的。

增生性反应NS3兔全血测定。总共4毫升的全血从每只兔子的耳朵动脉立即获得第一次疫苗接种和2周之前每次接种疫苗和在肝素管收集后,等离子体和PBMCs被梯度离心分离。等离子体是储存在−80°C到NS3-specific Abs通过酶免疫分析法分析。PBMCs立即化验了体外增殖召回响应使用标准96 - h扩散试验(34)。简言之,微型板块被播种与200000细胞和细胞培养介质,PHA或rNS3。72 h后放射性增加了胸苷和24 h后,细胞收获。决心从放射性的细胞增殖细胞的cpm孵化与Ag)除以细胞培养介质的cpm(示例- (S / N)比率)。组比较的意思是S / N比率在每个时间点。

进行了统计比较使用StatView 5.0 (3/20/98, PC版;11.2.5 SAS研究所)和Excel: Mac(版本;对Macintosh微软)软件包。使用学生的参量的数据进行了比较t测试(StatView和Excel),使用Mann-Whitney nonparametrical数据比较U测试(StatView)。频率比较用确切概率法(StatView)。

质粒DNA的分布在肌肉组织决心在老鼠身上注射混合泳的50μg萤火虫荧光素酶报告质粒没有体内EP或coNS3/4A DNA有或没有体内EP。使用荧光素酶报告质粒表达使用体内成像和监控的分布coNS3/4A-DNA被qPCR监控组织收获为0.5,注射后24、48和72 h。表达荧光素酶的记者从3 h到20天,进行了分析和表达才发现在注射部位出现的(无花果。1)。符合这是最高的质粒检测水平在注射部位出现的有或没有体内EP,但体内EP水平1或2日志₁₀更高的(图。1)。惊人的高水平的质粒中恢复大腿肌肉和侧TA肌肉注射后30分钟,无论体内EP是管理(无花果。1)。noninjected腿的DNA水平可比无论体内EP(图的使用。1)。DNA水平的股四头肌肌肉似乎减少比TA肌肉速度更快,和一些几乎是负面的DNA已经在72 h后注入(无花果。1)。由体内成像,其他组织都没有检测到表达荧光素酶的记者在任何时间点(无花果。1)。因此,DNA含量在注射部位出现的似乎每天减少1日志,而在注射部位质粒可以通过每天3日志。快速消除质粒的其他肌肉组织表明,质粒迅速退化时不会在细胞核表达。另外,我们只能检测DNA适度(∼5×10⁴拷贝/毫升)在小鼠体内的血清免疫后30分钟(数据未显示),这表明等离子体间隙非常快速。有趣的是,只有测试肌肉水平接近的注入的大腿肌肉注射腿(图。1)。这表明,至少在老鼠体内EP可能超越的注入。

测试是否体内EP提升长期持久性的质粒DNA在注射部位出现的,六组小鼠接受两个月注射0,0.5,5,或50μg coNS3/4A的助教后跟体内EP或50μg coNS3/4A没有体内EP。60天最后一次注射后,所有的老鼠都牺牲和TA治疗肌肉被收集和分析供qPCR质粒DNA的存在。质粒DNA只有一半的恢复肌肉接受最高剂量的DNA,独立于体内EP。体内EP-treated组质粒拷贝数是52岁,55岁和72质粒拷贝/μg总DNA,在体内EP组没有得到相应的数据47和378质粒拷贝/μg总DNA。因此,没有证据表明体内EP促进coNS3/4A质粒的持久性。

我们接下来研究的影响在老鼠体内EP NS3/4A表达和局部炎症反应在注射部位出现的和侧TA肌肉。炎症反应或NS3表达式从未发现的noninjected侧TA肌肉(数据未显示)。在注射部位出现的,针和生理盐水就造成组织损伤最小可检测在第三天(无花果。2)。50μg coNS3/4A DNA的注射局部炎症引起的,再生,纤维化在天3和7,扩展到< 50%的部分区域(图。2)。NS3表达式,通过免疫组织化学方法检测到临近的部分,在第三天达到顶峰,几乎是在第七天(无花果。2)。NS3已经消失了的表情,和当地的炎症反应在第14天几乎完全解决(无花果。2)。与体内注入coNS3/4A-DNA EP的结合提高了局部炎症,再生,和纤维化,以及NS3-expressing肌肉纤维(图的数量。2)。蛋白质的表达达到天3 - 7,下降了14天,得多和当地的损害是解决白天14(图。2)。重要的是,炎性浸润在包含大部分CD3注入肌肉⁺T细胞(图2)。渗透CD3的程度⁺T细胞在注射部位出现的比较三组之间在7和14天(无花果。2)。这显示一个渗透CD3显著增加⁺T细胞两次当使用体内EP。因此,增加体内EP和延长Ag)表达以及炎症和CD3的渗透⁺T细胞,随后,组织损伤。这些因素可能分析协助启动使用体内EP的免疫反应。

当地组织损伤也检查组织的老鼠研究长期持久性的质粒DNA在第二个月注射后60天。在最高剂量,有或没有体内EP,组织学检查显示没有一个温和的变性、坏死和炎症,无人轻度纤维化,一般温和的再生。完全或几乎完全一致的间隙注射质粒,这代表整个组织在注射部位出现的图片,与正在进行的再生晚但不完全成熟的阶段。因此,重复治疗高剂量的coNS3/4A DNA和体内EP没有导致组织损伤。

详细分析biodistribution和间隙的单一注射后70μg coNS3/4A DNA进行了兔子。正如所料,最高的质粒拷贝数检测在24 h,在注射部位出现的水平之后,迅速在第一周(图有所下降。3和数据未显示)。符合老鼠的实验中,我们发现DNA也可以恢复从侧TA肌肉在第一个24小时,但以低得多的水平(数据没有显示)。28天后,低水平的DNA被发现只有在TA的肌肉,显示一个正在进行的间隙(数据未显示)。一个助教肌肉> 10⁵DNA复制/毫克组织在28天(无花果。3和数据未显示)。非常低的质粒拷贝数< 10²拷贝/ mg偶尔发现右肾,侧TA肌肉,回肠,和一个大脑(数据没有显示)。因此,大多数的注射质粒被找回的注入和下级的侧TA肌肉。质粒DNA很少,在随机时间点,从其他器官中恢复过来。绝大多数(> 99%)的注射DNA似乎已经被清理后的第一个星期注射,其余的似乎是14和28天之间的某个时候。

再次与老鼠的结果一致,我们发现NS3蛋白表达检测只有在注射部位出现的(无花果。3和数据未显示)。NS3蛋白表达水平3天后达到顶峰,成为探测不到28天(无花果。3)。在小鼠中,侧TA一直为蛋白表达阴性(数据没有显示)。因此,在老鼠和兔子注射DNA分布在骨骼肌注射部位出现的外面,而蛋白表达一直局限于注射部位。

在急性毒理学研究兔子都被赋予了一项单一剂量的coNS3/4A质粒或生理盐水使用体内EP单独管理,和所有的动物都牺牲了7天后。体温低于低95%置信区间的未经处理的动物观察注射后4小时;这可能是解释动物的麻醉注射期间,通常会导致失去温度控制(数据没有显示)。血液学治疗组无显著差异(数据没有显示)。临床化学显示,除了血糖水平在女性(p= 0.0097;盐水vs 70μg DNA)和乳酸脱氢酶水平在男性(p= 0.0376;盐水vs 70μg DNA),治疗组之间没有明显的统计学差异。

组织病理学显示没有病变符合影响疫苗的注射部位组织以外的所有动物牺牲时1周后注入(表我)。动物从所有三个治疗组显示,除了少数例外,某种程度的变性坏死、炎症、纤维化或再生注射部位,清楚地表明体内EP单独引起局部炎症反应和组织损伤(表我)。这是完全符合从小鼠的实验研究结果。最明显的变化观察肌肉接受DNA,这表明质粒DNA, NS3蛋白,或者两者都增加了炎症(表我)。重要的是,我们已经表明,2周后质粒已经几乎完全消除和NS3蛋白表达水平较低(图。3和数据未显示)。在老鼠,我们观察到这些变化很可能引发的治疗,Ag, Ag-specific免疫反应后第一周内免疫。因此,DNA的存在和NS3/4A蛋白体内EP一起提高了局部炎症,最有可能的一个因素有助于解释相结合的免疫原性。

在重复的毒理学研究中,体重变化类似团体之间在整个研究中,性别是一个指示器,大多数动物在实验期间健康状况良好。血液学数据显示治疗组之间没有显著差异。临床化学显示统计学意义差异只有在葡萄糖,乳酸脱氢酶,和钾在雌性(数据未显示)。然而,这些参数的实际差异在每个小和最有可能的生物学意义。

不符合毒性观察病变器官进行组织病理学检查,除了当地的观察在注射部位出现的影响。肌肉注射某种程度的变性坏死、炎症、纤维化和再生是所有组中观察到的动物(表我)。再一次,很明显,体内EP本身引起的组织学反应加剧的疫苗,因为最明显的变化被发现在动物治疗剂量和EP 700 -μg DNA。重要的是,更少的动物体内,只有接收缓冲区和EP的迹象显示炎症在注射部位出现的与团体接受coNS3/4A-DNA相比(表我)。因此,体内EP本身引起轻微的组织损伤,但DNA的存在和/或NS3/4A蛋白表达增加炎症反应在注射部位出现的原因。这是完全符合观察免疫小鼠和以前的观测使用体内EP (35),是可以预料到的关于接种疫苗。最后,重要的是要注意,在注射部位出现的当地的损害是更加明显在1周后一个注射相比,一个月后第五注入在同一站点(表我)。这表明重复治疗相同的站点不加重局部组织损伤。

对NS3 Ab的水平,一个明确的剂量反应关系被认为与不同剂量的疫苗接种后coNS3/4A-DNA管理有或没有体内EP(无花果。4)。主要的促进效应被第二次免疫后,而第三次注射后提高效果不明显(图。4)。没有差异意味着Ab之间的水平被认为50 -和5-μg剂量使用时体内EP(无花果。4)。0.5 -μg与体内EP诱导剂量给予相同的水平意味着NS3-specific Ab 50-μg剂量没有体内EP交付。然而,这两个都低于50 -和5-μg剂量组收到体内EP(无花果。4)。总之,体内EP使coNS3/4A dna免疫∼100倍更有效对Ab响应,支持的好处由体内EP佐剂效应。

老鼠的启动NS3-specific溶解性ctl决心通过肽脉冲RMA-S细胞标准⁵¹Cr释放试验。50的两个高剂量组和5μg coNS3/4A-DNA由体内EP都同样免疫原性(图。5)。两周后的第一个启动CTL反应没有任何剂量组(图之间的区别。5)。然而,在第二次剂量的剂量组收到体内EP CTL活性较高与组相比没有收到体内EP(无花果。5)。第三次注射后,0.5的CTL反应-μg组接收EP和50-μg组没有得到EP似乎削弱(图。5)。因此,coNS3/4A-DNA由体内EP显然具备持续溶菌性CTL反应。有趣的是,这些数据表明,重复次优交付或剂量没有'持续溶菌性CTL反应。

的启动γIFN-producing NS3-specific Th细胞和ctl有关酶联免疫斑点。是由γ-IFN-producing届和ctl,结果符合观测NS3 Abs和溶解性ctl。第一次剂量后,γ-IFN-producing脾Th和ctl在所有组比较,而弱反应最高剂量组淋巴结只是看到收到体内EP(图。6)。第二个剂量后,三组收到体内EP有相当数量的γ-IFN-producing Th细胞和ctl在脾脏和淋巴结(无花果。6)。组中重要的是,没有得到体内EP脾反应较低,仍没有反应检测淋巴结(无花果。6)。在第三个剂量两个最高剂量组脾脏同类反应> 1000点形成细胞(证监会)10⁶细胞召回的最高稀释CTL肽或rNS3。在淋巴结,两组>每10 500香港证监会⁶细胞召回的最高稀释CTL肽或rNS3(无花果。6)。相比之下,接受50-μg剂量没有体内EP通常有低ctl和rNS3-recalled证监会在脾脏和淋巴结T细胞反应的非常低(无花果。6)。甚至100倍低剂量致敏γ-IFN-producing Th细胞DNA和ctl更有效地交付时体内EP(无花果。6)。因此,很明显,体内EP的佐剂效应改善的启动γ-IFN-producing NS3-specific Th细胞和ctl在脾脏和淋巴结。重要的是,这些差异是维护甚至第三个剂量后,建议增加数量的剂量不能代替体内EP提供的辅助效果。有趣的是,次优剂量缓慢导致越来越多的γ-IFN-producing T细胞裂解活性减弱。

关于hepatotropic感染、重要性的确定vaccine-primed免疫反应可以进入肝脏和明确的“感染”或Ag-expressing肝细胞。清除丙肝病毒NS3/4A-expressing肝细胞因此进行接种小鼠使用水动力喷射技术(36)。简而言之,如果一个功能CTL反应已经准备通过接种疫苗,这些细胞将进入肝脏和清晰的丙肝病毒NS3/4A-expressing肝细胞(24)。我们可以通过这种方法,表明在未接种疫苗的老鼠的肝脏都是阳性NS3/4A-expression 72 h后水动力喷射是由免疫组织化学和immunoprecipitation-Western污点(无花果。7)。50组接收5或0.5μg coNS3/4A DNA与体内EP组收到50μg的DNA没有体内EP,肝脏都为阴性NS3/4A-expression在同一时间点(无花果。7)。在一组接受2μg coNS3/4A-DNA皮肤利用基因枪,除了一个是阴性肝NS3/4A表达式(无花果。7)。所有接种组与NS3/4A-expressing频率显著降低小鼠肝脏后72 h组与不接受疫苗接种(无花果。7;p< 0.05,确切概率法)。因此,单一接种coNS3/4A DNA素数检测NS3/4A-specific ctl ctl输入函数体内的肝脏和清晰的丙肝病毒Ag-expressing肝细胞。这是行动的机制,需要在治疗丙肝病毒疫苗。

兔子接收5与coNS3/4A DNA疫苗,我们也决定了NS3-specific Ab PBMC的水平和增生性反应。没有区别的动力学或水平NS3-specific Ab之间的反应组接收70μg(0.02毫克/公斤体重)或700μg(0.2毫克/公斤体重)剂量的coNS3/4A DNA(图。8)。Ab终点峰值浓度从10⁴到10⁵在三个或四个注射(图后达到。8)。感兴趣的注意,NS3-specific终点浓度对小鼠接受绝对剂量的5-50μg DNA或多或少获得的相同的兔子获得绝对剂量的70μg DNA(无花果。4和8)。这表明体内EP可以帮助保持同样的剂量的免疫原性coNS3/4A DNA疫苗在较大的动物。

我们也试图确定NS3-specific增生性反应兔子。不像老鼠,兔子的自发扩散水平要高得多,这使得分析更加复杂。这个分析显示,可检测NS3-specific扩散实际上是检测(无花果。8)。重要的是,意味着NS3-recalled扩散一直高组收到70 - 700μg剂量的coNS3/4A DNA与对照组相比,只有收到体内EP(无花果。8)。因此,尽管高背景很明显,疫苗接种也影射体外检测T细胞反应的兔子。

大量的研究表明,丙肝病毒感染的间隙和控制与一个强大的γ-IFN-producing, NS3-specific T细胞反应(2,3)。NS3/4A复杂也似乎是至关重要的维持病毒持久,因为复杂的可以抑制信号引起的双链HCV RNA的存在被感染的肝细胞(13)。因此,它可能会认为RNA-based向量可能比dna不适合向量提供NS3/4A基因。许多研究已经测试了包含NS3蛋白疫苗,从标准重组NS3蛋白(37),然后搬到贝聿铭注射DNA (26,34,38,39,40)和基因枪的DNA (26),再(25)、痘病毒(41,42,43)、腺病毒(19,44,45)和沙门氏菌(46)。考虑这些病毒载体系统的复杂性,的DNA可以在大规模生产,DNA证据确凿的稳定性和安全性,和独立的质粒DNA可能干扰通过NS3/4A dsRNA-triggered反应,使用DNA似乎青睐。事实上,最近表明,病毒dsDNA但不是双链圆形或线性质粒DNA,可以通过RIG-1诱导信号(47),这表明质粒DNA是真正独立的途径,从而进一步支持交付NS3/4A基因的DNA。此外,众所周知,一旦感染丙肝病毒已经被清除肝脏,肝脏再生和严重肝脏疾病的风险回到基线。因此,这表明一个瞬态存在的本地丙肝病毒蛋白质不会引起永久性的肝损伤几十年来,尽管他们可能与宿主细胞相互作用的可能性。基于上述发现,我们选择开发一个coNS3/4A-based疫苗(25)在盐水中使用裸DNA。

治疗丙肝病毒疫苗的主要目标是,它应该激活NS3-specificγ-IFN-producing Th细胞和ctl进入感染肝脏,帮助主机控制感染。因此,从疫苗的角度NS3-specific的激活Abs最有可能不重要,但见此处NS3 Abs的激活可能是一个良好的免疫原性疫苗是如何在一个读出天真的主机。所以疫苗交付应该如何获得这些反应呢?首先,疫苗应该诱导内源性表达的免疫相关的组件,因为这样可以确保Th细胞和ctl的启动(27)。接下来,免疫应尽可能的免疫原性,因为它'或增强免疫反应一个被感染的人已经存在。因此,疫苗接种计划最有可能应该包括一些类型的辅助,可以设置'这些反应的慢性感染。因此我们评估的总体影响交付丙肝病毒coNS3/4A DNA通过使用体内电穿孔,交付系统确实在几个方面作为一个强有力的辅助。

我们最近表明NS4A代数余子式的包容和NS3基因的密码子优化提高了内在的免疫原性,增加蛋白质的持久性和/或基因表达(25,26)。当使用这种基因我们立即指出,coNS3/4A-DNA疫苗的免疫原性是极大地增强了体内时由EP。虽然高出100倍浓度没有体内EP,使用0.5 -μg剂量的coNS3/4A-DNA管理与体内EP激活完全可比,有时甚至更好的免疫反应。这支持这一概念,大大加强了coNS3/4A-DNA的功效结合体内EP,观察使用其他Ags是一致的(29日,48,49)。

我们识别机制可以作为参与体内EP的佐剂效应?两个因素发挥明显的作用:吸收的增加质粒DNA和蛋白质表达水平的增加,增加了整体的Ag)的启动免疫反应。然而,另外两个因素很可能同样重要的是:当地的组织损伤和muscle-infiltrating CD3的招聘⁺细胞。因此,机械化高度局部组织损伤和蛋白质表达导致的炎症反应,最有可能协助CD3的启动和招聘⁺细胞。这不能排除一些启动甚至可能发生在肌肉组织如果适当的costimulatory分子存在,直接或通过cross-presentation。这应该是进一步详细研究。

体内EP改善所有测试的分支NS3-specific免疫反应。重要的是,坚持裂解的启动和γ-IFN-producing Th细胞和ctl显然提高了体内EP,又完全符合之前的报告(19,48)。最近的数量表明,γ-IFN证监会脾在使用中发现丙肝病毒NS3-NS5 DNA疫苗体内EP大大提高了(19)。然而,现在我们可以表明体内EP-supported疫苗接种的主要效应是存在丙肝病毒的证监会在脾脏和淋巴结。例如,三个50-μg剂量的coNS3/4A DNA启动γ-IFN-producing Th ctl细胞在脾脏和淋巴结,达到每百万细胞前体的频率> 1000香港证监会在两个隔间。相同的剂量没有体内EP只有具备这样的反应,虽然弱,脾。符合这个结果,我们发现脾脏中的溶解性CTL反应更强,保持体内EP后使用更长的时间。在缺乏体内EP,裂解反应随时间消退,即使相同的剂量服用了三次。综上所述,这表明,确保CTL的维护活动足够水平的免疫刺激需要重复,而重复启动不足会导致反应减弱。这个观察需要进一步探索,因为这可能影响正确启动的记忆T细胞。

也是重要的地址的体内功能启动免疫反应。因此我们设计实验来解决是否启动免疫反应可以进入肝脏和清晰的暂时性的转基因体内肝细胞(24)。小鼠免疫一次,2周后他们收到了水动力注入coNS3/4A DNA产生NS3/4A-expressing肝细胞免疫介导的间隙。与coNS3/4A-DNA这表明单一疫苗接种,在剂量范围从0.5到50μg,贝聿铭结合体内EP影射NS3/4A-specific ctl体内功能。因此,vaccine-primed ctl进入肝脏,清除肝细胞表达HCV Ags。

coNS3/4A DNA由体内EP被发现高免疫原性,因为疫苗的目的是为人类使用,因此我们决定联合疫苗的安全性。这些研究包括药物动力学和biodistribution表达质粒和蛋白质,以及毒性研究在老鼠和兔子。一般应采取目标是,DNA疫苗和表达所需的网站,质粒DNA水平应该逐渐减少。几项研究已经发现,确实是这种情况(50)。此外,虽然质粒整合到宿主基因组可能发生,这是一个非常罕见的事件;可能甚至比天然gene-inactivating不太常见的突变(51)。

我们可以表明一个贝聿铭注射质粒结果在高度本地化的吸收和体内注射DNA的表达无论EP是管理。然而,体内EP极大地增强了DNA,蛋白质表达水平,炎症的程度,,如前所述,启动免疫反应的强度。在老鼠和兔子质粒的复制数字峰值都发现后立即在注射部位出现的注入。在老鼠和兔子大多数质粒是清除前3 - 7天内,将发现使用其他质粒(52,53)。这与先前的报道是一致的建议很短的半衰期免费质粒DNA,最有可能的是通过肝脏中第一段(50)。小吃惊的是,大量的质粒也可以检测到在noninjected侧TA肌肉和其他周围的肌肉在老鼠或兔子。然而,用荧光素酶报告基因或检测NS3蛋白免疫印迹我们只能够发现在注射部位出现的表达式。因此,DNA水平较低侧部位或周围的肌肉似乎并不足以被产生可检测蛋白表达。与目标一致的质粒和蛋白质表达的注入,我们并没有发现证据表明质粒的分布到全身。只有低水平的质粒从几个器官随机时间点恢复。因此,大多数质粒似乎从注射部位清除后的第一个星期注射,其余的似乎是几乎完全清除身体14-28日内形式。时我们可以显示,质粒是由两个月注射小鼠在接种剂量的0.02或0.2毫克每千克体重使用体内EP,质粒是清除后60天最后注入看成由qPCR决定。在剂量的2毫克/公斤体重最多50%的老鼠非常低水平的持续质粒在注射部位出现的无论体内EP被使用。这支持组合的安全并符合其他报告显示,大多数质粒从注入(一般在60天内消失53)。此外,这些数据也支持通过最近的一项研究表明,体内EP甚至减少质粒的持久性和高分子量DNA无关(54)。这可能是解释时集成是最可能的假设质粒拷贝数存在于细胞高。然而,同时这个细胞将感兴趣的基因的高表达,这使得细胞启动免疫反应的一个完美的目标。因此,存活细胞的风险与整合质粒DNA是最有可能很低,当体内EP。

毒理学检查的结果完全符合biodistribution质粒的蛋白质,因为唯一的病理检测是位于注入和蛋白表达。此外,在新开发的转基因小鼠的肝脏表达NS3/4A我们不能发现任何自发出现肝脏组织学变化或其他肝脏疾病的迹象(55)。重要的是,很明显,体内EP本身引起局部组织损伤,表明治疗有两个效果:增加质粒DNA和蛋白质的摄入表达和作为佐剂在注射部位出现的。这最有可能有助于解释体内EP的效率。质粒的拷贝检测侧控制肌肉导致蛋白表达和导致局部炎症或组织学变化。因此,即使在外面的情况下当检测到质粒注射部位出现的这并不是导致这些细胞变得可检测免疫介导性攻击的目标。这支持了质粒在注射部位出现的不是有效地吸收和表达。

总之,我们已经表明,coNS3/4A基因可以有效地交付使用体内EP,导致广泛的免疫反应的激活。希望结合能够激活足够强大的免疫反应在任何本地,“沉睡”,或灭活的CD4细胞⁺和CD8⁺T细胞守恒NS3蛋白和协助的主机在控制感染。

副教授Kå再保险Bondesson设计qPCR欣然承认,迈克尔•利未生成合成肽的博士和玛莉特•Bjon-Holm副教授Björn Rozell准备和执行鼠标肌肉的组织学检查。

硕士是一个董事会成员和顾问Tripep AB支付。j.s,上面,和M.F. are employees of Inovio Biomedical Corp. T.T. and I.M. are employees of Inovio A/S.