IL-24转基因老鼠:体内的证据IL-20重叠功能,il - 22生成,IL-24表皮

完善,新发现IL-20家族细胞因子的信号通过heterodimeric细胞表面受体组成的四种类型的受体亚基,IL-20R1, IL22R1 IL-10R2, IL-20R2 (1,2)。与IL-10R2 heterodimeric受体亚基不同,heterodimeric受体组成的IL-20R2很滥交,IL-19, IL-20, IL-24能够绑定到信号通过IL-20R1 / IL-20R2和IL-20 IL-24也能够通过IL-22R1 / IL-20R2(信号3,4)。因此,这些细胞因子之间的重要受体共享基于体外生化分析与培养细胞质疑三个细胞因子是否有多余的体内生物功能或他们是否可能使用相同的受体为不同生物组织或暂时监管的方式结束点。

证据支持的受体表达模式,角质细胞已确定的主要靶细胞类型IL-20家族细胞因子(4- - - - - -7)。体外试验使用重组人表皮证明IL-19 IL-20, IL-24,除了il - 22生成时,信号通过IL-22R1 / IL-10R2,都能诱发棘皮症,S100A7 (psoriasin)表达和Stat3激活(8)。体内,异常过度IL-19、IL-20 IL-24已经发现在人类银屑病皮肤组织IL-19和IL-20 keratinoytes所表达的,而IL-24由浸润的单核细胞(9)。IL-23表皮增生引起的皮内注射,一个主要的细胞因子参与银屑病,显示是由IL-19和IL-24,但不是IL-20 IL-20R2-dependent地(10)。然而,令人信服的功能性证据体内转基因(Tg)小鼠模型到目前为止只有IL-20和il - 22生成直接在表皮增殖和分化(5,6),而据称IL-19 Tg小鼠皮肤并没有表现出任何明显的表型(11)。相比之下,受体结构依据IL-19之间共享,IL-20, IL-24没有详细调查。总的来说,这三种细胞因子之间的氨基酸序列同源性只是∼20 - 35% (2,3)。虽然IL-24也能够显示绑定到IL-20R2仅表达在细胞表面信号(没有能力4IL-19和IL-24),但不是IL-20,据说可以绑定到一个二聚的可溶性IL-20R2-Fc (sIL-20R2-Fc)融合蛋白亲和力较低与本机heterodimeric受体(11)。

在这项研究中,我们表明,IL-24 Tg老鼠针对皮肤表现出许多表型相似IL-20和il - 22生成对表皮增殖和分化产生深远的影响。我们表明,IL-24 Tg老鼠,浸润的巨噬细胞被发现聚集在皮肤层表皮下的,这与MCP-1感应两角化细胞在表皮和真皮浸润白细胞层。此外,我们证明sIL-20R2-Fc融合蛋白可以绑定到IL-24,但不是IL-19 IL-20,亲和力高,是一个强有力的IL-24拮抗剂。

HEK 293 t细胞系表达AP(碱性磷酸酶)融合蛋白,因为(GenHunter E5细胞。纳什维尔,TN),和婴儿仓鼠肾(博鸿泰)21 (IL-20R1 / IL-20R2)细胞株培养如前所述(4)。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达sIL20R2-Fc培养在IMDM(表达载体,圣地亚哥,CA),含有10%的边后卫(正在亚特兰大生物制剂,GA)和1% penicillin-streptomycin。无血清的生产sIL20R2-Fc进行摇瓶培养的细胞在SFM4CHO介质(Hyclone,洛根,UT)。

用于创建IL-24 Tg老鼠针对皮肤,全身FISP cDNA克隆(加入基因库。BB867056)购买的理化学研究所和中心,东京,日本。完整的鼠标IL-24(编码区12)是PCR扩增和subcloned NheI pK5哺乳动物表达载体在牛的角蛋白5催化剂控制(13)。显微镜下注射前的构造被测序验证。代IL-24 Tg老鼠是由范德比尔特Tg鼠标/ ES细胞共享资源。简单地说,女性B6D2老鼠从哈伦(印第安纳波利斯,)3 - 5周。这些女性都是超数排卵和胚胎生产和B6D2雄性交配。幸存注射的胚胎转移到cd -伪插女性的输卵管(查尔斯河实验室,马威尔明顿)。

0.5厘米的小狗尾巴和蛋白酶K消化(20μg /毫升)和孵化隔夜50°C-55°C和温柔颤抖,其次是异丙醇沉淀。基因组DNA然后用70%的乙醇清洗,溶解在100毫米Tris-HCl, pH值8.0 450 - bp特定片段FISP转基因被使用引物PCR检测,l-fisp: 5′-GCTAGCTTCCCACCCAGCAGAAGATC-3′, 5′末端FISP和免疫印迹R-ext: 5′-GAATGACCTCAAGACCTTGAATTTG-3′, 3′末端克隆免疫印迹牛的角蛋白5表达载体。130 - bp控制基因组DNA位点出价被引物扩增,17 b14: 5′-CCGAAATGTCCCATAAGAG-3′坐落在小鼠基因内区附近3 E3 / I3边界和17 b12: 5′-GAGATGGACCACAACATC-3′位于外显子3。

IL-24 Tg小狗的背上的皮肤样本(新生儿致命)和正常控制的同胞(1 d)在10%中性缓冲福尔马林固定,石蜡包埋,切片5μm和沾染了)。免疫组织化学,部分患者,放置在加热目标检索解决方案(DakoCytomation Carpinteria, CA) 20分钟。内源性过氧化物酶活动就熄了0.03%过氧化氢和一块蛋白质治疗(DakoCytomation)之前执行主Ab之外。组织孵化了兔子anti-rat IL-24 Ab (14在1:50 0稀释,anti-keratin 6 Ab (Covance研究产品,普林斯顿,纽约)1:20 00稀释anti-keratin 5 Ab (Covance研究产品)在1:50 0稀释,或反- ki - 67 Ab(向量实验室,伯林盖姆,CA) 1:20 00稀释为60分钟,或鼠anti-mouse F4/80 (Serotec、罗利数控)一夜之间在1:50稀释。山羊anti-mouse CD3(目录sc - 1127;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)和山羊anti-mouse MCP-1(目录ab - 479 na;研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州)都在1:50 0稀释使用。兔子想象+ /轻拍+系统(DakoCytomation)和Dako想象+合/民建联系统(DakoCytomation)用于生产本地化,与相应的二次Abs染色可见。幻灯片是轻和迈耶的苏木精复染色,脱水,安装盖玻片。

原位定量和受体结合研究老鼠组织,博鸿泰细胞稳定表达IL-20R1 / IL-20R2,暂时,因为E5细胞转染IL-20R1 / IL-20R2表达向量进行了使用美联社分析试剂和美联社分析试剂(GenHunter),分别如前所述(4)。

生成sIL-20R2-Fc融合蛋白,细胞外领域的完整的人类IL-20R2 (5)是PCR扩增和subcloned BglII和HindIII网站pGH-hFc向量(GenHunter)允许与人类免疫球蛋白Fc sIL-20R2 infame融合。测序结果验证了表达载体,转染CHO细胞无血清培养系统对融合蛋白的生产。sIL-20R2-Fc是纯化的同质性文化媒体使用MabSelect (GE健康科学,皮斯卡塔韦,新泽西)按照制造商的指示。纯化sIL-20R2-Fc透析在PBS之前用于配体抑制。

人类IL-24-AP前面描述的(14)。整个编码区域IL-19 IL-20 pcDEF3-IL-19和pcDEF3-IL-20 IL-19向量被使用引物PCR扩增,5′-AAGCTTGGTACCACGGTG-3′, 5′-AGATCTAGCTGAGGACATTACTTC-3′;IL-20, 5′-AAGCTTGGTACCTTAG-3′, 5′-AGATCTTTCTGTCTCCTCCATCC-3′。放大的互补是subcloned成pAPtag2表达载体(GenHunter) HindIII和BglII之间创建inframe融合后的细胞因子对人类胎盘美联社。构造完全验证了DNA序列序列anlaysis,美联社融合蛋白生成条件媒体后稳定转染293 t细胞。

条件媒体AP或人类IL-24-AP(在1 U /毫升)孵化与sIL-20R2-Fc 1 h在4°C。IL-24-AP / sIL-20R2-Fc复杂被单克隆美联社Ab-Sepharose珠子(GenHunter)或蛋白质A-beads (GE健康科学)。洗后用PBS, IL-24-AP / sIL-20R2-Fc复杂被免疫印迹检测到10% sds - page使用anti-AP兔多克隆Ab (GenHunter)或反Fc (Amersham,阿灵顿高地,IL),紧随其后的是相应HRP-labeled二级Abs (Amersham)。

理解IL-24体内的生物功能,生成IL-24 Tg老鼠使用鼠标IL-24 cDNA牛5角蛋白启动子控制下(图1一个)。正如所料,IL-24 Tg老鼠像IL-20许多表型,包括新生儿出生杀伤力的几小时内,较小的体型,和闪亮的外观和暗皱皮肤(图1 b)。皮肤组织学分析揭示了紧凑的角质层和表皮的Tg显著增生小鼠与野生型相比(WT)同窝出生的(图1 c),又类似于IL-20 il - 22生成Tg老鼠。平均IL-24 Tg老鼠的表皮是两倍厚的表皮WT控件(图1 d)。疣状与anti-murine IL-24 Ab确认扩散模式IL-24蛋白表达在皮肤(表皮和真皮层)的Tg老鼠,符合IL-24的本质是分泌细胞因子(图1 c)。

IL-24-AP ligand-affinity染色显示IL-24受体表达模式是不变的表皮的IL-24 Tg老鼠(图2一个),尽管表皮增生。此外,IL-24 Tg老鼠的表皮角蛋白保留5表达suprabasal和基底层除了毛囊,在正常对照组(图2 b)。提供进一步证据IL-24-induced角化细胞增殖,角蛋白6,这是常与角化细胞增殖(例如,在伤口愈合),和ki - 67,这是一个标记为增殖细胞,通过免疫组织化学方法也进行了分析。与WT控制相比,IL-24 Tg皮肤表现出强阳性染色在suprabasal和基底角质6层,就像在IL-20 Tg老鼠(5),而ki - 67染色是限制主要在基底层(图2 b)。这些结果表明,像IL-20和il - 22生成时,IL-24功能直接或间接为角化细胞的促分裂原体内和角化细胞异常增殖来源于表皮的基底层。

除了IL-24的戏剧性的影响在表皮角质细胞,其中一些类似表型观察到银屑病皮肤,我们还研究了是否有免疫Tg皮肤浸润。Immunohistological分析Abs与CD3和F4/80发现任何差异在浸润T细胞和巨噬细胞,分别。虽然小CD3-positive T细胞计数差异明显,大量F4/80阳性细胞检测的真皮IL-24 Tg幼崽(图3),类似于这个发现与il - 22生成时Tg小鼠(6)。除了几乎所有的表型表皮检查,浸润的巨噬细胞似乎IL-24之间的主要区别在皮肤和IL-20 Tg小鼠未发现免疫浸润(5)。因此,看来IL-24直接或间接诱导某些趋化因子,引起单核细胞的移植的皮肤层扩散keratinocyes之下。为此,我们首先关注MCP-1,一个主要的单核细胞化学引诱物与银屑病(15)。免疫组织化学染色和山羊anti-mouse MCP-1显示显著诱导MCP-1 IL-24 Tg与正常对照组相比皮肤组织(图3)。感兴趣的是发现,除了许多免疫浸润MCP-1呈阳性,整个表皮的角质细胞IL-24 Tg老鼠MCP-1分泌的来源(图3)

尽管Tg鼠标工作开始阐明复杂的受体相声中网络计划IL-20家族细胞因子,这些细胞因子的行动需要进一步解剖特定于单个细胞因子拮抗剂的可用性。帮助进一步理解生物功能的冗余度和滥交IL-20家族细胞因子受体使用,我们试图开发一个IL-24-specific拮抗剂。根据我们发现IL-24可以直接绑定到IL-20R2早些时候(4),我们设想,homodimeric sIL-20R2 IL-24信号可能是一个有效的拦截器。为此,我们融合了细胞外人类人类IgG1 IL-20R2 Fc的域。结果sIL-20R2-Fc CHO细胞融合蛋白表达和纯化的条件培养液通过蛋白质亲和列同质性。immunoprecipitation-Western污点和动态绑定的研究其细胞表面受体IL-20R1 / IL-20R2表明sIL-20R2-Fc的确是一个强大的粘合剂和拦截器的IL-24抑制常数11 nM (图4),这是类似的K_dIL-24本土heterodimeric受体(4)。有趣的是,对IL-19 sIL-20R2-Fc几乎没有影响,IL-20绑定IL-20R1 / IL20R2,即使使用浓度IL-24的10倍K_d,IL-24受体结合变得几乎完全受阻(图5)。

本质上相同的表型IL-20 Tg小鼠模型,il - 22生成和IL-24表明这三个相关细胞因子发挥冗余作用在角化细胞分化和增殖。表皮的厚度明显增加,同时减少角质层层在所有三个Tg老鼠也暗示hyperproliferative角质细胞或延迟角化细胞终端分化,或两者兼而有之。重要的是,描述IL-24 Tg老鼠还显示显著的巨噬细胞浸润在hyperproliferating表皮角蛋白的表达特征的6和ki - 67。虽然IL-20 Tg老鼠的一项研究没有显示任何皮肤浸润(5),il - 22生成时Tg小鼠免疫浸润注意到(6)。在这项研究中,我们能够跟踪的潜在原因巨噬细胞迁移到局部MCP-1生产在表皮角化细胞和免疫浸润聚集在下面的皮肤层。的确,角质细胞已被证明是人类posriasis MCP-1生产的主要来源,特点是巨噬细胞浸润,总是局限于皮肤层(15)。虽然我们的发现表明,IL-24可以直接或间接诱导趋化因子生产的皮肤Tg老鼠,它不一定证明MCP-1参与皮肤的表型观察,因为IL-20 Tg老鼠似乎缺乏任何免疫真皮浸润(5)。此外,在人类的牛皮癣,IL-24似乎渗透产生的单核细胞/ macraphages (9),所以趋化因子可能采取行动的上游IL-24首先,与Tg小鼠模型的研究结果。它也是有趣的,在先前的研究显示小趋化因子诱导IL-20和il - 22生成体外(6,16,17),没有归纳MCP-1 IL-24可以通过免疫印迹检测人工培养的角化细胞细胞系,HaCat(数据没有显示)。这些观察强调的重要性,研究复杂的细胞因子网络,参与皮肤炎症,如牛皮癣、在不同的细胞类型中发现皮肤进行交互。在人类的遗传屏幕单核苷酸polymorphasms IL-24, IL-20R1, IL-20R2位点显示没有迹象表明这些基因与增加银屑病易感性(18,19)。因此,必须谨慎,这些细胞因子的行为的泛化扩展到人类疾病以外的表型与Tg看到老鼠。

有趣的是,IL-19 Tg老鼠据称未能表现出任何明显的皮肤表型(11)。这些结果支持这一事实造成的表皮增生IL-20和IL-24可能介导通过IL-22R1 / IL-20R2 IL-19未能信号受体。符合这个预言是发现il - 22生成Tg老鼠也表现出相似的表型IL-20和IL-24 (6)。因为通过IL-22R1 / IL-10R2 il - 22生成信号,结合数据从这些Tg老鼠似乎表明,IL-22R1可能必不可少的中介角化细胞功能,这可能是不同于未被识别的生物功能通过IL-20R1 / IL-20R2介导的。这启示可能有重大影响,治疗自身免疫性皮肤病治疗策略。例如,治疗Abs IL-22R1可能优于Abs IL-20R2或heterodimeric可溶性receptor-Ig融合蛋白,因为针对IL-22R1可能同时阻止IL-20, il - 22生成,IL-24而不影响IL-19或信号通过IL20R1 / IL20R2。最近的可用性IL-20R2基因敲除小鼠(20.)、功能的IL-19 IL-20, IL-24都应该被废除,将有用的证实或排除这些细胞因子在表皮功能的重要性。同样,IL-22R1和IL-20R1基因敲除小鼠,一旦可用,将进一步查明或澄清IL-20生物功能的细胞因子在体内的家庭。

IL-24 Tg老鼠的结果进一步证实,IL-24 IL-20和是一个典型的细胞因子il - 22生成。虽然有可能IL-24可能诱导生长逮捕或某些类型的细胞体外凋亡(21,22),产后杀伤力和银屑病皮肤表皮增生的表型结果观察IL-24 Tg老鼠提高潜在的严重安全问题使用IL-24(也称为MDA-7之前显示为一个细胞因子)在基因治疗作为抗癌剂(1,23)。

我们发现二聚的sIL-20R2-Fc融合蛋白是一个强有力的IL-24-specific拮抗剂,在很大程度上是通过nonquantitative符合先前的估计和间接受体结合试验(测定荧光素酶记者),sIL-20R2-Fc的传说(没有实际数据支持)抑制IL-24和IL-19虽然不善而heterodimeric可溶性受体(11)。但是,与heterodimeric可溶性receptor-Ig融合,不能区分IL-24 IL-20 (11),我们的结果表明,sIL-20R2-Fc不仅可以更容易地产生,但也是一个强有力的IL-24-specific拮抗剂。尽管Tg IL-20老鼠研究支持一个重叠函数和IL-24在正常表皮分化,IL-23-mediated牛皮癣的老鼠模型(10)和研究人类牛皮癣组织样本(9)似乎表明,这两种细胞因子可能扮演不同的角色发展的自身免疫性疾病。因此,sIL-20R2-Fc的可用性和高特异性IL-24不仅提供更深入的理解的另一个研究工具的IL-20家族细胞因子,但也有可能治疗重要生物代理在处理自身免疫性疾病。

我们感谢Drs。天使拉米雷斯和谢尔盖Kotenko请提供牛5角蛋白表达载体和人类IL-19 IL-20 cDNA序列,分别。IL-24 Tg老鼠产生的协助下范德比尔特Tg /胚胎干细胞共享资源。我们也感谢Drs。莉莲Nanney和杰弗瑞·戴维森的建议和免疫组织化学的核心从范德比尔特的皮肤疾病研究中心组织染色。

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