协调互动IL-13集群和上皮分化基因在嗜酸性食管炎

嗜酸性食管炎(EE)是一个复杂的食管黏膜过敏性疾病的特点是allergen-induced嗜酸性渗透和上皮细胞增生(1)。然而正常的生长特性(NL)和EE上皮细胞在体外没有被研究过,有有限的数据对患者的食管上皮细胞的内在属性EE (1)。EE患者通常表现出症状模拟胃食管反流病(GERD),但是GERD和EE杰出缺乏组织学反应酸抑制疗法在EE (2)。区分GERD和EE并不总是清楚,GERD可以有大量患者食管嗜酸性粒细胞和EE有时报告临床反应酸中和治疗。

有一个引人注目的重叠皮肤和食道黏膜结构(3,4)。在终端分化的表皮角化细胞,细胞经历脱皮导致cornified细胞表面。这些死细胞构成的主要部分上皮屏障和不断更新。有趣的是,人类正常食管上皮不cornified和表达分化标记不同于皮肤(5- - - - - -8)。例如,involucrin early-differentiating细胞表达在食道和late-differentiating皮肤细胞(8)。增殖和分化基因表达研究很大程度上是在皮肤的上下文(9)在正常和病理条件(10),而标记食管上皮的分化并没有被广泛地研究过了。在皮肤角化细胞分化、角蛋白纤维组织由keratin-binding修改中间丝相关蛋白的蛋白质在层状上皮细胞(10,11)。协会的栏目或相关蛋白质的表皮分化复杂基因集群(EDC) 1号染色体上的温度系数(12),(如involucrin,新发现EDC的组件,loricrin,小富脯地区蛋白[SPRR])与角蛋白阻止蛋白水解角蛋白在上皮细胞的破坏终端分化(13- - - - - -15),从而形成的一个重要组成部分的上皮屏障cornified细胞(10,13,15,16)。这个途径的重要性特异反应性的发展凸显了损失函数的显著影响中间丝相关蛋白基因突变的基因,这使特应性皮炎(AD),这种疾病共存∼50%的EE的病人。事实上EE和广告份额分子特征包括食品致敏。值得注意的是,中间丝相关蛋白在上皮屏障功能与缺陷突变相关的广告(17- - - - - -23);这种突变是只出现在0 - 5%的控制个人和9 - 27%的广告,根据研究(17,24)。

我们最近提出,IL-13 EE疾病发病机理的关键细胞因子。特别是,食管上皮细胞表达的所有组件IL-13受体包括IL-4RαIL-13Rα1和IL-13Rα2 (25)。此外,IL-13诱发显著的基因表达失调食管上皮包括eotaxin-3明显超表达最强烈诱导IL-13目标基因,这也是高过表达体内EE食管转录组(25)。此外,气管内的实验老鼠EE IL-13诱导功能,和IL-13 -和STAT6缺陷小鼠保护开发的实验EE (26- - - - - -28)。最近的一项研究表明,患者的广告,一些EDC基因表达下调可能通过IL-13 STAT6-dependent机制(29日)。在我们最初的EE转录组的分析,我们最近指出,栏目mRNA在食道的EE显著下降而问活检标本使用微阵列分析(30.),这表明EE异常上皮分化。在这项研究中,我们旨在确定是否存在一个固有的缺陷在情感表达与上皮细胞反应,进一步确定哪些疾病的功能可以由IL-13。我们报告一个深刻的EDC基因表达失调,识别的影响IL-13 EDC基因表达和基因变异的存在在患者EE EDC的中间丝相关蛋白基因。

原发性食管上皮细胞生长如前所述(25)。人类食管上皮细胞系(TE)和鳞状上皮细胞是由Hainault博士(国际癌症研究机构,里昂,法国),并保持1640年RPMI介质(表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10% FCS(亚特兰大,J0138,优势)和1%青霉素、链霉素、两性霉素(表达载体)。在初步研究,我们优化培养条件的修改的边后卫的源头,有一个潜在的对细胞生长的影响和响应(补充图。1)。主要的细胞培养,一个或两个远端食管活检从EE收集患者在常规内镜和知情同意制度审查委员会批准。每个病人的嗜酸性粒细胞水平量化和对应于最大或嗜酸性粒细胞峰值在大功率领域(高通滤波器)。所有部分的活检标本进行了评估和计算。样品被培养在修改F-media (3:1 F-12 / DMEM)补充5%,的边后卫(亚特兰大,J0138,优势),腺嘌呤(24.2μg /毫升),霍乱毒素(10⁻⁴μM)、胰岛素(5μg /毫升),氢化可的松(0.4μg /毫升),和人类表皮生长因子(10 ng / ml)的青霉素、链霉素、两性霉素(表达载体)。组织是先用胰蛋白酶消化两次,其次是胰蛋白酶中和在F-media表皮生长因子。细胞被镀上1 - 5×10⁵NIH 3 t3 J2馈线细胞辐射6000 rad。第二天,媒体交换了F-media含表皮生长因子(10 ng / ml)和新鲜的媒体说每隔一天。问和EE patient-derived细胞培养2周,然后支线成纤维细胞是通过微分胰蛋白酶化。细胞被刺激与IL-13 (0, 1, 100 ng / ml)获得Peprotech(落基山,新泽西),所述(25)。盐酸酸化实验,pH值4解决方案/生理盐水(300 mosmol /公斤H₂O)或pH值7.4氯化钠溶液(300 mosmol /公斤H₂O)添加IL-13刺激,后4 h。250年μl盐水或盐酸/生理盐水加4 h。上层清液是收获和中和,和卷eotaxin-3量化前调整。可行的细胞使用hematocytometer和台盼蓝染色计算。

细胞总RNA提取试剂盒(英杰公司)根据制造商的指示。样本DNase治疗,并使用上标合成第一链cDNA II(表达载体)。活检组织的总RNA提取使用微型RNA提取工具包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)和逆转录使用Iscript执行(Bio-Rad大力神,CA)。实时PCR是由快速循环使用IQ5 (Bio-Rad) SYBR混合(Bio-Rad)作为现成的反应混合根据制造商的指示。以下引物组是:GAPDH(350个基点),5′-TGGAAATCCCATCACCATCT-3′, 5′-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′;栏目(125个基点),5′-GGGAAGTTATCTTTTCCTGTC-3′, 5′-GATGTGCTAGCCCTGATGTTG-3′;Involucrin(378个基点),5′-GTTCCTCCTCCAGTCAATACCCATC-3′, 5′-CTTCATTCCCAGTTGCTCATCTCTC-3′;Eotaxin-3(125个基点),5′-GTAACTCTGGGAGGAAACACCCTCTCC-3′, 5′-AACTCCGAAACAATTGTGACTCAGCTG-3′。PCR产物测序使用辛辛那提儿童医院医学中心(辛辛那提,哦)测序核心设施。

EE转录组和IL-13-induced基因的探针集受到大卫本体2.0(数据库进行注释、可视化和综合发现)和表达分析系统的浏览器分析、基于web的(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)应用程序(实验室的免疫发病机理和生物信息学、SAIC-Frederick弗雷德里克,MD),允许访问一个关系数据库的功能注释(31日,32)。染色体的位置得到了成绩单p值计算的基础上对每个染色体的基因总数礼物。微阵列数据在网上是可得到的www.ncbi.nlm.nih.gov项目/地理/加入数字GSE8853 (25)。

病人DNA分离出唾液,外周血白细胞或口腔颊拭子样本。历史的过敏性疾病(哮喘、广告、过敏性鼻炎)被记录在我们的EE人口。EE被定义为≥24嗜酸性粒细胞/高通滤波器在至少1食管活检如前所述的高通滤波器(33)。R501X,使用以下引物5′ctg GAG棉酚广汽亚美大陆煤层气有限公司得到CG-3′, 5′ttg TCT GCT TGC行动TCT GG-3′放大245 bp的片段如前所述(34)。PCR产物是1 h和消化NlaIII在37°C和4%琼脂糖凝胶上进行电泳,溴化乙锭。一个没有突变的等位基因消化成两个213 bp和32 bp的碎片。R501X突变的等位基因消化成三个176个基点的碎片,37个英国石油(bp)和32个基点。2282年del4,以下引物5′aat gg TCT GGA CAC柠檬酸GGT-3′, 5′-GGG gg法案CAG法案GTT条t - 3′是用来放大一个bp片段如前所述(811 -35)。两个片段(671个基点和136个基点)获得的突变等位基因。不变异等位基因中没有限制的网站。PCR产品消化1 hDraIII在37°C和1%琼脂糖凝胶上进行电泳,溴化乙锭(如前所述)(17- - - - - -23)。

统计学意义比较不同治疗方法或组由学生决定t测试(正态分布方差相等),韦尔奇t测试(正态分布,不平等的方差),Mann-WhitneyU测试(非参数检验,两组),或方差分析和克鲁斯卡尔-沃利斯检验了邓恩的多重比较测试(非参数测试,三组或更多)使用棱镜5软件(GraphPad,圣地亚哥,CA)。在病例对照研究中,χ²比值比(或)和95%置信区间计算使用棱镜5软件(GraphPad)。

我们旨在确定原发性食管上皮细胞从NL和EE患者相似的生长特性。细胞的比例能够达到80 - 100%融合35 d类似于67年和62%的本地语言和情感表达细胞系,分别为(图1一个)。没有发现差异数量的细胞在文化融合或之后35 d为1.8±1.3×10⁶和1.3±1.0×10⁶分别在本地语言和情感表达的细胞,(图1 b)。平均19±8 d足以达到融合(80 - 100%)问组相比21±8 d EE组(图1 c)。

测试是否上皮细胞从本地语言和情感表达个人应对IL-13倾向相同,细胞治疗IL-13 (0 - 100 ng / ml)。eotaxin-3 mRNA表达的褶皱变化是281±513和64±84倍增加1 ng / ml, 7783±14689和2893±2381倍增加与IL-13 10 ng / ml, 34174±23974和22910±24389倍增加在100 ng / ml IL-13 NL和情感表达细胞,分别为(图1 d)。Eotaxin-3分泌是依赖于培养条件,尤其是血清存在的类型(补充图。1)。此外,Eotaxin-3分泌到上层清液由质子浓度的影响。特别是,4.6±2.0 ng / ml和12.4±2.9 ng / ml被释放到上清液EE-derived细胞刺激IL-13 (100 ng / ml)细胞培养4 h时pH值7.4和4分别,虽然细胞生存能力没有影响(数据未显示)。此外,eotaxin-3发布增加了肝素,为12.9±3.8 ng / ml eotaxin-3得到肝素治疗后4.6±2.0 ng / ml相比缺乏肝素。类似的结果在初级上皮细胞培养来自问个人(图1 e)。这些结果表明食管反应EE可能cell-extrinsic现象的存在IL-13和微环境组件,如质子和肝素的水平,影响eotaxin-3水平。

EE转录组,定义为574探针明显不同(p< 0.001)EE食管活检的患者相比,问病人(30.),分析了各自的基因的染色体位置。1号染色体是最明显(p与48 = 0.0002)影响染色体的基因改变(对应61探针,或10.6%的EE转录组;图2一个)。我们注意到几个EDC的调制基因(如栏目)集群1号染色体上的温度系数(12),一个地区与特异反应性(36)。使用微阵列在问结果,EE病人活检,我们研究了EDC基因的表达模式位置1温度系数(图2 b)。大多数基因在这个集群显示显著降低表达式或趋势减少表达式(图2 b)。栏目mRNA表达下调16倍于情感表达与正常相比个人(图3)。我们验证芯片结果使用实时PCR通过检查正常,EE病人确定相对中间丝相关蛋白的表达在不同的疾病状态。使用群144人,栏目mRNA水平下调了16倍积极情感表达与患者健康的病人。食管特定SPRR基因esophagin (SPRR3)食道中高度表达,显著减少翻EE患者与健康的患者相比(图3 b)。相比之下,EDC标记involucrin没有明显下调EE患者与健康的患者相比(0.58(0.017 - 0.086)和0.13(0.057 - 0.49),分别;中位数(25 - 75四分位);图3 c)。这些数据表明,患者的食道EE表达选择EDC的特异表达基因,包括栏目和SPRR3。

丝相关蛋白表达我们对患者在治疗EE洞察EDC的可逆性获得分子的基因表达变化(图3)。EE回应治疗患者(糖皮质激素和/或改变饮食习惯)、中间丝相关蛋白的表达水平没有明显不同与控制水平和显著(p< 0.01)不同而积极的情感表达。观察丝相关蛋白表达相同的趋势SPRR3基因表达;没有显著减少involucrin健康患者的基因表达与患者积极或不活跃的观察EE (图3 b,3 c)。这些结果表明,基因表达异常EDC EE成功治疗后是可逆的。

我们认为观察到的中间丝相关蛋白中间丝相关蛋白mRNA水平可以减少减少功能并引起相关疾病表型;这符合中间丝相关蛋白的发现水平正常化后成功的治疗。然而,有两个功能丧失的遗传变异丝相关蛋白基因(R501X和2282 del4)最近与广告联系在一起;这些并不影响栏目mRNA水平,而是由此产生的不活跃的截短蛋白可能会损害表皮和屏障功能完整性。有趣的是,中间丝相关蛋白mRNA表达无显著差异观察过敏和nonallergic之间患者活动EE (图4;补充表2)。

我们164例控制和365 EE为这两个突变。可靠的基因型数据为2282年del4 EE患者在329年得到的365和157的164控制。我们发现6.1%的杂合子2282 del4 EE组和对照组的1.3%、3%和0.6%对应等位基因频率在EE和对照组,分别为(表我)。杂合子患者EE的删除,60%有湿疹和70%的食物过敏(补充表1)。显著关联(p= 0.0172;或者,5.016;和p= 0.0185;或者,4.89)之间被发现删除(分别为基因型和等位基因频率)和EE (表我)。可靠的基因型数据R105X在339年获得的365例患者和164名对照组(表我)。我们发现4.4%的杂合子的R501X EE组和对照组相应的3%到2.2%和1.5%等位基因频率在EE和对照组,分别为(表我)。没有发现重大协会之间的单核苷酸多态性和情感表达。杂合子患者之间没有重叠的突变被发现;总共11%的EE人口有一个或其他突变与控制人口的4.3% (p= 0.0363,表二世)。的患病率特异反应性(表3整个EE R105X积极)是类似的,2282 EE del4积极和EE WT组(分别为86.6%、85.0%和83.3%)。广告的患病率为33%,60%,44% (p在EE R105X积极= 0.11),2282 EE del4积极,分别和EE WT组。有趣的是,2282年del4突变仍与EE EE患者没有任何广告的历史进行了分析(p= 0.0315;表3)。中间丝相关蛋白等,而突变(2282 del4和R501X)增加情感表达与控制个人;他们目前只有11%的患者情感表达,表明在栏目基因的种系突变并不减少中间丝相关蛋白的主要病因。

我们下一个旨在调查IL-13上皮细胞生长和分化的影响。食管上皮细胞慢性接触IL-13 (100 ng / ml) 9 d细胞增长适度(±SD, 44.5±3.1, 65.2±11.4×10⁴细胞;p< 0.05;图5)。相比之下,类似的刺激与IL-13 48小时没有增加细胞数量(数据没有显示)。我们旨在确定EDC的基因的表达,如involucrin SPRRs,并被IL-13表达下调(图5罪犯)。中间丝相关蛋白微阵列分析表明,involucrin SPRR4, 1和3在IL-13治疗细胞明显下调。使用实时PCR, IL-13中间丝相关蛋白(100 ng / ml)减少和involucrin mRNA表达9倍和5倍以上原发性食管上皮细胞,分别为(图5度,5 d)。有趣的是,与糖皮质激素预处理是无法抑制的差别IL-13对这些栏目mRNA(数据没有显示)。STAT6使用占主导地位的否定形式,我们检查的作用后表达降低观察STAT6 IL-13刺激。占主导地位的否定形式的表达式STAT6部分获救involucrin IL-13介导镇压(图5 e),这表明STAT6功能有助于IL-13-regulated involucrin食管上皮细胞中表达。

在这项研究中,我们比较上皮反应之间健康的病人和那些EE揭开分子解释EE发病机理。从两组食管上皮细胞生长与可比的特点和热切地回应IL-13在相似的水平。众多EDC基因,栏目等SPRR3是表达下调IL-13-stimulated食管上皮细胞和EE而问活检标本。中间丝相关蛋白而丧失功能突变(2282 del4)是在资料库的一个子集EE和控制个体相比,患者获得的中间丝相关蛋白表达减少被一致认为在所有EE患者体内,表明广义的重要性。EDC中间丝相关蛋白基因和involucrin表达有差异增加在食管上皮细胞分化(补充图。2)和强烈下降了IL-13。

在我们的细胞培养条件下,问,EE-derived活检标本有相似的生长特性。这些结果表明,食管增生在EE可能源于一个外在的现象。它已经表明,食管上皮细胞差异表达的基因与健康对照组相比,EE (30.)。而调节的基因包括增殖标记,如Ki67,表达下调的基因包括EDC的成员(33,37)。EE,患者有严重的上皮细胞增生,上皮细胞的数量与食管早期分化标记(例如,involucrin)增加。此外,还有减少well-differentiating细胞的发生。这一发现或许可以解释为什么involucrin基因的部分原因,早期分化细胞中表达,不是在EE显著下降。相比之下,栏目,分化细胞中表达,在患者EE高度表达下调。尽管被IL-13表达下调,involucrin-expressing细胞数量的增加可能是负责involucrin mRNA表达水平不显著改变EE活检样本。我们以前呈现强劲重叠IL-13-stimulated食管上皮细胞转录组和EE基因签名,表明主要IL-13参与EE (25,30.)。食管上皮细胞慢性接触IL-13诱发体外细胞数量增加。IL-13已被证明小鼠体内诱导食管上皮增生(38)。我们的研究结果还表明,问和EE上皮细胞都热切地应对IL-13 overexpressing eotaxin-3。虽然这些结果代表只有一个基因,他们认为IL-13 / IL-13受体/ STAT6通路不显著改变本地语言与情感表达。我们的数据也符合EE IL-13水平切片之前报道的增加(25)和反对的致病性参与keratinocyte-intrinsic缺陷。此外,并恢复到正常水平当患者对糖皮质激素作出反应。这种糖皮质激素效应最有可能减少造成的IL-13体内,体外实验表明,糖皮质激素不能修改丝相关蛋白表达IL-13-induced在食管上皮细胞(数据没有显示)。小鼠模型显示IL-13在EE的潜在的重要作用,正如IL-13-deficient老鼠减少嗜酸性粒细胞浸润。类似的观察中il - 4 / IL-13 double-deficient和STAT6缺陷小鼠(27)。情感表达是一种多因素疾病,当然包括IL-13,(至少部分),而且很多其他组件(遗传、免疫、或环境),可能部分重叠在EE发病机制的作用和功能。

胃酸倒流和返流疾病混杂因素在EE诊断、嗜酸性粒细胞和酸中和解决食管在某些患者(2)。eotaxin-3的释放质子可以解释为什么质子泵抑制剂通常有部分临床疗效在EE (1,2)。质子被修改鳞状上皮的屏障功能破坏细胞间细胞桥粒。有趣的是,上皮通透性之间的质子与健康受试者和活跃的GERD患者(39)。有趣的是要注意,eotaxin-3与细胞膜的外表面,通过CCR3可能,据报道已经表达了皮肤角化细胞(40,41肝素),值得注意的是,从细胞表面释放eotaxin-3绑定。众所周知,趋化因子结合粘多糖侧链蛋白聚糖,如肝素、肝素强化eotaxin-induced嗜酸性粒细胞招募体内(42)。肝素的作用eotaxin-3释放之前一直在支气管肺泡上皮细胞(43)和血液中heparin-plasma eotaxin-3水平较高与EDTA等离子体(33,44)。这些发现强调肥大细胞衍生的潜在作用肝素在EE的嗜酸性粒细胞招募。符合外部因素的调节能力eotaxin-3释放,eotaxin-3复苏细胞媒体依赖于使用的血清类型。这些结果说明微环境中的外部组件可能调节eotaxin-3水平和嗜酸性粒细胞渗透到组织的倾向。

EDC中间丝相关蛋白基因和患者强烈表达下调EE (30.)。它也表明,丝相关蛋白突变和广告之间存在一个强大的协会(45)。因为EE人口的很大一部分(∼43%)有湿疹或湿疹的历史,我们推测,这些突变会与情感表达有关。虽然中间丝相关蛋白的突变会将浓缩在一个异位的人口,过敏性疾病的发病率是相同的在EE R105X积极、EE 2282 del4积极,EE WT组。此外,EE病人没有广告的频率显著增高2282 del4突变与控制(表3),这表明协会的2282 del4突变与EE并不依赖于广告的高情感表达。EE和2282之间的重大协会发现del4建议提高经皮敏感EE (21)。有趣的是,R501X低于预期的频率在这样一个高度特异反应性人口,这需要进一步调查。分开我们的结果表明,突变,并可能导致情感表达,但只存在于一小部分EE人口中间丝相关蛋白的基因表达差别尽管深刻的对这些出现在几乎所有的病人。

总之,我们的报告从情感表达功能正常患者食管上皮细胞与细胞分离控制的个体相比,评估体外生长特性。基于eotaxin-3生产IL-13响应能力。虽然功能并丧失突变(2282 del4)是在资料库EE和控制个体相比,获得的中间丝相关蛋白表达减少被一致认为在所有EE情况下体内。事实上,EDC基因(栏目和involucrin)表达式被IL-13强烈直接下降。因此,这些结果证明上皮反应的主要缺陷EE不是固有上皮,而是可能继发于IL-13的影响,调节EDC基因的表达。我们的研究结果支持模型的协调互动IL-13和上皮分化集群在EE基因。

我们感谢Lawanda科比,凯瑟琳·亨德森Kiran Mudambi, Tova Holowinko寻求帮助。

披露的信息M.E.R. Ception疗法是一个顾问,默克公司研究实验室,年会,Biocryst制药,奈科明。