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摘要
背景:在建立了SARS相关冠状病毒对一组抗病毒药物的体外抗病毒敏感性后，研究了严重急性呼吸综合征(SARS)患者对洛匹那韦/利托那韦和利巴韦林联合使用的临床反应。
方法:研究了SARS相关冠状病毒原型对目前获准临床使用的核苷类似物和蛋白酶抑制剂的体外敏感性。41例SARS患者接受洛匹那韦/利托那韦与利巴韦林联合治疗，随访3周。监测临床进展和病毒学结果，并与仅作为历史对照的111例接受利巴韦林治疗的患者进行比较。
结果:洛匹那韦和利巴韦林浓度分别为4µg/ml和50µg/ml时，仅在48小时内就显示出对SARS相关冠状病毒的体外抗病毒活性。治疗组不良临床结局(ARDS或死亡)显著低于历史对照组(2.4%)v28.8%， p<0.001)。治疗组的不良结局明显低于对照组——早期诊断的(p<0.001)和流行过程中晚期诊断的(p = 0.002)——但两个时间段的不良结局率没有显著差异(p = 0.548)。对照组的结果无时间相关性差异。在最初使用洛匹那韦/利托那韦治疗的患者中，可以看到类固醇使用和医院感染的减少，这些患者的病毒载量下降，外周淋巴细胞计数上升。多变量分析显示，年龄、乙型肝炎携带者状况和缺乏这种抗病毒联合治疗是不良结局的独立预测因素。洛匹那韦/利托那韦治疗与更好的结果相关，即使调整基线乳酸脱氢酶水平。
结论:洛匹那韦/利托那韦和利巴韦林明显的良好临床反应支持进一步在SARS患者中进行随机安慰剂对照试验。
- 严重急性呼吸综合征（非典）
- 冠状病毒
- lopinavir /例如
数据来自Altmetric.com
严重急性呼吸系统综合症(SARS)是由一种新型冠状病毒引起的。1 -3.它满足了科赫关于因果关系的假设，因为它始终与SARS患者隔离，接种后在非人灵长类动物中分离病毒和疾病繁殖，并且在SARS患者和人工感染的灵长类动物中都存在针对病毒的特异性抗体反应。4在一项较早的前瞻性研究中，我们提出有一个初始的病毒复制阶段，随后是免疫病理阶段和末端器官损伤阶段。5我们假设免疫病理反应是由病毒抗原触发的;因此，最具战略意义的治疗是在一开始就停止病毒复制，从而将病毒载量峰值和随后的免疫病理损害降至最低。因此，迫切需要有效的抗病毒治疗。目前的治疗建议主要是经验性的，从无干预的支持性治疗到用类固醇强化免疫调节。在这种威胁生命的流行病中很难进行对照研究。6我们报告了一项针对历史对照组的蛋白酶抑制剂和核苷类似物组合的开放试验结果。
方法
实验室研究
采用原型病毒(HKU-39849分离物)进行体外抗病毒药敏试验。最初的筛选是在96孔微量滴定板中进行的，该板中含有胎恒河猴肾-4。在标准治疗剂量后，将抗病毒药物从峰值血清浓度的四倍开始稀释至25%的血清谷浓度，对100 TCID进行四次重复测试50(SARS冠状病毒组织培养感染剂量中位数)。用相应的组进行药物测试，但没有病毒攻毒，作为对照。在48小时对细胞病变效应的抑制进行评分。测试的抗病毒药物包括阿昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦、磷净、利巴韦林、干扰素α、金刚烷胺、齐多夫定、司他夫定、奈韦拉平、阿巴卡韦、利托那韦和洛匹那韦。
在定量斑块减少试验中重新测试了在测试浓度下具有可检测活性的药物，随后进行了各种抗病毒药物组合的棋盘式协同试验。简单地说，带有融合细胞单层的24孔组织培养板(1×105在1.0 ml最低必需培养基(MEM)中加入10%胎牛血清(FCS)。在吸出培养基后，将50-100个SARS相关冠状病毒斑块形成单位(PFU)(在含有适当浓度抗病毒药物的1% FCS/MEM中)添加到每个孔中。培养皿在37℃5% CO中孵育2小时2．吸入接种体，每孔加入1.0 ml覆盖层(1.0%低熔点琼脂糖，1% FCS/MEM，相应的药物稀释)。进一步在37°C的5% CO中孵育48小时2．加入2 ml 10%甲醛固定细胞，室温孵育2小时。吸入琼脂糖塞，每孔用70%甲醇制备的0.5%结晶紫染色。计数病毒空斑。使用25、50和100 TCID进行了利巴韦林和洛匹那韦联合使用对细胞病变效应抑制的棋盘试验50每孔96孔微量滴定板。
临床研究
在2003年3月24日至4月28日期间，经伦理委员会批准，基督教联合医院和明爱医疗中心连续招募了152名疑似SARS(根据世界卫生组织的定义)患者参加研究。一旦确定SARS诊断，利巴韦林给予14天(口服负荷剂量4克，随后每8小时1.2克，如果患者不能耐受口服治疗，则每8小时静脉注射8毫克/公斤)，同时减少皮质类固醇方案21天(起始剂量:氢化可的松100-200毫克每6-8小时或甲基强的松3毫克/公斤/天)。如果患者出现呼吸短促加重、氧饱和度降低或放射学恶化，则静脉注射甲基强的松龙脉冲(0.5-1克/天至4克)。7
2003年4月16日前接受治疗的患者作为历史对照(n = 111)。前75例病例的临床特征和病毒学表现已有报道。52003年4月16日之后，新诊断的SARS患者和未发生急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的患者在获得知情同意后开始口服洛匹那韦(400 mg)/利托那韦(100 mg)，每12小时口服一次，持续14天(n = 41)(利托那韦抑制CYP3A介导的洛匹那韦代谢，从而增强洛匹那韦的血清水平)。
历史对照组和洛匹那韦/利托那韦治疗组均按相同方案给予利巴韦林和皮质类固醇。主要结局指标是21天的综合不良结局，其定义为严重低氧血症(符合ARDS动脉氧张力标准(Pao2)到吸入氧的分数(Fio2)小于200毫米汞柱8)或死亡。治疗组分为两个亚组进行进一步分析。在“初始治疗”亚组(n = 12)洛匹那韦/利托那韦在甲基强的松龙脉冲治疗前开始(中位时间从症状出现3.5天开始)，而在“抢救治疗”亚组(n = 29)洛匹那韦/利托那韦在甲基强的松龙脉冲治疗后开始(中位时间从症状出现14天开始)。每天进行临床测量和血液检查。
通过入院时的鼻咽拭子和症状出现后14-28天的恢复期血清诊断冠状病毒感染。在初始治疗亚组中随机选择6例患者和12例历史对照患者，经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测的鼻咽标本初步呈阳性，在症状出现后第5、10、15和20天连续进行定量RT-PCR。在第7、14和21天收集治疗组所有41例患者的粪便进行RT-PCR分析。病毒学诊断方案和其他微生物工作的执行方式与我们以前的出版物相同。1，5
统计分析
所有时间相关数据均从症状出现之日起计算。采用Fisher精确分类变量检验(Student’s)比较历史对照组和治疗组的基线特征t测试，或Mann-Whitney U测试连续变量。采用Kruskal-Wallis检验比较不同治疗亚组甲基强的松龙的累积剂量。由于这是一项开放的非随机研究，两组的基线特征不平衡是意料之中的。为了调整这种不平衡，对在单因素分析中确定的与21天不良结果相关的因素进行多元逻辑回归分析，并采用正向选择来确定独立的预测因素。此外，基于LDH可能影响结果的先验假设，洛匹那韦/利托那韦治疗相对于主要结局的优势比根据基线乳酸脱氢酶(LDH)水平进行了多元逻辑回归调整。由于洛匹那韦/利托那韦是在疫情后期使用的，任何明显的好处都可能是由于医务人员在治疗病人方面获得的经验或在疫情期间病毒的衰减。为确定结果是否有时间相关性差异，将历史对照组根据入院日期分为早期和晚期两个亚组进行进一步分析。划分日期是任意选择的，以实现各子组病例数量的合理平衡。两组历史亚组和治疗组的预后用χ进行比较2测试。双尾p值<0.05被认为是显著的。所有分析均使用SPSS 11.0版(SPSS Inc，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。
结果
体外抗病毒药敏试验表明，4 μg/ml的洛匹那韦和50 μg/ml的利巴韦林在48小时后可抑制SARS冠状病毒的细胞病变作用(图1)，96小时后抑制作用逐渐消失。测试的其他药物都没有任何抑制作用。斑块减少试验证实了上述结果。利用棋盘法进行协同作用，只有当病毒接种量减少到50 TCID时，洛匹那韦与利巴韦林的联合浓度为1 μg/ml时，细胞病变效应才得到抑制50以下。
利巴伐林和洛匹那韦对SARS冠状病毒的剂量依赖性抗病毒作用。体外抗病毒药敏试验表明，洛匹那韦(4 μg/ml)和利巴韦林(50 μg/ml)孵育48 h后可抑制细胞病变作用。
历史对照组和治疗组的基线特征和结果见表1。152例患者的平均(SD)年龄为41.4(14.8)岁，其中58例(38.2%)为男性。96.7%病毒学证实为SARS相关冠状病毒。在历史对照组中，25只(22.5%)符合ARDS低氧血症标准，7只(6.3%)在第21天死亡。在治疗组中，只有1例患者(2.4%)符合ARDS低氧血症标准，无死亡病例。因此，历史对照组的21天不良结局率为28.8%，治疗组为2.4%，洛匹那韦/利托那韦治疗的效应量为26.4%(95%置信区间16.8至36.0,p<0.001)。
两组在年龄和共发病方面无显著差异。然而，治疗组的男性更少，初始血小板计数更高，初始LDH水平更低。使用两个多元logistic回归模型来评估洛匹那韦/利托那韦治疗是否与改善的结局独立相关。在第一个模型中，正向选择的多元logistic回归显示，年龄(p = 0.013)、慢性乙型肝炎感染(p = 0.007)和缺乏洛匹那韦/利托那韦治疗(p = 0.011)与21天不良结局独立相关(表2)。在第二个模型中，基于LDH可能混淆结局的先验假设，洛匹那韦/利托那韦治疗的优势比根据LDH水平进行了多元logistic回归调整。洛匹那韦/利托那韦治疗被发现与显著更好的结果相关(p = 0.014)，尽管对LDH水平进行了调整(表3)。
为了确定结果是否有时间相关的差异，对照组根据入院日期分为两个亚组。第1期为2003年3月24日至3月27日(4天，n = 68);第2期为2003年3月28日至4月15日(19天，n = 43)。选择日期是为了使每个子组的病例数量达到合理的平衡。洛匹那韦/利托那韦用于4月16日至4月28日(13天，n = 41)入院的患者。治疗组的21天预后明显好于两个对照组，只有一名患者(2.4%)发生ARDS，无死亡(p<0.001)v周期1,p = 0.002v周期2，χ2试验)，但历史对照组的21天转归率在两个时间段间无显著差异(第1期21天内发生ARDS或死亡21例(30.9%)，第2期11例(25.6%)，p = 0.548， χ2测试)。
在初始治疗亚组中，鼻咽拭子中的病毒载量呈进行性下降。几何平均病毒载量从4.7 × 10持续下降4在随机选择的6名患者中，有5名患者在第5天达到了每毫升拷贝数到第10天无法检测到的水平(图2A)。病例6的病毒载量在第10天出现短暂性下降，随后在第15天出现反弹。这与第7天使用脉冲甲基强的松龙有关。而随机选取的12例历史对照组患者呈倒v型曲线，病毒载量的几何平均峰值为1.9 × 107第10天每毫升仍可检测到拷贝数(几何平均值6.3 × 103.10例患者在第20天(图2B)。治疗组第21天粪便RT-PCR阳性率为2.4%，历史对照组为67%。5
(A)初始治疗亚组6例患者鼻咽拭子SARS相关冠状病毒序列定量RT-PCR病毒载量变化。注意病例6在第7天给予脉冲甲基泼尼龙。(B)历史对照组12例患者鼻咽拭子SARS相关冠状病毒序列定量RT-PCR病毒载量变化。
与历史对照组相比，治疗组的疾病症状进展为腹泻(24.4%)v62.2% p<0.001)，复发性发热(39%v60.4% p = 0.0027)，胸片恶化(51.2%)v81.1% p<0.001)发生频率降低。初始治疗亚组序列淋巴细胞计数从1.2 (0.7)× 10呈上升趋势9每升1.0 (0.6)× 109/l, 1.3 (0.9) × 1091.9 (1.1) × 109分别在第7、14和21天饲喂/l，而历史对照组的淋巴细胞计数从1.1 (0.7)× 10逐渐下降9入院时每升0.9 (0.1)× 109/升0.7 (0.1)× 1090.5 (0.4) × 109分别在第7天，第14天，第21天。
在历史对照组和治疗组之间，累积脉冲甲基强的松龙剂量没有差异(表1)。然而，在亚组分析中，初始治疗亚组所需的脉冲甲基强的松龙累积剂量明显低于抢救治疗亚组和历史对照组(中位数分别为0 g、2.5 g和1.5 g;p < 0.001)。初始治疗亚组中发生医院感染的患者(0%)也明显少于抢救治疗亚组(27.6%)和历史对照组(25.2%);P = 0.043, P = 0.048)。有医院感染的患者接受脉冲甲基强的松龙的平均(SD)累积剂量(2.6 (1.6)g)高于无医院感染的患者(1.8 (1.5)g;p = 0.009)。
治疗组有11例(26.8%)患者出现轻微不良反应:胃肠道不适(11例)、肝功能障碍(7例)、头痛(6例)、视力模糊(3例)。只有1例患者需要早期停药，因为谷丙转氨酶(ALT)显著升高至正常水平的两倍以上。治疗组29例患者(70.7%)血红蛋白下降超过2克/分升，其中2例需要输血;11例患者(26.8%)在研究期间出现无症状心动过缓，平均(SD)为42(6)次/分钟，与历史对照组相似。
讨论
在SARS流行的早期阶段，在病因确定之前，开放式肺活检标本的组织病理学变化提示了免疫病理损伤的可能性。9因此，广谱抗病毒药物(利巴韦林)和免疫抑制剂量的类固醇被用作经验性治疗。在分离出SARS相关冠状病毒后，体外抗病毒药敏试验表明，病毒只能被非常高浓度的利巴韦林短暂抑制，这在临床上很难达到。因此，迫切需要找到一种替代疗法。我们之前关于病毒载量和疾病进展的顺序变化的研究表明，有一个初始的病毒复制阶段，在第10天左右达到峰值。这意味着有一个可以利用的治疗窗口，只要有活性抗病毒药物可用。因此，治疗SARS的关键策略是找到一种有效的抗病毒药物，降低峰值病毒载量，从而降低相关的免疫病理损伤程度。这将减少对免疫抑制剂的需求，免疫抑制剂通常与医院感染风险增加有关，特别是在需要机械通气的患者中。
洛匹那韦的峰值浓度(9.6µg/ml)和低谷浓度(5.5µg/ml)均能达到对SARS病毒的抑制浓度。10然而，口服洛匹那韦/利托那韦可获得较高的粪便浓度，因为20%的药物在粪便中没有变化。11在我们之前的研究中，我们发现73%的SARS患者出现严重的水样腹泻，RT-PCR在第10天至21天期间检测到较高的粪便排泄率。5因此，胃肠道粘膜可能是病毒复制和传播的重要储存库。虽然我们可能无法达到令人满意的血清抑制浓度，但肠粘膜浓度可能高到足以阻止病毒在该部位复制。
由于这项开放研究的非随机性质，治疗组和历史对照组在性别、血小板计数和乳酸脱氢酶水平方面存在差异。然而，两组在年龄和共发病方面没有显著差异，这两个重要的预后因素在之前的研究中发现。5，12 -15在多变量分析中，洛匹那韦/利托那韦治疗是改善21天预后的独立因素，在调整LDH水平后仍然如此。治疗组的21天不良结局率为2.4%，不仅与我们的历史对照组相比，而且与报道的21 - 23.3%的数据相比也有利12，13不同年龄段的预期数字为13-43%。16
用洛匹那韦/利托那韦治疗的SARS患者在腹泻、发烧复发和胸片恶化方面的病程较轻。病毒载量也有所降低(图2A)。病毒载量在初始治疗亚组中呈进行性下降，与之前报道的预期倒v型曲线相反。5此外，治疗组第21天的粪便RT-PCR阳性率(2.4%)明显低于之前报道的历史对照组(67%)。5这些发现表明，联合用药的益处至少部分与抗病毒活性有关。
在不良反应方面，历史对照组与文献报道的洛匹那韦/利托那韦之间差异不大。11值得注意的是，在SARS中使用的利巴韦林剂量远低于治疗出血热的剂量。因此，除贫血外，很少有患者终止治疗或出现重大副作用。此外，在当地社区获得性肺炎患者队列中也发现血红蛋白在平均6.4天下降1.3 g/dl(未发表数据)。
由于这不是一项随机研究，对结果可能有一些不同的解释。首先，有理由怀疑治疗组结局的显著改善可能是由于在疫情后期的管理中获得了经验。在流行过程中病毒的衰减是另一种解释改善结果的理论可能性。然而，重新分析历史对照组，根据入院时间的早和晚分为亚组，并没有改变治疗组在两个时期都比对照组有更好的结果的结论。此外，两个历史时期的结果没有差异，这表明入院时间可能不是洛匹那韦/利托那韦治疗组疗效明显改善的主要原因。
其次，使用皮质类固醇可能会混淆结果，因为它可能会削弱宿主的反应并促进病毒复制。然而，历史对照组和治疗组患者都接受了相同的皮质类固醇治疗方案，累积甲基强的松龙剂量在两组整体上没有差异。因此，治疗组的改善结果并不是减少类固醇使用的结果。在亚组分析中，接受洛匹那韦/利托那韦作为初始治疗的患者似乎病程较轻，病毒载量降低。因此，他们对严重呼吸恶化的抢救脉冲甲基强的松龙的需求减少了。洛匹那韦/利托那韦可能通过对病毒载量的直接影响或由于减少免疫病理损伤而间接的类固醇保留作用来改善结果。
第三，治疗组明显改善的结果可能是历史对照组比预期结果更差的结果。利巴韦林和类固醇的反对者认为，在美国，单独使用支持性治疗来治疗SARS，病死率为零。17然而，值得注意的是，在美国，47例可能病例中只有8例，162例疑似病例中没有一例在病毒学上确诊为SARS冠状病毒感染。18相比之下，中国大陆、台湾、加拿大和新加坡的SARS病例分别为5327例、665例、251例和238例，病死率分别为7%、27%、17%和14%。17
在SARS中使用大剂量类固醇治疗充其量是有争议的。提倡使用大剂量类固醇的人注意到，脉冲甲基强的松龙在SARS治疗器官排斥反应时的成功案例。19同一组研究人员调查了SARS患者对不同类固醇治疗方案的反应，并得出结论，高剂量脉冲甲基强的松龙治疗(器官排斥治疗范围)似乎比低剂量方案更有效，同样安全。20.然而，另一组还不能证明使用脉冲类固醇与更好的结果相关。15这些发现需要在随机安慰剂对照研究中进行检验，这些研究应包括不使用类固醇或抗病毒药物的手臂。
鉴于在第21天的综合不良结局、病毒载量、类固醇剂量和医院感染发生率的明显降低，有必要进行随机安慰剂对照研究来测试洛匹那韦/利托那韦在SARS中的益处。我们建议洛匹那韦/利托那韦联合利巴韦林应与洛匹那韦/利托那韦单独和安慰剂进行测试。
致谢
作者感谢香港政府的杨紫琼医生为研究提供的帮助，感谢玛丽医院微生物科、基督教联合医院内科及重症监护室、明爱医疗中心内科及老年病科的工作人员提供的出色技术援助和病人管理。
参考文献
脚注
↵＊香港大学/UCH SARS研究小组的成员名单载于论文末尾。
利益冲突:没有声明。
资助:美国国立过敏和传染病研究所公共卫生研究拨款A195357，香港大学和香港特别行政区医院管理局惠康信托基金拨款GR067072/D/02/Z
香港大学/联合医学院SARS研究小组其他成员:香港大学微生物学系邓少峰、胡培耀、刘锦鹏;罗国义、许耀辉、梁文生、陈维良、吴俊生，基督教联合医院;谢文伟，明爱医疗中心。