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文摘
客观的肝内胆管癌(iCCA)发病率正在上升,目前,都有有限的有效的系统性治疗。iCCA肿瘤由基质细胞渗透,抑制骨髓患病率高的人群包括肿瘤相关巨噬细胞(tam)和myeloid-derived抑制细胞(MDSCs)。在这里,我们表明,肿瘤提取集落刺激因子(gm - csf)和主机骨髓是中央monopoiesis和tam的强化和废除这信号轴促进抗肿瘤免疫的小说iCCA模型。
方法从iCCA患者血液和肿瘤进行分析和控制。治疗和相关研究在老鼠身上进行原地和与anti-GM-CSF单克隆抗体建立了原位iCCA肿瘤治疗。
结果系统性海拔循环骨髓细胞与患者的不良预后iCCA,和病人接受切除更糟糕的整体存活率和CD68如果肿瘤更渗透+tam。小鼠自发iCCA证明相当高度的单核细胞的髓细胞在肿瘤微环境和免疫隔间,过表达gm - csf和肿瘤。封锁的gm - csf单克隆抗体减少肿瘤生长和扩散。老鼠轴承原位肿瘤治疗anti-GM-CSF演示repolarisation免疫抑制tam和MDSCs,促进T细胞反应和肿瘤回归。gm - csf封锁抑制炎症基因网络在肿瘤和tam。人类肿瘤切除后gm - csf表达表现出改进的整体存活率降低。
结论iCCA使用GM-CSF-bone骨髓轴建立免疫抑制肿瘤微环境。封锁的gm - csf轴促进抗肿瘤T细胞免疫力。
- 胆管癌
- 免疫疗法
- 巨噬细胞
- 免疫反应
- 炎症介质
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合理的请求数据。从大卫·C Linehan数据请求。David_Linehan@urmc.rochester.edu。
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
肝内胆管癌(iCCA)的特点是突出fibroinflammatory肿瘤间质治疗抵抗中发挥着关键作用。
基质渗透着丰富的髓细胞包括肿瘤相关巨噬细胞(tam)和myeloid-derived抑制细胞(MDSCs),它支持肿瘤生长和抑制抗肿瘤免疫。
存在一些免疫活性的研究机制的模型iCCA建立基质屏障,和机制所知甚少,通过它iCCA驱动器先天免疫细胞的慢性炎症和招聘。
有什么新发现吗?
iCCA,大多数肿瘤微环境中的免疫抑制细胞(时差)tam,及其存在升高与总体存活率更糟糕。
肿瘤提取集落刺激因子(gm - csf)骨髓形成的核心中介,招聘和tam的两极分化,其表达与iCCA切除患者的预后。
治疗的封锁gm - csf抑制肿瘤生长的自发的小鼠模型iCCA导致延长生存。
中和gm - csf减少tam和功能性髓细胞重新编程的小说iCCA的原位模型,促进增强细胞毒性T细胞反应。
gm - csf封锁逆转诱导慢性炎症通路内的时间和tam的替代分化。
本研究的意义
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
gm - csf是中介的肿瘤组织慢性炎症,和针对tam和MDSCs gm - csf封锁代表一个新颖的方法扭转免疫抑制时间和感光iCCA近年适应性免疫。
介绍
肝内胆管癌(iCCA)是第二个最常见的原发性肝脏恶性肿瘤,发病率不断上升。1不幸的是,大多数患者出现在一个先进的阶段,不适合手术治疗。2 3目前,嘧啶类似物结合铂化疗的支柱是系统性治疗。4个5然而,化疗反应有限导致的5年生存率小于10%。6
iCCA组织学检查是由一位著名的肿瘤间质细胞外基质组成的密集网络,充斥着非炎性免疫细胞和成纤维细胞。7肿瘤基质与恶性胆道上皮和交互形式的障碍治疗通过促进肿瘤生长、免疫逃避和化疗抵抗。8 - 10事实上,胆道癌已经被描述为一种慢性受伤癌症欣欣向荣的特异表达的伤口修复计划。11 - 13因此,我们假设,免疫治疗方法解决慢性炎症肿瘤基质可能会带来新的突破通过重组免疫抑制肿瘤微环境(时差)iCCA的特征。
在这个报告中,我们详细的预后影响单核细胞的和粒细胞白细胞从骨髓动员,招聘iCCA碰头的。此外,我们描述了免疫抑制潜在的肿瘤相关巨噬细胞(tam)时间的编排下iCCA iCCA-derived集落刺激因子(gm - csf)。我们发现治疗的封锁gm - csf受损的肿瘤生长,延长小鼠的生存由原地肿瘤喀斯特G12D和损失的Trp53。从力学上看,我们发现gm - csf压制tumour-orchestrated骨髓形成,抑制单核细胞动员和免疫抑制tam的两极分化,而防止补偿流入myeloid-derived抑制细胞(MDSCs)。最后,减轻骨髓免疫抑制的iCCA肿瘤促进渗透增强激活的细胞毒性T细胞。
方法
原地iCCA小鼠的研究
的LSL-KrasG12D;Trp53液氧/液氧;Alb-Cre(KPPC)小鼠自发iCCA先前描述。14日15老鼠的监视疾病发作使用高频超声(美国)Vevo 3100成像系统(富士胶片VisualSonics)。老鼠与新诊断肿瘤治疗连续进入anti-granulocyte-macrophage集落刺激因子(ɑgm - csf)或鼠IgG2a同形像控制(免疫球蛋白)(BioXcell:ɑgm - csf,克隆MP1-22E9;免疫球蛋白,克隆抗体2 a3),每组腹腔注射(IP)和30毫克/公斤的抗体每2天。我们三维图像得到每周和容积重建与Vevo实验室软件(富士胶片VisualSonics)。iCCA组织病理学确认尸检在有执照的病理学家。大学委员会批准的所有动物研究动物资源。
人类外周血和肿瘤分析
机构审查委员会批准对胆道癌患者治疗罗切斯特大学医学中心在2011年和2018年之间。病人的临床病理的数据提取的电子医疗记录比较完整的血细胞计数和循环免疫细胞微分的系统性或手术前诊断和治疗(在线补充表1和2)。存档liver-invasive肿瘤组织块和相邻肝标本被选中时包括肿瘤和邻近的肝实质可用。“正常”组织块选择冷漠肝脏领域从患者肝脏恶性肿瘤或良性的质量。
组织学、免疫组织化学和免疫荧光
Formalin-fixed石蜡包埋组织块(FFPE)在5µm分段。组织部分deparaffinised在二甲苯和水化连续变化的梯度乙醇在水里。使用标准执行三色的染色组织学协议和Picro-Sirius红(Polysciences)染色进行每个制造商的指示。
免疫组织化学(包含IHC)分析、内生氧化酵素淬火用3%过氧化氢和燥热引起抗原检索进行柠檬酸(bioWORLD)或高pH值(表达载体)缓冲区。非特异性背景与血清蛋白阻塞块(安捷伦科技),和部分孵化主要抗体中列出在线补充表3稀释的抗体稀释剂(安捷伦科技)一夜之间在4°C。包含IHC染色呈现了Polink-2 +合(GBI实验室)或VECTASTAIN ABC-HRP(向量实验室)包民建联chromagen /制造商的指示。
免疫荧光,标本嵌入在最佳切削温度(10月)介质和储存在−80°C。部分被削减时5µm和固定在冰冷的甲醇。部分被封锁与血清蛋白质块和孵化主要抗体中列出在线补充表3一夜之间在4°C。部分是用PBS和Alexa染色萤石488山羊anti-rabbit和Alexa萤石555山羊anti-rat二级抗体(ThermoFisher)。盖玻片是安装与DAPI VECTASHIELD安装介质(向量实验室)。
Brightfield和荧光图像捕获用BX43显微镜配备DP80相机(奥林巴斯)。整个部分的分析,对幻灯片进行扫描20×客观使用Aperio VERSA扫描仪和染色强度量化Aperio积极像素算法V.9(徕卡微系统)。
鼠科动物细胞系和原位iCCA研究
小鼠iCCA细胞系335、339、476和2081年以前。14生成同源的iCCA肿瘤细胞系,句话LSL-KrasG12D,Tp53液氧和Alb-Cre在C57BL / 6小鼠背景是intercrossed生成KPPC老鼠。KPPC肿瘤被分解成单细胞悬浮体和培养胶原蛋白我涂板(康宁)RPMI (Gibco)补充10%的边后卫(康宁)。细胞株是通过三到五次,iCCA组织学证实了具备医师资格认证的病理学家。
原位研究60 000罗切斯特大学胆管癌(URCCA) 4.3细胞混合在PBS 2:1:人工基底膜矩阵(康宁)解决方案和注射6 - 8周大的肝左叶C57BL / 6小鼠。疾病发作是美国2周postimplantation确认通过,和老鼠服用免疫球蛋白或ɑgm - csf如上所述4周。前T细胞耗竭研究老鼠600µg anti-CD8抗体(BioXcell,克隆2.43)和600µg anti-CD4抗体(BioXcell克隆GK1.5) IP之前原位肿瘤植入250µg剂量的抗体每4 - 5天。
克隆形成单位化验
骨髓(BM)和脾脏克隆形成单位化验进行与Methocult GF3434介质(干细胞技术)制造商的指示。
定量实时聚合酶链反应分析
肿瘤组织在液氮快速冻结,单一化试剂盒(ThermoFisher) TissueLyser LT(试剂盒)。从单一化组织总RNA提取或巨噬细胞溶菌产物RNeasy迷你包(试剂盒)。反转录成RNA cDNA使用高容量RNA-to-cDNA工具包和执行中存在分析TaqMan快速普遍PCR混合和预先设计大师TaqMan基因表达分析(ThermoFisher)。基因表达是GAPDH正常化,HPRT1或β-Actin使用比较CT(ΔΔCT)方法。
Luminex化验
同基因的细胞系在每6-well 100 000个细胞培养在完全培养基和培养72小时。上层清液通过0.2µm过滤和分析分泌因素/制造商的规格(研发系统)。
流式细胞术分析
单细胞悬浮体和全血被封锁TruStain FcX抗体(Biolegend)和沾fluorophore-conjugated抗体中列出在线补充表3使用标准的染色流式细胞术协议。流式细胞术进行收购一个LSRII (BD生物科学)和分析使用FlowJo V.10.6.1。
BM-derived巨噬细胞化验
BM细胞被离心分离的C57BL / 6小鼠股骨(杰克逊实验室)和细胞溶解红细胞裂解缓冲(Biolegend)。CD11b+细胞被选CD11b微(Miltenyi研究)/制造商的指示。细胞被镀在细胞culture-treated培养皿完成媒体包含40单位重组小鼠- csf (PeproTech) 72小时生产BM-derived巨噬细胞。confluency iCCA细胞系镀在25%完成媒体和培养72小时。Tumour-conditioned媒体是收获和0.2µm过滤器过滤。BM-derived巨噬细胞培养在标准或tumour-conditioned媒体1:1混合标准媒体72小时。细胞用PBS和细胞溶解RLT缓冲区(试剂盒)。
RNA-sequencing和路径分析
人类测序研究50µm FFPE卷轴被削减从患者的肿瘤标本存档在核糖核酸酶自由的条件,并使用KAPA RNA样本准备RNA-sequencing RiboErase HyperPrep装备(HMR)(罗氏)。表达式是使用鲑鱼V.0.9.1量化16与hg38 RefSeq基因。日志2改变了每百万被用于下游分析记录。热图创建使用pheatmap V.1.0.12。人类的微环境细胞群(MCP)计数器分析如前所述。17
鼠标测序研究RNA表达库生成TruSeq滞留mRNA包/制造商的指令和测序进行NextSeq 500或NovaSeq平台(Illumina公司)。RNA读取与GRCm38对齐和基因数量与明星(V.2.6.0a或V2.7.3a)生成的。之间的差异表达蛋白编码基因(度)和对照组与治疗DESeq2 (V.1.30.0)。鼠标MCP计数器分析如前所述。18使用所有重要度(p < 0.05),基因集的表征分析基因本体论(去)条款执行ClusterProfiler (V.3.18.0)。标志亩肌肉基因集得到从msigdbr V.7.4.1。对于基因集富集分析ClusterProfiler (V.3.18.0)。19
统计分析
连续变量进行测试的差异Wilcoxon rank-sum测试或Mann-WhitneyU测试。使用χ分类变量进行了测试2测试。使用一个线性混合效应模型肿瘤生长曲线回归和斜坡而使用Welch-Satterthwaite t检验。使用生存率较相比,kaplan - meier曲线和最重要的人口分界线确定使用survminer包(综合R档案网络)。单变量和多变量Cox比例风险模型构建临床病理的特点。斯皮尔曼等级相关系数是计算之间患者终末期肝病模型(MELD)评分和外周血。30天内死亡率的手术患者被排除在人类生存分析。统计分析进行GraphPad棱镜(V.9.0)、R (V.4.0.3)或JMP Pro (V.14.3.0)。建立了统计学意义,p < 0.05。
结果
人类iCCA Fibroinflammatory肿瘤基质的特征
人类iCCA深刻多见,肿瘤上皮构成少数肿瘤质量。大多数的肿瘤组织而不是由密集的细胞外基质(ECM)组件和与CD45强劲渗透+炎症性白细胞(图1一个)。更好地描述iCCA白细胞浸润,我们进行全断面自动包含IHC分析从病人的免疫标记组织部分切除肿瘤标本。数字分析髓系标记显示iCCA肿瘤由CD68渗透居多+巨噬细胞和CD15+粒细胞(图1 b, C)。相反,分析表明,CD8 T细胞标记+效应T细胞内不太丰富的核心iCCA肿瘤质量,而不是局限于入侵和邻近肝脏的保证金(图1 b, C)。
人类iCCA肿瘤特征突出的多反应与髓细胞升高,和单核细胞的血统的流行系统和局部与整体患者生存。(一)代表图像比较圆)染色,细胞角蛋白7 (CK7)包含IHC染色(胆道上皮细胞),三色的染色(胶原蛋白;蓝色)和CD45包含IHC染色(炎症性白血球)从正常的人类肝脏和iCCA肿瘤组织部分。在200 x放大图像获得的。(B)图像显示代表包含IHC染色CD68 (TAM) CD15 (G-MDSC)和CD8(细胞毒性T淋巴细胞)在正常肝脏、肿瘤利润率和iCCA肿瘤内部。(C)图表比较CD68的表达,CD15和CD8在肿瘤中心区域(n = 35), iCCA肿瘤边缘(n = 28)和正常肝冷漠肿瘤(n = 15)数字量化为每个标记包含IHC染色后使用Aperio积极像素计数算法。酒吧描述意味着±SEM和p值测定Mann-Whitney U测试。* * * * * p < 0.01, p < 0.001。(D)图表显示kaplan meier的生存期方面CCA组分层分析不可切除的患者通过预处理CBC单核细胞和淋巴细胞百分比为低(n = 104)与高(n = 35)单核细胞淋巴细胞比率(M: L)。箭头表示低与高患者的中位总存活数M: L。 (E) Graph shows Kaplan-Meier survival analysis of patients who underwent surgical resection for iCCA stratified by preoperative CBC percent monocytes and lymphocytes into low (n=8) versus high (n=27) monocyte to lymphocyte ratios (M:L). Patients with mortality within 30 days after surgery were excluded from the analysis. Arrows indicate median overall survival of patients with low versus high M:L. (F) CD68 IHC staining in tissue sections from surgically resected patient tumour specimens was digitally quantified, and a Kaplan-Meier survival analysis was performed after patient tumour CD68 staining intensities were stratified into low (n=20) and high (n=10) cohorts. Patients with mortality within 30 days after surgery were excluded from the analysis. Arrows indicate median overall survival of patients with low versus high CD68 staining. Kaplan-Meier p values were determined by log-rank test. CBC, complete blood count; CCA, cholangiocarcinoma, iCCA, intrahepatic cholangiocarcinoma; TAM, tumour-associated macrophage; G-MDSC, granulocytic myeloid-derived suppressor cell.
值得注意的是,CD68+tam代表最丰富的肿瘤和保证金内白细胞入侵(在线补充图1 d, E)。除了突出占据肿瘤本身,CD68+巨噬细胞比例过高的相邻肝实质与non-tumour相邻肝实质相比,表明营养增殖iCCA和CD68之间的关系+巨噬细胞(在线补充图1 b)。
四个免疫亚型的人类iCCA已确定使用14个基因签名来自MCP计数器。20.评估免疫亚型多样性使用URMC队列中MCP基因签名,我们进行批量产生RNA核糖核酸测序存档人类肿瘤的有足够的质量进行分析。MCP分析测序表明iCCA肿瘤标本的免疫寒冷,缺乏特色与适应性免疫相关的基因签名和签名与单核细胞的血统相关的优势,发现符合我们包含IHC研究(图2 c在线补充)。MCP的分层聚类基因签名,然而,有限的异质性和代表不超过两个亚型在我们群(在线补充图2 d)。
提高循环单核细胞和tam预示着糟糕的生存
鉴于我们的观察增加tam iCCA肿瘤内部和相邻,我们试图理解外围动员单核细胞的影响。我们发现monocyte-to-lymphocyte比率(M: L)的完整的血细胞计数画在诊断时预测整体的生存期方面CCA组(不可切除的患者图1 d)。这种联系时显著治疗不断在单变量Cox模型,在协议与其他报告识别升高外周血髓系细胞贩运CCA(患者预后的独立预测指标在线补充表2)。研讨会有趣的是,M: L在诊断时还与内在密切相关的肝功能异常MELD评分不可切除的患者CCA (在线补充图2)。多变量Cox模型,然而,只有确定了化疗或放疗治疗和病人的东部合作肿瘤组性能状态的独立预测因子总体存活率在诊断时(在线补充表2),这表明这些临床因素的影响可能大于M: L组。
尽管如此,病人切除iCCA表现出改进的整体生存当隔离到低与高术前M: L水平(图1 e)。此外,CD68包含IHC分析表明,患者的患病率更高tam经验丰富的外科切除后(整体存活率降低图1 f)。此外,这些病人倾向于减少recurrence-free生存相比,患者在肿瘤microenvironement tam的患病率较低(时间)(我在线补充图1)。
有趣的是,尽管我们观察到类似的预后趋势时询问病人的neutrophil-to-lymphocyte比率(在线补充图1 f),相关研究结果不观察粒细胞myeloid-derived抑制细胞(G-MDSC)内的时间(在线补充图1 g)。CD8的分析+T细胞浸润也不在这群有限的切除iCCA预后患者(在线补充图1 h)。
人类iCCA原地小鼠肿瘤概括
肝肿瘤组织病理学染色和包含IHC分析证明,自发的从人类iCCA KPPC小鼠复制的特点组织病理学与高保真特色突出的多反应与大量的炎症性白细胞(图2一个)。此外,免疫荧光染色F4/80髓系标记显示出明显的增加+单核细胞的和一定程度上的Ly6G+粒细胞性髓系细胞子集肿瘤与控制相比,人类(类似于我们的发现图2 b)。
自发iCCA肿瘤KPPC老鼠概括多和人类疾病的炎症特征。(一)代表图像显示),CK7包含IHC,三色的和CD45包含IHC染色正常肝脏的组织切片同窝出生仔畜控制和建立自发iCCA KPPC老鼠的肿瘤。图像获得200×放大。(B)免疫荧光图像演示F4/80代表染色+TAM或Ly6G+和CK7 G-MDSC(红色)(绿色)和DAPI(核,蓝色)从正常肝脏组织部分同窝出生仔畜控制和建立iCCA KPPC老鼠的肿瘤。图像获得400×放大。流式细胞术(C)代表情节显示控制策略确定骨髓细胞子集在正常肝脏从同窝出生仔畜控制和建立iCCA肿瘤KPPC老鼠。(D)图比较普遍的骨髓细胞子集通过流式细胞术分析在正常肝脏从同窝出生仔畜控制(n = 13)和渗透建立iCCA KPPC小鼠的肿瘤(n = 12)。酒吧表明意味着±SEM, Mann-Whitney测定和p值U测试。* * * * P < 0.0001。(E)饼图展示了患病率KPPC iCCA tumour-infiltrating免疫细胞子集CD45的百分之一+白细胞通过流式细胞术分析决定。CK7,细胞角蛋白7;iCCA,肝内胆管癌;Mo-MDSC,单核细胞的骨髓抑制细胞;tam,肿瘤相关巨噬细胞;G-MDSC,粒细胞myeloid-derived抑制细胞。
与tam鼠iCCA主要是渗透
为了更好地描述iCCA白细胞浸润,我们进行了流式细胞术分析KPPC肿瘤和正常肝同窝出生仔畜控制。与人类包含IHC研究一致,流式细胞术CD45验证+炎症在肿瘤白细胞明显升高(在线补充图3 a, B)。这些白血球CD11b为主+髓细胞,大多数这些细胞Ly6G低,Ly6C低,F4/80+、CD68+,MHCII+tam (图2 c, D,在线补充图3 a, C)。事实上,虽然Ly6C高,Ly6G低单核细胞的myeloid-derived抑制细胞(Mo-MDSC)和Ly6C低,Ly6G高G-MDSCs也显著升高与控制相比,数量大大超过其他骨髓tam子集相结合,增加了> 200倍与正常肝(图2 c, D)。
小鼠iCCA驱动器替代tam的两极分化
为了理解在iCCA tam的功能特点,BM-derived巨噬细胞暴露在tumour-conditioned媒体和使用中存在的分析评估与选择相关的基因的表达(M2)巨噬细胞的分化。Tumour-conditioned媒体前所述鼠iCCA细胞系强烈诱导的转录__arg1和Mrc1,符合替代分化tam对免疫抑制表型(在线补充图3 e)。24日25日
KPPC派生iCCA表现出淋巴细胞微环境
人类基因的研究时间签名证明iCCA主要是与免疫相关细胞群冷微环境(在线补充图2 c, D)。评估时间基因异质性的细胞群KPPC iCCA小鼠模型,我们进行了批量RNA-sequencing和小鼠MCP计数器(mMCP)分析与RNA隔绝KPPC iCCA肿瘤。类似于我们的发现在人类iCCA mMCP分析KPPC肿瘤显示突出的髓细胞和成纤维细胞的基因签名相对较低的基因适应性免疫细胞群签名(在线补充图3 d)。值得注意的是,流式细胞仪分析表明,虽然时间拥有近10倍增加白细胞与正常小鼠肝实质(在线补充图3 a, B),绝大多数的这些细胞是骨髓来源(图2 e,在线补充图3 a, C, F-H)。的KPPC iCCA模型从而相似的人类疾病表型和代表了一个强大的模型研究癌和周围的基质之间的相互作用。
iCCA-BM相声诱发骨髓形成和髓细胞的动员
从我们的研究结果表明,先进的CCA和可切除的患者iCCA演示了一个糟糕的预后当受试者表现出升高外周血髓系细胞比率(图1 d, E;在线补充图1 f),我们试图理解机制iCCA诱导髓系细胞生产和招募自发iCCA肿瘤。存在分析KPPC iCCA肿瘤显示的3 - 1000倍增加集落刺激因子的表达与正常肝(图3一)。值得注意的是,集落刺激因子(gm - csf这些细胞因子的最高境界。
iCCA肿瘤诱导骨髓形成和系统性积累髓细胞。(A)中存在的分析显示意味着折叠集落刺激的正常化mRNA表达水平变化等因素csf,gm - csf和g - csf在正常肝脏从同窝出生仔畜控制(n = 10)相比,建立从KPPC iCCA肿瘤小鼠(n = 8)。(B)图比较CFU-GM在骨髓和脾细胞悬液与同窝出生仔畜控制和隔离KPPC小鼠建立iCCA肿瘤。n = 6 - 7每组。(C和D)图表比较意味着褶皱的正常化mRNA表达水平变化碳碳趋化因子受体2型(CCR2)配体(C)和C-X-C趋化因子受体2型(CXCR2)配体(D)在正常肝脏从同窝出生仔畜控制(n = 10)和建立iCCA KPPC老鼠(n = 8)的肿瘤中存在的分析。流式细胞仪(E, G和I)代表情节显示控制策略定义骨髓细胞悬浮液的子集骨髓单核细胞(E),脾细胞(G)和外周血(I)同窝出生仔畜控制和KPPC小鼠建立iCCA肿瘤。(F、H和J)图比较Ly6C的患病率+单核细胞和Ly6G+在骨髓粒细胞(F, n = 12 - 13 /组),脾脏(H, n = 12 - 13 /组)和外周血(J, n = 11 - 13 /组)同窝出生仔畜控制和KPPC小鼠建立iCCA肿瘤。所有酒吧表明意味着±SEM, Mann-Whitney测定和p值U测试。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。gm - csf集落刺激因子;g - csf粒细胞集落刺激因子;GM-CFUs granulocyte-macrophage菌落;iCCA,肝内胆管癌;csf巨噬细胞集落刺激因子;存在,定量实时聚合酶链反应。
此外,tumour-bearing老鼠表现出增加BM和脾细胞克隆形成单位与控制相比,表明iCCA诱发这些隔间支持造血的祖细胞的扩张增加粒细胞和单核细胞的骨髓形成(图3 b)。因此,流式细胞仪分析表明,粒细胞和单核细胞显著增加在大英博物馆,脾脏和外周血KPPC tumour-bearing老鼠相比,同窝出生仔畜控件(图3 e-j)。此外,存在分析表明iCCA肿瘤表达CCR2和CXCR2配体含量严重超标,两个规范对招聘单核细胞和粒细胞趋化因子受体信号通路的时间(图3 c, D)。26日27日
治疗的封锁gm - csf抑制原地KPPC iCCA
gm - csf iCCA肿瘤表达的是最高架集落刺激因子(图3一),它在骨髓形成中发挥着关键作用,骨髓细胞编程在急性和慢性炎症。28因此,我们试图测试阻塞的影响gm - csf iCCA信号在我们自发的小鼠模型。为此,KPPC老鼠与新开发的肝脏肿瘤(在线补充图4)连续治疗试验评估录取封锁ofGM-CSF与单克隆抗体(ɑgm - csf)相比,免疫球蛋白(免疫球蛋白)(同形像控制图4一)。在疾病发作,这些老鼠表现出相似的年龄、性别、疾病分布及肿瘤大小(在线补充表4)。KPPC建立小鼠肿瘤治疗ɑgm - csf表现出抑制肿瘤生长(图4 a, B),增加了延迟的发展多病灶的肝脏肿瘤(图4 c)和增加生存与免疫球蛋白治疗控制(图4 d)。综上所述,gm - csf中和独自坚决阻止原地iCCA小鼠肿瘤的进展和延长生存。这些发现表明,gm - csf信号轴iCCA肿瘤生长和发展中扮演着重要角色。
系统性的gm - csf中和减少自发iCCA肿瘤负担和增加KPPC老鼠的生存。(A)图像显示代表的肿瘤声像图横截面区域疾病发作时(0)和治疗27天。红色和蓝色的边界轮廓最大的b型肿瘤代表性的地区。总容积面积量化与Vevo实验室三维重建后的软件。总肿瘤体积显示在括号中。(B)图比较3 d KPPC小鼠肿瘤体积的变化随着时间开始后的免疫球蛋白治疗控制(n = 12)或ɑgm - csf (n = 12)。肿瘤生长曲线是使用线性混合效应模型回归和斜坡而使用Welch-Satterthwaite t检验。(C)图比较多病灶的疾病发病时间KPPC老鼠当作表示。酒吧描述意味着±SEM和p值测定Wilcoxon rank-sum测试。* p < 0.05。 (D) Kaplan-Meier curve compares overall survival of KPPC mice treated with IgG (n=12) versus ɑGM-CSFF (n=12). P value was determined by log-rank test. 3D, three-dimensional; GM-CSF, granulocyte–macrophage colony-stimulating factor; iCCA, intrahepatic cholangiocarcinoma;
gm - csf中和降低骨髓免疫抑制促进细胞毒性T细胞参与
评估机制抑制iCCA发展针对gm - csf封锁,同系的小鼠细胞系生成从句KPPC iCCA肿瘤(在线补充图5)。Orthotopically注入URCCA4.3肿瘤自发iCCA忠实地概括,包括开发一个健壮的fibroinflammatory肿瘤间质(在线补充图5 c)。此外,CD8和CD4 T细胞耗竭tumour-bearing小鼠注射URCCA4.3行授予没有区别在生存与免疫球蛋白治疗控制相比,证明缺乏内源性免疫的原位模型(在线补充图6 l)。最后,Luminex URCCA分析小鼠细胞系证明carcinoma-derived集落刺激因子的生产,特别是gm - csf (在线补充图5 b)。
为了评估免疫动力学iCCA肿瘤治疗ɑgm - csf,群小鼠建立原位肿瘤URCCA4.3ɑgm - csf或免疫球蛋白治疗,疗程2和4周之前牺牲和流式细胞术分析切除肿瘤。URCCA4.3肿瘤治疗ɑgm - csf与免疫球蛋白治疗相比小得多的控制验证我们的发现在自发动物(图5一个)。流式细胞术分析2周和4周肿瘤治疗ɑgm - csf了TAM浸润显著减少(图5 b, C;在线补充图6 b)。与此同时,Mo-MDSCs和G-MDSCs保持不变的比例在两个时间点(图5 c;在线补充图6 a, B)。然而,表型,骨髓细胞子集(tam, Mo-MDSC和G-MDSC)被发现了的表情__arg1和PD-L1体内(图5 b,曹磊)。此外,gm - csf封锁导致CD11c没有明显的差异+树突细胞、CD4+辅助T细胞或具体+调节性T细胞在时间(在线补充图6 c, D, F, G, I, J)。
中和的gm - csf减少tumour-infiltrating单核细胞的谱系,增强抗肿瘤T细胞免疫力。(A)图比较切除肿瘤重量orthotopically URCCA4.3植入肿瘤后建立和处理同形像控制(n = 5)或anti-GM-CSF (n = 5)抗体为17天。流式细胞术(B)代表情节演示控制策略确定或者激活TAM原位URCCA4.3肿瘤治疗14天后显示。(C)流式细胞术分析比较Mo-MDSCs的患病率和tam后建立了原位URCCA4.3肿瘤与免疫球蛋白治疗控制(n = 7)或anti-GM-CSF (n = 8) 28天。(D, E, F)图表比较__arg1的患病率+__arg1 Mo-MDSCs (D)+tam (E)和__arg1+G-MDSCs (F)治疗后28天。流式细胞术(G)代表识别PD-L1情节演示控制策略+Mo-MDSC小鼠建立原位URCCA4.3肿瘤治疗后28天表示。(H I和J)图表比较PD-L1的患病率+PD-L1 Mo-MDSC (H)+tam (I)和PD-L1+G-MDSC (J)通过流式细胞术分析后建立URCCA4.3肿瘤与免疫球蛋白治疗控制(n = 7)或anti-GM-CSF (n = 8) 28天。流式细胞术(K)代表情节演示控制策略确定tumour-infiltrating T细胞亚群小鼠建立原位URCCA4.3肿瘤治疗后28天表示。(L)图比较tumour-infiltrating细胞毒性CD8的患病率+T细胞后建立URCCA4.3肿瘤与免疫球蛋白治疗控制(n = 7)或anti-GM-CSF (n = 8) 28天。(M)图表显示的患病率tumour-infiltrating PD1+CD8 T细胞通过流式细胞术分析小鼠后轴承原位URCCA4.3肿瘤与免疫球蛋白治疗控制(n = 7)或anti-GM-CSF (n = 8) 28天。(N) kaplan meier曲线比较整体的生存CD8耗尽URCCA4.3 tumour-bearing小鼠免疫球蛋白治疗(N = 15)或anti-GM-CSF (N = 14)。P值取决于生存率较。(O和P)图表比较外周血的患病率(O)和骨髓(P)小鼠的单核细胞和粒细胞通过流式细胞术分析轴承原位URCCA4.3肿瘤与免疫球蛋白治疗14天之后控制(n = 8)或anti-GM-CSF (n = 8)。(Q)图显示了小鼠的外周血与骨髓单核细胞比率轴承原位URCCA4.3 14天的治疗后肿瘤与免疫球蛋白控制(n = 8)或anti-GM-CSF (n = 8)。所有图酒吧描绘意味着±SEM, Mann-Whitney测定和p值U测试。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。__arg1、精氨酸酶1;BM,骨髓;G-MDSC粒细胞myeloid-derived抑制细胞;gm - csf,集落刺激因子;Mo-MDSC,单核细胞的myeloid-derived抑制细胞;ns,不重要;PB,外周血;PD1,程序性细胞死亡蛋白1; PD-L1, programmed death ligand 1; TAMs, tumour-associated macrophages.
外围地,ɑgm - csf治疗显著降低tumour-bearing老鼠血液中的单核细胞,粒细胞保持不变(图5啊)。在大英博物馆,单核细胞的比例是不变的;然而,ɑgm - csf治疗小鼠表现出高数量的BM粒细胞(图5 p)。此外,ɑgm - csf治疗预防动员BM进入血液的单核细胞在iCCA tumour-bearing老鼠,就是明证降低外周血单核细胞的BM比(图5问)。有趣的是,脾单核细胞和粒细胞比例不变和ɑgm - csf治疗(在线补充图6 k)。
单核细胞分化成__arg1的系统性的威慑+和PD-L1+tam和削弱MDSC表达式__arg1和PD-L1伴随着相应CD8的涌入+效应T细胞治疗2周和4周后ɑgm - csf,也发现PD1上调表达,暗示了激活细胞毒性29日相比之下,免疫球蛋白治疗控制(图5 km;在线补充图6 e、H)。损耗的CD8 T细胞导致废除ɑgm - csf tumour-bearing治疗疾病控制的老鼠显示gm - csf与髓细胞防止信号自适应抗肿瘤免疫反应(图5 n)。
综上所述,gm - csf的中和钝化骨髓细胞贩运和抑制能力,促进渗透iCCA肿瘤细胞毒性T细胞,导致肿瘤的克制。
gm - csf封锁逆转tumour-induced骨髓形成和M2 tam的两极分化
gm - csf中和对单核细胞影响最大的动员和招聘tam的原位iCCA的小鼠模型。因此,我们试图理解的功能影响gm - csf封锁骨髓形成和M2 tam的两极分化。为此,BM单核细胞和脾细胞是从URCCA4.3 tumour-bearing老鼠和ɑgm - csf或免疫球蛋白治疗后17天来评估认为造血祖细胞CFU化验的增长潜力。显著降低CFU gm - csf封锁在BM单核细胞和脾细胞证明中起着重要的作用的扩张granulocyte-macrophage祖细胞潜在iCCA tumour-induced骨髓形成(图6)。
gm - csf信号封锁减少monopoiesis,可行性和替代分化的巨噬细胞在肿瘤微环境。(A)图比较CFU-GM骨髓单核细胞和脾细胞悬浮液从小鼠分离轴承建立原位URCCA4.3 17天的治疗后肿瘤与免疫球蛋白控制(n = 5)或anti-GM-CSF (n = 5)。(B)图表显示意味着每个培养后骨骨髓来源的可行的细胞数量巨噬细胞含有免疫球蛋白在媒体URCCA4.3条件控制(n = 6)或anti-GM-CSF中和抗体(n = 6)为72小时。流式细胞术(C)代表phosphorylated-Signal换能器的柱状图和转录激活5 (pSTAT5)在F4/80染色+骨骨髓来源的巨噬细胞培养与免疫球蛋白URCCA4.3条件媒体控制(n = 6)或anti-GM-CSF中和抗体(n = 6)为72小时。(D)图比较了MFI F4/80 pSTAT5染色+骨骨髓来源的巨噬细胞培养在媒体URCCA4.3条件与免疫球蛋白控制(n = 6)与anti-GM-CSF中和抗体(n = 6)为72小时。(E)的热图显示了前25的表达式和底部25大多数差异表达蛋白编码基因(度)RNA-seq分析骨骨髓来源的巨噬细胞培养与免疫球蛋白URCCA4.3条件媒体控制(n = 6)或anti-GM-CSF中和抗体(n = 6)为72小时。结果以前过滤包含度基于p值< 0.05和日志2褶皱变化<−1.0或> 1.0。(F)图表显示定量实时PCR(存在)的分析选择下调度取决于RNA-seq参与M2两极分化在骨骨髓来源的巨噬细胞培养和免疫调制URCCA4.3-conditioned媒体与免疫球蛋白控制(n = 6)或anti-GM-CSF中和抗体(n = 6)为72小时。(G)表显示了前20名表达下调基因本体论(去)生物过程在URCCA4.3骨骨髓来源的巨噬细胞培养条件媒体和gm - csf中和后原位URCCA4.3肿瘤。强调了术语表示收敛路径在骨骨髓来源的巨噬细胞和URCCA4.3肿瘤。所有图酒吧描绘意味着±SEM, Mann-Whitney测定和p值U测试。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。小额信贷机构,平均荧光强度;CFU-GM granulocyte-macrophage克隆形成单位;gm - csf,集落刺激因子。
研究gm - csf封锁的功能作用在iCCA tam, BM-derived巨噬细胞培养在URCCA4.3 tumour-conditioned介质有或没有ɑgm - csf中和抗体为72小时。中和的gm - csf体外显著降低巨噬细胞生存能力,和流式细胞术分析了TAM衰老与转录信号传感器和催化剂降低5 (STAT5)磷酸化(图6罪犯)。
进一步评估功能变化在tam gm - csf封锁,我们也执行RNA-seq tumour-educated分析巨噬细胞的存在和缺乏gm - csf的中和抗体。RNA-seq分析显示超过1600个差异表达蛋白编码基因的变化(度)中和后,证明gm - csf全球对巨噬细胞基因转录的影响(在线补充图7),(在线补充表5)。25个最明显,衰减度表明,gm - csf广泛的监管与巨噬细胞功能和分化相关的基因(图6 e)。存在分析证实减少多个基因的表达与免疫抑制M2表型包括有关Mrc1, Msr1和__arg1和基因潜在的慢性炎性通路(图6 f)。一致与我们的体内流式细胞术结果,这些巨噬细胞也表达了更少的成绩单的细胞程序性死亡配体1和2 (PD-L1和PD-L2)当剥夺gm - csf (图6 f)。
代表分析(ORA)的表达下调度表明,gm - csf剥夺tumour-educated巨噬细胞表现出减少基因本体(去),炎症反应,调节细胞因子的生产,以及对细胞因子等途径(图6克;在线补充表6)。此外,使用MSigDB特征基因集度的途径分析表明,gm - csf剥夺tumour-educated巨噬细胞度显示减少一些炎症通路包括TNFɑ信号通过NF-Κb和白细胞介素6木菠萝STAT3信号强调gm - csf的多效性的影响免疫信号通路(图6 c在线补充)。存在分析原位iCCA肿瘤治疗ɑgm - csf还显示显著减少度与M2巨噬细胞分化和慢性炎症通路与免疫球蛋白控制演示ɑgm - csf的功效换向TAM-mediated体内炎症的项目(在线补充图6 b;在线补充表7)。事实上,表达下调的分析度在ɑgm - csf治疗肿瘤显示减少先天免疫反应,炎症反应,趋化因子和响应,这相当重叠与gm - csf剥夺了tam体外的生物过程。(图6克;在线补充表8)。此外,我们没有观察到显著的表达的变化Csf1,Csf2或Csf3ɑgm - csf -和IgG-treated肿瘤,这表明没有其他集落刺激因子补偿损失的TAM招聘在响应gm - csf封锁(iCCA肿瘤在线补充图7 b)。
相比下调度,调节度的奥拉分析ɑgm - csf tumour-educated巨噬细胞表现出显著的治疗与血管相关几个方面去改造包括血管生成,血管发展和血管发展(在线补充表9)。测试这些调节基因签名是否影响基质重塑体内,小天狼星红染色了数字量化ɑGM-CSF-treated和IgG-treated原位肿瘤,这表明在胶原蛋白沉积无统计学差异(在线补充图7 e, F)。
有趣的是,ɑGM-CSF-treated tumour-educated巨噬细胞没有表现出任何重叠在调节度与ɑGM-CSF-treated肿瘤(在线补充表7和10)。在肿瘤,调节术语集群在透明质酸大会在线补充表10)。
综上所述,这些数据表明,ɑgm - csf治疗减少了M2 TAM在肿瘤发病率减少向protumoural TAM生存和分化表型。此外,repolarisation tam与gm - csf中和导致先天炎症网络的静止。
表达人类iCCA gm - csf的预后
为了评估的临床影响gm - csf表达人类iCCA碰头的,包含IHC分析gm - csf进行整个组织部分和数字量化。包含IHC分析表明显著增加表达gm - csf的癌变上皮与相邻的肝实质(图7 a, B)。此外,gm - csf表达的程度对总体生存在我们群切除预后iCCA患者(图7 c)。
gm - csf表达在人类肿瘤iCCA升高,及其与生存水平负相关。(一)代表图像显示gm - csf表达包含IHC染色的组织从正常的人类肝脏和iCCA肿瘤部分。在200 x放大图像获得的。(B)图比较gm - csf表达在邻近肝脏(n = 27)与iCCA肿瘤(n = 27)数字量化包含IHC染色后使用Aperio积极像素计数算法。酒吧表明意味着±SEM和p值测定Wilcoxon rank-sum测试。* * * * p < 0.0001。(C) kaplan meier曲线比较患者总生存期术后切除后iCCA gm - csf在病人肿瘤部分包含IHC染色强度的数字量化和分层低(n = 11)、高(n = 19) gm - csf表达的淋漓尽致。患者手术后30天内死亡率被排除在分析之外。P值取决于生存率较。gm - csf,集落刺激因子; iCCA, intrahepatic cholangiocarcinoma.
讨论
胆管癌已经证明一个棘手的临床问题,有限的有效疗法。目前,很少有免疫能力的临床前模型,忠实地概括人类疾病的体系结构和免疫渗透。我们现在工作在一个原地小鼠模型和小说原位模型使用同源的iCCA细胞系在我们实验室开发,为评估提供一个健壮的平台间质和免疫靶向治疗。
我们表明,gm - csf的封锁信号防止招聘和成熟单核细胞的抑制CD206+tam在iCCA体内的身上。此外,tam允许CD8的损耗+T细胞浸润和激活,导致疾病控制。有趣的是,当其他骨髓定位策略导致骨髓补偿替代免疫抑制骨髓细胞,26 30-33gm - csf封锁并没有导致单核细胞的或粒细胞MDSCs患病率的增加。相反,粒细胞和单核细胞被发现的比例不变表达少__arg1 PD-L1,暗示pan-myeloid repolarisation远离一个免疫抑制表型。
机械化,gm - csf封锁重组巨噬细胞表达抑制少配体如PD-L1 PD-L2和M2 CD206等替代分化的标志,CD204 __arg1。与此同时,ɑgm - csf治疗体外巨噬细胞生存能力明显受损。综上所述,这些数据表明ɑgm - csf治疗切除tam减少可行性和两极分化,释放抗肿瘤免疫力。因此,iCCA肿瘤也证明减少先天与慢性炎症相关信号通路当M2 tam与ɑgm - csf有针对性的治疗。
gm - csf施加其影响绑定的同源受体在靶细胞导致通过PI3K和AKT维护细胞的生存。34高浓度的gm - csf诱导两种生存和通过STAT5-mediated增殖通路在目标细胞基因转录。34 35不足为奇的是,我们的实验证明削弱pSTAT5信号后gm - csf封锁,这可能在一定程度上解释观察到的变化tumour-educated巨噬细胞的转录组。
外围地,gm - csf封锁导致减少生产tumour-directed骨髓祖细胞在大英博物馆和tumour-bearing小鼠的脾脏。此外,ɑgm - csf治疗受损动员从大英博物馆到外周血单核细胞。值得注意的是,重组gm - csf已经用于治疗某些neutropaenias36;因此,阻止这个轴的一个担忧是neutropaenia的脱靶效应;然而,治疗小鼠免受粒细胞计数在大英博物馆展出,脾脏和外周血。
在肝胆的癌症,T细胞排斥是至少部分由骨髓肿瘤微环境中的免疫抑制。26日37 38此外,iCCA子类型根据免疫渗透,改善预后与增加细胞毒性和肿瘤辅助T细胞签名和糟糕的预后与单核细胞的渗透时白细胞。20.有趣的是,gm - csf是涉及生产和招募MDSCs在肝细胞癌和胰腺导管腺癌。39 40此外,致癌RAS已被证明驱动肿瘤衍生的gm - csf的生产,41这些突变预示着更积极iCCA疾病。42符合这些早先的研究中,我们观察到贩卖人口的增加和单核细胞的渗透和粒细胞抑制细胞iCCA患者的外周血和时间。值得注意的是,gm - csf表达在肿瘤预后。这些观察结果支持我们的临床前研究表明骨髓细胞的gm - csf轴作为中心中介招聘和iCCA进展。
结论
iCCA实现T细胞排斥tam和MDSCs的诱导骨髓形成和招聘。gm - csf是髓系细胞生产的关键驱动因素和免疫抑制的编程,和治疗的封锁gm - csf强有力地抑制M2 tam导致增强细胞毒性T细胞渗透和激活无偿MDSC的数量(图8)。gm - csf定位策略应该调查作为一种增加治疗iCCA可用。
胆管癌派生的gm - csf协调全身和局部编程单核细胞的骨髓细胞的血统,增强肿瘤生长和扩散(面板)。gm - csf,集落刺激因子;PD-L1,细胞程序性死亡配体1。
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脚注
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