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  • 单细胞测序揭示不同的免疫微环境与人类慢性胰腺炎CCR6-CCL20相声

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胰腺
原始研究
单细胞测序揭示不同的免疫微环境与人类慢性胰腺炎CCR6-CCL20相声
  1. Bomi李1,2,
  2. 香港Namkoong1,
  3. 燕杨3,
  4. 黄黄4,
  5. 大卫·海勒5,
  6. 格雷戈里·L Szot6,
  7. 马克·M·戴维斯4,7,8,
  8. Sohail Z侯赛因2,
  9. Stephen J Pandol9,
  10. 黑粪症D Bellin5,10,
  11. Aida Habtezion1,4
  1. 1胃肠病学和肝脏病学,医学系的,斯坦福大学医学院的,斯坦福大学,加州美国
  2. 2儿科胃肠病学分工、肝病、营养、儿科,斯坦福大学医学院的,斯坦福大学,加州美国
  3. 3斯坦福大学基因和个性化医疗中心,斯坦福大学,斯坦福大学,加州美国
  4. 4研究所免疫、移植和感染,斯坦福大学,斯坦福大学,加州美国
  5. 5外科学系,Schulze糖尿病研究所,明尼苏达大学医学中心,明尼阿波里斯市,明尼苏达州美国
  6. 6部手术,移植分工,加州大学旧金山,旧金山,加州美国
  7. 7微生物学和免疫学,斯坦福大学医学,斯坦福大学,加州美国
  8. 8霍华德•休斯医学研究所,斯坦福大学,斯坦福大学,加州美国
  9. 9基本和转化胰腺癌研究,雪松西奈山医学中心,洛杉矶,加州美国
  10. 10儿科,明尼苏达大学医学中心和共济会儿童医院,明尼阿波里斯市,明尼苏达州美国
  1. 对应到胃肠病学和肝脏病学分工Bomi Lee博士医学院的斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国;bomilee在}{stanford.edu;Aida Habtezion博士;aidah在}{stanford.edu

文摘

客观的慢性胰腺炎(CP)是一种潜在致命的外分泌胰腺的疾病,没有特定的或有效的批准的疗法。由于访问困难胰腺组织,对局部免疫反应或发病机制在人类CP。我们试图描述胰腺癌免疫反应使用组织来自不同目的的CP患者和non-CP器官捐赠者以识别关键信号分子与人类CP。

设计我们进行单细胞水平细胞转录组和抗原表位的索引顺序和t细胞受体(TCR)测序胰腺癌免疫细胞与器官捐赠者,遗传和特发性CP患者接受全胰切除术。我们验证了基因表达数据进行流式细胞术和功能化验CP患者队列。

结果深单细胞测序显示不同的免疫特点和明显丰富CCR6+CD4+T细胞在遗传与特发性CP。在遗传CP相比,减少由于增加CD4 T细胞观察单克隆+取代tissue-resident CD8 T (Th)细胞+T细胞。共享中TCR clonotype分析t细胞谱系CCR6也推出了独特的相互作用+Th和Th1子集,识别聚类分析显示独特的遗传CP中常见的抗原结合主题。此外,我们观察到的一个重要upregulation CCR6配体(CCL20)表达单核细胞中遗传CP相比与特发性CP CCR6表达CD4的功能意义+证实了T细胞流式细胞术和趋化性试验。

结论单细胞测序与胰腺癌免疫细胞在人类CP强调pancreas-specific免疫相声CCR6-CCL20轴,一个信号通路可能杠杆在人类遗传CP作为未来潜在的目标。

  • 胰腺炎
  • 免疫学
  • t细胞受体
  • 慢性胰腺炎
  • RNA表达

数据可用性声明

合理的请求数据。所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。所有原材料测序数据与基因表达综合数据库,存放GSE165045。可以在代码用于数据分析https://github.com/yangysheep2018/CITE-seq-TCR_paper。所有其他数据处理中可用的主要文本或补充材料。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一个开放的分布式条依照创作共用署名非商业性(4.0 CC通过数控)许可证,允许别人分发,混音,适应,建立这个工作非商业化,和许可他们的衍生产品在不同的协议,提供了最初的工作是正确地引用,给出合适的信用,任何更改表示,非商业使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/。

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2021 - 324546

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 慢性胰腺炎(CP)被认为是一个不可逆转的fibroinflammatory胰腺疾病和仍然是一个主要来源的发病率没有活跃的批准治疗胃肠疾病。

    • 炎症是一种已知的标志和贡献者CP发病机理。然而,对局部免疫反应在人类CP的胰腺,特别是他们如何在目的可能有所不同。

    有什么新发现吗?

    • 单细胞RNA序列胰腺CP患者免疫细胞和器官捐赠者显示不同的免疫转录组特性CP和十几控制以及在遗传和特发性CP。

    • 单细胞的t细胞受体(TCR)测序公布pancreas-specific克隆在CD8的扩张+T细胞和CD4+T细胞驱动器独特TCR曲目世袭CP的变化。

    • 我们发现CCR6-CCL20轴显著调节与控制相比,遗传CP或特发性CP,暗示人类遗传CP的未来目标。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 这项研究的结果改善我们对CP异质性的理解和识别不同的免疫反应在不同类型的人类CP,提供新颖的概念方向潜在的治疗策略治疗遗传性和特发性CP。

    • CCR6-CCL20轴中发现遗传CP是小说和潜在的通道信号通路治疗遗传性的CP。

    介绍

    慢性胰腺炎(CP)是一个进步fibro-inflammatory外分泌胰腺疾病和发病率的主要来源,但它仍是一种无法治愈的疾病。1 2CP的特点是胰腺形态的变化包括腺泡的细胞萎缩,胰腺导管扭曲,炎症和纤维化。3 4在成人CP主要危险因素包括酒精和吸烟,而基因变异和特发性因素是所有年龄段的重要贡献者CP。1 5 - 8在过去的二十年里,许多动物模型已经被用来理解疾病致病机制CP。9日10然而,关于临床前研究的转化精度问题仍然存在。例如,大多数胰腺炎动物研究依赖于disease-inducing代理人不得模仿人类CP条件。11因此,研究人类胰腺组织是至关重要的在CP理解人类针对疾病的致病机制。

    炎症是CP的标志,4日12和免疫细胞已成为关键贡献者CP及其进展。13日14例如,抗炎(M2)巨噬细胞已观察到不同类型的CP实验模型15日16并通过他们的相声为CP纤维发生胰腺星状细胞(已经)。17越来越多的研究证明了关键作用的免疫细胞在CP的疾病进展的不同阶段为该病提供潜在的治疗靶点。18 - 20然而,免疫特征仍然没有得到很好的理解人类CP由于缺乏人类胰腺组织,和疾病目的疾病异质性的贡献仍然是未知的。

    与一个机构合作执行大量的全胰切除术患者胰岛自体CP,我们初步研究使用流仪分析和大量t细胞受体(TCR)测序显示不同的免疫反应之间的遗传和特发性CP,暗示不同immunopathogenic机制这两个不同亚型的CP。21然而,这最初的研究是有限的深度,详细评估免疫细胞组成的差异和t细胞反应遗传和特发性CP之间没有探索。识别独特的免疫信号和分子独特的亚型CP提出我们对这种疾病immunopathogenic机制的理解。在这里,我们执行细胞转录组的索引和抗原表位进行排序(CITE-seq)(结合单细胞antibody-derived标记和RNA序列)22细胞受体)和单细胞测序(scTCR-seq)的免疫细胞与人类CP患者胰腺组织和器官捐赠者获得深入的了解与疾病相关的免疫反应。无偏系统性分析的免疫签名包括评估蛋白表达、转录组和TCR剧目胰腺癌免疫细胞的分析,揭示aetiology-specific免疫细胞签名和交互。这些数据提供了见解新颖的免疫信号通路,并提供未来潜在的治疗目标为人类CP (s)。

    结果

    人类胰腺癌免疫细胞转录图谱揭示独特的针对疾病的签名在CP

    外分泌胰腺组织收集的器官捐赠者的第一组(n = 3)和CP(世袭,n = 5和特发性n = 4)病人全胰切除术(表1,在线补充表1、2所示和在线补充图S1A, B)被用来隔离免疫细胞的免疫细胞浓缩方法和fluorescence-activated细胞排序。21接下来,排序CD45生活+胰腺癌免疫细胞进一步CITE-seq沾染了13个不同的表面蛋白抗体。染色细胞经历了droplet-based gel-bead条码系统(10×基因组学),23使建设独立的地图immunophenotypes表面蛋白的表达,转录组(5 '单细胞RNA序列(scRNA-seq)和TCR曲目(scTCR-seq)同时在同一个细胞(图1一个和在线补充表3)。在质量控制(在线补充图就是S1C)和删除对比,我们保留共有28 547单个细胞和基因表达数据进行聚类分析。这揭示了17个不同的细胞群,得到了统一的歧管近似和投影(UMAP)嵌入的(图1 b和在线补充数据1)。细胞群被注释的基于特定的基因表达模式,从分类各种推断人类单一免疫细胞RNA-seq研究(图1 c和在线补充图S2A)。24 - 26日胰腺癌的主要类的免疫细胞,我们确定了控制和CP样本T细胞,骨髓细胞,B细胞和肥大细胞(图1 b和在线补充图开通)。明显,细胞没有集群拓扑实验批或者个人样本,而是从每组细胞(控制、遗传或特发性CP)组合在一起以一种独特的方式,强调疾病的影响及其对免疫转录组(病因学图1 d和在线补充图S2C)。

    Human pancreatic immune cell transcriptional atlas. (A) Experimental design for single-cell sequencing (cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing and TCR-seq) of pancreatic immune cells from patients with CP and non-diseased control donors. (B) UMAP plot of all 28 547 pancreatic immune cells from patients with CP (five hereditary and four idiopathic CP) and three control donors presenting 17 clusters (MAC, macrophages; Mono/Mac, monocytes and macrophages; pDCs, plasmacytoid dendritic cells). (C) Heatmap of signature gene expression Z scores across cells. (D) UMAP plot of pancreatic immune cells including 4169 cells from control donors, 11 786 cells from hereditary CP and 12 592 cells from idiopathic patients with CP coloured based on the group (Ctl, control; Her, hereditary CP; Idio, idiopathic CP). (E) Cell cluster frequency shown as a fraction of clusters from total cells in each patient or donor. (F) The frequency of 17 immune clusters defined by scRNA-seq clustering analysis shown as an average proportion of each cluster within each group. One-way analysis of variance Kruskal-Wallis test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). The comparison of each pair was differentiated by colour: between Ctl and Her, Pink; between Ctl and Idio, Teal; between Her and Idio, Black. CP, chronic pancreatitis; scRNA-seq, single-cell RNA sequencing; scTCR-seq, single-cell TCR sequencing; TCR, T-cell receptor; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    人类胰腺癌免疫细胞转录图谱。单细胞测序(A)实验设计(细胞转录组的索引和抗原表位进行排序和TCR-seq)胰腺癌患者免疫细胞的CP和十几控制捐助者。(B) UMAP块28 547 CP患者胰腺癌免疫细胞(五个世袭和四个特发性CP)和三个控制捐助者提供17集群(MAC,巨噬细胞;Mono / Mac,单核细胞和巨噬细胞;髓,血浆树突细胞)。(C)的热图的签名在细胞基因表达Z分数。(D) UMAP情节的胰腺癌免疫细胞,包括4169细胞控制捐助者、11 786细胞遗传CP和12 592个细胞从特发性CP患者彩色根据集团(Ctl,控制;她,世袭CP;个性,特发性CP)。(E)细胞集群频率显示为集群从总细胞的一小部分在每个病人或捐赠。 (F) The frequency of 17 immune clusters defined by scRNA-seq clustering analysis shown as an average proportion of each cluster within each group. One-way analysis of variance Kruskal-Wallis test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). The comparison of each pair was differentiated by colour: between Ctl and Her, Pink; between Ctl and Idio, Teal; between Her and Idio, Black. CP, chronic pancreatitis; scRNA-seq, single-cell RNA sequencing; scTCR-seq, single-cell TCR sequencing; TCR, T-cell receptor; UMAP, uniform manifold approximation and projection.

    把这个表:
    表1

    统计比较控制和CP样本之间的人口结构和特点,一群为单细胞测序分析

    我们进一步分析了频率和成分免疫细胞的数量在每个团体或个人主体的确定免疫细胞集群。我们发现的主要免疫细胞组成控制胰腺组织髓细胞,而T细胞占更高比例的胰腺癌免疫细胞CP组织(图1 e和在线补充图S3A, B)。在T细胞和骨髓细胞中,不同的细胞在每一组丰富的集群。巨噬细胞,包括集群5、9和11,在控制,丰富和独特的t细胞集群扩展CP组;集群2是主要的t细胞集群浓缩在遗传CP集群0在特发性CP(主要图1 f和在线补充图S3C, D)。我们也证实在胰腺癌免疫细胞表面蛋白标记表达式模式如CD3、CD8, CD11B HLA-DR,想象他们的表情UMAP所有免疫细胞转录组数据创建的集群(在线补充图S4A, B)。

    接下来,我们检查针对疾病的基因签名通过识别差异表达基因在CP(度)与控制样本(在线补充图S5A, B)。前20名中调节基因在CP与控制相比,我们发现HSP90AA1、FTH1 TNFAIP3、NFKBIA NR4A1 CD69和CCL20。此外,我们进行基因集富集度的分析(GSEA) CP和控制,炎症反应和结果突出显示强烈的签名,包括细胞凋亡、缺氧,白介素(IL) 2-STAT5,移行细胞和肿瘤坏死因子(TNF) -α信号(在线补充图S5C, D)。总的来说,单细胞转录组数据分析控制和CP的胰腺癌免疫细胞组织表示针对疾病的免疫反应在当地致病性组织区域和不同的免疫遗传之间的转录组和蛋白质表达签名和特发性CP组。

    不同的转录组胰腺T细胞之间的遗传特点和特发性CP

    的一个主要免疫细胞的数量在胰腺的控制和CP患者T细胞。为了审查t细胞转录组在更高的分辨率,我们分析了t细胞的数量(总细胞集群的集群0,1和2,图1 b分别)。我们遵守从15 913个细胞t细胞基因表达数据聚类分析和确定了13个不同的t细胞集群人口注释由特定标记基因表达(图2 a和B和在线补充图S6A)。UMAP t细胞的数量显示明显分离的细胞集群分成三组:控制、遗传CP和特发性CP (图2 c)。控制细胞组成GZMA为主+细胞毒性CD8+T细胞,而CD4截然不同+或CD8+T细胞亚群构成CP T细胞(图2 d和E和在线补充图S6B, C)。遗传CP主要由CD4细胞+辅助t细胞(Th)亚种群,包括CCR6+,肿瘤坏死因子+(Th1),调节性T细胞和HLA-DA (Treg)+CD8+T细胞。然而,FTH1+CD4+和BAG3+CD8+T细胞是主要在特发性CP样本T细胞(在线补充图S6D, E)。

    Distinct pancreatic T-cell transcriptional signatures in hereditary CP versus idiopathic CP. (A) UMAP plot of 15 913 pancreatic T cells across controls and CP displaying 13 clusters. (B) Heatmap of signature gene expression z scores across cells. (C) UMAP plot of pancreatic T cells including 1012 cells from control donors, 7271 cells from hereditary CP and 7630 cells from idiopathic patients with CP coloured based on the group (Ctl, control; Her, hereditary CP; Idio, idiopathic CP). (D) Cell cluster frequency shown as a fraction of 13 T-cell subclusters in each patient or donor. (E) The frequency of 13 T-cell subclusters defined by single-cell RNA sequencing clustering analysis shown as an average proportion of each cluster within each group. One-way analysis of variance Kruskal-Wallis test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). The comparison of each pair was differentiated by colour; between Ctl and Her, Pink; between Ctl and Idio, Teal; between Her and Idio, Black. (F) Differentially expressed genes in between hereditary CP and idiopathic CP. Each dot represents a gene, with significantly upregulated top 20 genes and downregulated top 20 genes in hereditary CP versus idiopathic CP coloured blue and yellow, respectively. (G) Functional enrichment analysis of significant hallmark gene sets in total T cells from hereditary CP versus idiopathic CP. CP, chronic pancreatitis; NES, normalised enrichment score; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    不同的胰腺癌T细胞在遗传转录签名CP和特发性CP。(A) UMAP情节15 913名胰腺癌T细胞控制和CP显示13集群。(B)的热图的签名在细胞基因表达z分数。(C) UMAP情节的胰腺T细胞包括1012细胞控制捐助者,7271细胞遗传CP - 7630细胞特发性CP患者彩色根据集团(Ctl,控制;她,世袭CP;个性,特发性CP)。(D)细胞集群频率显示为13 t细胞的一小部分subclusters每个病人或捐赠。13 t细胞(E)的频率subclusters由单细胞RNA序列聚类分析显示为每个集群在每个组的平均比例。单向方差分析克鲁斯卡尔-沃利斯检验(* p < 0.05, * * * * * p < 0.01, p < 0.001)。每一对的比较是通过颜色区分;Ctl和她之间,粉色; between Ctl and Idio, Teal; between Her and Idio, Black. (F) Differentially expressed genes in between hereditary CP and idiopathic CP. Each dot represents a gene, with significantly upregulated top 20 genes and downregulated top 20 genes in hereditary CP versus idiopathic CP coloured blue and yellow, respectively. (G) Functional enrichment analysis of significant hallmark gene sets in total T cells from hereditary CP versus idiopathic CP. CP, chronic pancreatitis; NES, normalised enrichment score; UMAP, uniform manifold approximation and projection.

    此外,在分析包括总T细胞,我们确定度并执行GSEA CP和调节基因的控制(在线补充图S7A-C)。我们还发现遗传度CP和特发性CP在总T细胞(图2 f和G),CD4+T细胞、CD8+T细胞(在线补充图S7D, E)。指出一些基因的调节在遗传与特发性CP包括趋化因子受体和配体相比,等CCR6、趋化因子受体CXCR4 GPR183和CCL20,表明CD4的参与+t细胞遗传CP的招聘。

    CD8+t细胞依赖独特TCR曲目CP的变化

    接下来,我们检查了TCR曲目相同的T细胞的转录组数据中提取控制和CP样本。配对记录远侧地编码但coexpressed在单个细胞,细胞受体α(交易)和TCRβ(民国),排序和过滤程序过滤系统(细胞骑警,10×基因组学)。条码修正和调整后,V (D) J基因互补决定区3 (CDR3上)识别记录的注释。我们确定了总共12 856独特的配对αβTCR序列和5180 T细胞与配对交易和民国CDR3上序列12 T细胞剧目的控制和CP样本。控制T细胞,15.6%±6.0%独特clonotypes共享的两个或两个以上的细胞,这是明显高于遗传CP的T细胞(4.03%±1.6%)(图3一)。对应于这个结果,基尼系数(单克隆的索引)控制T细胞也明显高于与遗传CP组相比,表明低遗传CP T细胞克隆扩张(图3 b)。接下来,我们分配了TCR序列细胞集群的身份,如所示图2一个。基尼系数的不同显示CD8 t细胞集群+在控制和CP组(T cell-skewed克隆扩张图3 c)。当我们分裂成CD8 T细胞+T细胞和所有其他T细胞、CD8的基尼系数+T细胞明显高于其余的T细胞(图3 d)。这个结果被比较UMAPs进一步证实了CD8A基因表达和无性生殖细胞群(图3 e)。最后,我们观察到样品的基尼系数控制和CP组与CD8正相关+t细胞频率,而基尼系数分析的样品与CD4负相关+t细胞频率(图3 f)。这些数据表明,CD4的显著更高的频率+T细胞有助于降低基尼系数和遗传克隆扩张CP与控制。

    Single-cell RNA sequencing/TCR-sequencing unveils CD8+ T cell subset dependent unique TCR repertoire changes in CP. (A) Bar graph shows the percentage of unique paired TCR α and TCR β sequences that are shared by one cell (blue), by two cells (green) or three or more cells (orange) in each donor or patient with CP. (B) Gini coefficients of control and CP group across all pancreatic T-cell populations. For each group, a box and whisker plot is shown with the median and all values from minimum to maximum. One-way analysis of variance with Tukey’s multiple comparison test, *p<0.05. (C) Heatmap showing Gini coefficients of pancreatic T-cell clusters in each donor or patient. (D) Gini coefficients of pancreatic CD8+ T cells and other T cells in control and CP groups. (E) UMAP plot of CD8A gene expression in control or CP groups (top). TCR clonality on the expression-driven UMAP overlay showing the distribution of clonal and unexpanded cell populations in cell clusters in control and CP groups (bottom). Q0, unexpanded; Q1, cells encompassing the top 20% of the most expanded clones in the group; Q2–4, cells representing the middle three quantiles; Q5, cells encompassing the bottom 20% of the most expanded clones. (F) Correlation analysis of Gini coefficients for pancreatic T cells and the frequency of CD8+ T cells (top) or CD4+ T cells (bottom) in control donors and patients with CP. CP, chronic pancreatitis; Ctl, control; Her, hereditary; Idio, idiopathic; TCR, T-cell receptor; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    单细胞RNA序列/ TCR-sequencing揭示CD8+T细胞依赖子集独特TCR曲目CP的变化。(A)条形图显示了独特的比例搭配TCRα和TCRβ序列所共享的一个细胞(蓝色),由两个细胞(绿色)或三个或三个以上细胞(橙色)每个捐赠者或CP患者。(B)的基尼系数控制在所有胰腺和CP组T细胞的数量。为每个组,一盒须图显示和中位数从最小到最大,所有值。单向方差分析与图基的多重比较检验,p < 0.05。(C)的热图显示胰腺t细胞集群的基尼系数在每个捐赠者或病人。(D)胰腺CD8的基尼系数+T细胞和其他T细胞在控制和CP组。(E) UMAP的情节CD8A基因表达控制或CP组(上)。细胞单克隆的expression-driven UMAP叠加显示克隆和未展开的细胞种群的分布在细胞集群控制和CP组(底部)。Q0,未展开的;Q1,细胞包括顶部最克隆扩大集团20%的股权;Q2-4,细胞代表中间三分位数;Q5,细胞包含20%的最底部扩大克隆。(F)相关分析胰腺的基尼系数T细胞、CD8的频率+或CD4 T细胞(顶部)+T细胞(底部)控制捐赠者和CP患者。CP,慢性胰腺炎;细胞毒性t淋巴细胞,控制;她,世袭;个性,特发性;细胞,t细胞受体;UMAP,统一的歧管近似和投影。

    这些scRNA / TCR-seq结果表明t细胞克隆扩张的程度或CP的多样性主要是通过细胞毒性CD8的频率改变+对致病性CD4 T细胞和渗透+T细胞。在遗传CP,浸润CD4细胞+tissue-resident细胞毒性CD8 T细胞可能稀释效应+T细胞在细胞克隆扩张控制胰腺组织中观察到。这可能提供关键的见解CD4+T细胞致病反应,特别是遗传CP的情况下。

    独特的t细胞谱系之间的交互和共享在CP antigen-binding图案

    为了理解之间的联系和t细胞集群的起源,我们检查了独特clonotypes (single-cellTCR-αβ匹配分析)和他们的不同重叠集群通过分析clonotypes所有组(图4一在每组)或(在线补充图S8A-C)。虽然高基尼系数和扩大克隆观察控制与CP样本,没有单一的clonotype不同集群之间共享控制。主要clonotype重叠被发现在遗传和特发性CP (在线补充图S8A-C)。最大的clonotype重叠CD8之间被发现+细胞毒性t细胞集群(Tc-1和Tc-3) 40共享clonotypes,很大程度上是由特发性CP组。事实上,63年独特的共享clonotypes CD8中被发现+细胞毒性t细胞集群在特发性CP (图4一和在线补充图S8C)。下一个最高clonotype重叠CCR6之间被发现+CD4+T细胞和Th1细胞,共有23个clonotypes,这些重叠主要发生在遗传性CP (图4一和在线补充图S8B)。这些共享TCR clonotypes阐明独特的相互作用的不同t细胞亚型和克隆动力学每个CP组。具体来说,大量的共享clonotypes CCR6之间+CD4+T细胞和遗传CP Th1细胞样本表明这两个Th-cell子集可能有共同的起源。有趣的是,我们的分析表明CD4之间的重叠+和CD8+t细胞集群,这可能需要进一步分析了重叠clonotypes CDR3上序列的长度,如短CDR3上不太可能认识到一个特定的序列主要组织相容性复合体(MHC)类。27

    Single-cell RNA sequencing/TCR-sequencing uncovers unique interactions among T-cell lineages and shared antigen binding motifs in CP. (A) Upset plots displaying TCR clonotypes shared among T-cell clusters from T cells across control and CP groups. Each shared clonotype was indicated by black dots with a connected black line. The horizontal bar graph indicates the total number of shared TCR clonotypes for cluster intersections, and the vertical bar graph indicates the number of unique clonotypes found in a single cluster. (B) Representative TCR specificity groups and potential antigen binding motifs by GLIPH2 cluster analysis of TCR CDR3β sequences from pancreatic T cells across control, hereditary and idiopathic CP. Candidates were selected from the clusters with a final score of less than 10−8 and shared by at least two different individuals. CP, chronic pancreatitis; TCR, T-cell receptor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    单细胞RNA序列/ TCR-sequencing揭示独特的T细胞谱系之间的交互和共享抗原结合主题在CP, (A)苦恼的情节显示TCR clonotypes从T细胞在T细胞之间共享集群控制和CP组。每个共享clonotype被黑点表示连接黑线。水平条形图显示的总数共享TCR clonotypes集群十字路口,和垂直条形图显示独特的clonotypes发现的数量在一个集群中。(B)代表细胞特异性组织和潜在的抗原结合主题GLIPH2 TCR CDR3β序列的聚类分析从胰腺T细胞控制,遗传和特发性CP。候选人选择的集群的最后得分小于10−8和共享的至少两个不同的个体。CP,慢性胰腺炎;细胞,t细胞受体。

    检查是否胰腺细胞中发现控制和CP样品承认相同的抗原,我们进行分组的淋巴细胞相互作用互补位热点2)GLIPH2分析、集群识别,识别相同的抗原决定基筛选共享antigen-binding TCR CDR3β氨基酸序列上的图案。28很多图案由至少两个人共享所有三组(控制和两个CP组)根据最终得分,选择,其中,三个集群显示为他们也具有一定程度的相似性配对CDR3α序列(图4 b)。结果表明,选择的集群主要是由个体共享遗传和特发性CP组,而不是控制。值得注意的是,大多数的细胞从三个候选人集群独特的共同主题主要是由个人的遗传CP组,这表明T细胞在遗传CP更有可能反对共同的抗原或抗原表位。与scRNA-seq T细胞的结果一致,这scRNA / TCR-seq数据也支持这一观点,有不同的免疫反应在遗传和特发性CP之间,特别是在T细胞抗原的反应。

    不同的转录改变人类胰腺癌的髓细胞在CP

    髓细胞一直扮演着重要的角色在CP和非免疫细胞相互作用,比如已经被。17髓细胞是胰腺癌免疫的另一个关键组件子集pancreata中我们发现控制和CP科目(图1 b)。当我们进一步分析骨髓单独集群(集群3、4、5、6、9和11图1 b),确定了11个不同骨髓subclusters包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC) (图5一个)。值得注意的是,电池属于每组(控制,遗传CP或特发性CP)聚集,并以最小的重叠拓扑分开时想起UMAP (图5 b)。骨髓细胞集群被他们独特的手工标注细胞标记基因表达(图5 c和在线补充图S9A)。重要的是,CD68的频率+和CD163+巨噬细胞和S100A8+单核细胞(集群3和8)明显高于在控制与CP患者相比(图5 d和E和在线补充图S9B, C)。在CP样品,不同的单核细胞和直流的人口导致粒细胞世袭或特发性CP的免疫细胞。最值得注意的发现是CCL20的显著更高的频率+单核细胞在遗传CP与控制或特发性CP样本。此外,CP患者度分析与控制显示各种炎症和化学引诱物分子,如IL1B、CXCL2 CXCL3 CXCL8和亚兰,明显调节和炎症信号通路在CP髓细胞丰富(在线补充图S9D, E)。度分析的骨髓细胞或骨髓集群分离,如DCs、巨噬细胞和单核细胞,遗传与特发性CP还发现了不同的基因,包括HLA-DR, CCL20和IL1B,显著的调节,有一个浓缩的同种异体移植物排斥反应通路遗传性CP与特发性CP (图5 f和G和在线补充图S10A-C)。这些数据进一步联系,世袭CP更高的HLA分子表达,这可能是增强自身免疫反应,尽管特定HLA打字需要证实这一观点。29 30总的来说,单细胞转录分析胰腺骨髓浓缩在每组数量显示明显的骨髓群:巨噬细胞在控制,CCL20+单核细胞和IL1B+DCs在CP患者遗传,FTH1+或S100A8+在特发性CP患者单核细胞。特别是,大大丰富了CCL20+单核细胞的人口遗传CP表明其潜在作用的化学引诱物渗透CCR6+CD4+T细胞。

    Distinct pancreatic myeloid cell transcriptional signatures between hereditary CP and idiopathic CP. (A) UMAP plot of 8590 pancreatic myeloid cells presenting 11 clusters (DC, dendritic cells; MAC, macrophages; mono, monocytes). (B) UMAP plot of pancreatic myeloid cells including 2998 cells from control donors, 2769 cells from hereditary CP and 2823 cells from idiopathic patients with CP coloured based on group (Ctl, control; Her, hereditary CP; Idio, idiopathic CP). (C) Heatmap of signature gene expression z scores across cells. (D) Cell cluster frequency shown as a fraction of 11 myeloid subclusters in each patient or donor. (E) The frequency of 11 myeloid subclusters shown as an average frequency of each cluster within each group. One-way analysis of variance Kruskal-Wallis test (*p<0.05, **p<0.01). The comparison of each pair was differentiated by colour; between Ctl and Her, Pink; between Ctl and Idio, Teal; between Her and Idio, Black. (F) Differentially expressed genes between hereditary and idiopathic CP groups. Each dot represents a gene, with significantly upregulated top 20 genes and downregulated top 20 genes in hereditary CP versus idiopathic CP coloured blue and yellow, respectively. (G) Functional enrichment analysis of significant hallmark gene sets comparing myeloid cells from hereditary CP with idiopathic CP. CP, chronic pancreatitis; NES, normalised enrichment score; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    不同的胰腺癌骨髓细胞转录签名世袭CP和特发性CP之间。(A) UMAP块8590胰腺髓细胞呈现11集群(直流,树突细胞;MAC,巨噬细胞;mono,单核细胞)。(B) UMAP情节的胰腺髓细胞包括2998细胞控制捐助者,2769细胞遗传CP - 2823细胞特发性CP患者彩色基于集团(Ctl,控制;她,世袭CP;个性,特发性CP)。(C)的热图的签名在细胞基因表达z分数。(D)细胞集群频率显示为11的一小部分骨髓subclusters每个病人或捐赠。(E)的频率11骨髓subclusters显示为每组平均每个集群内的频率。单向方差分析克鲁斯卡尔-沃利斯检验(* * * p < 0.05, p < 0.01)。 The comparison of each pair was differentiated by colour; between Ctl and Her, Pink; between Ctl and Idio, Teal; between Her and Idio, Black. (F) Differentially expressed genes between hereditary and idiopathic CP groups. Each dot represents a gene, with significantly upregulated top 20 genes and downregulated top 20 genes in hereditary CP versus idiopathic CP coloured blue and yellow, respectively. (G) Functional enrichment analysis of significant hallmark gene sets comparing myeloid cells from hereditary CP with idiopathic CP. CP, chronic pancreatitis; NES, normalised enrichment score; UMAP, uniform manifold approximation and projection.

    泛函分析涉及遗传CP的CCR6-CCL20轴

    符合基因的转录表达在CD4 CCR6-CCL20轴+从遗传CP T细胞和单核细胞的人口,我们确认这个独特的趋化因子和受体的参与轴通过分析度从免疫细胞数量,比较遗传CP和特发性CP (图6)。因此,CCR6和CCL20前20名的显著调节的基因遗传CP与特发性CP。此外,评估骨髓细胞和T细胞之间的串扰,我们分析了细胞因子和趋化因子receptor-ligand髓细胞和T细胞室之间的相互作用的受体配体的表达水平(图6 b和在线补充图S11A, B)。CCR6-CCL20轴表示只有两个CP组,和遗传CP CCR6-CCL20的表达显著高于特发性CP。最后,我们评估了CCR6的蛋白表达在T细胞分离出第二批控制和CP患者通过流式细胞术(图6 c,表2,在线补充表4和表5)。首先,我们确认CD8的频率显著降低+T细胞和CD4显著更高的频率+T细胞在遗传CP与控制。与scRNA-seq结果一致,CD8的频率+或CD4+T细胞在特发性CP在中间,范围之间的控制和遗传CP。更重要的是,CD4细胞的百分比+T细胞表达CCR6显著增强与控制相比,遗传CP或特发性CP。我们确认后CD4 CCR6蛋白表达升高+T细胞的遗传CP样本,我们发现CCL20胰腺分泌物单核细胞在遗传CP ELISA (在线补充图13 a - c)。此外,CCR6+和CCL20+与CD4细胞被colocalised+和CD45+分别免疫细胞在胰腺组织的部分遗传CP与免疫荧光(验证在线补充图14 a, B)。我们下一个评估的功能意义CCR6 CCL20-mediated在T细胞表达细胞迁移试验(图6 d)。Transwell趋化作用进行,CXCL12作为积极的控制,这在t细胞迁移是符合标准的化验。31日胰腺癌免疫细胞遗传CP组织迁移对可溶性重组人类CCL20浓度与先前的报告。32 33pancreas-infiltrating T细胞的趋化反应增加CCL20确认增加受体的功能意义(CCR6)表达在世袭CP。这些数据表明,T细胞迁移和浸润病变胰腺世袭CP CCR6-CCL20轴。

    Functional analysis implicates the CCR6-CCL20 axis as hereditary CP-specific pancreatic immune crosstalk. (A) Volcano plot of DEG analysis between hereditary and idiopathic CP groups with total immune populations. Each dot represents a gene, with significantly upregulated top 20 genes and downregulated top 20 genes in hereditary CP versus idiopathic CP coloured blue and yellow, respectively (left). DEGs ranked by fold changes in hereditary CP versus idiopathic CP (right). (B) UMAP plot of total pancreatic immune cells (left). Heatmap of combined expression of selected cytokine/chemokine and their receptor displaying the interactions between myeloid cells and T cells discovered by CellPhoneDB (right). (C) Flow cytometry analysis of CD8+, CD4+ or CCR6+ CD4+ T cells (Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple comparisons test, *p<0.05, **p<0.01). (D) Chemotaxis assay with pancreatic immune cells from hereditary CP (left, one-way analysis of variance with Tukey’s multiple comparisons test; right, paired t-test; **p<0.01, ***p<0.001). CP, chronic pancreatitis; Ctl, control; DEG, differentially expressed genes; Her, hereditary; Idio, idiopathic; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    功能分析蕴涵CCR6-CCL20轴作为世袭CP-specific胰腺癌免疫相声。(A)火山之间的块度分析遗传和特发性CP组总免疫人群。每个点代表一个基因,显著调节基因和基因表达下调前20名前20名世袭CP与特发性CP的蓝色和黄色,分别(左)。度排名的褶皱变化世袭CP和特发性CP(右)。(B) UMAP总胰腺癌免疫细胞(左)的阴谋。热图组合选择细胞因子/趋化因子及其受体的表达显示骨髓细胞和T细胞之间的交互发现CellPhoneDB(右)。(C) CD8的流式细胞术分析+,CD4+或CCR6+CD4+T细胞(克鲁斯卡尔-沃利斯检验邓恩的多个对比测试中,* * * p < 0.05, p < 0.01)。(D)与胰腺癌免疫细胞趋化性分析遗传性CP(左,单向方差分析与图基的多个对比测试;右,配对t检验;* * * * * p < 0.01, p < 0.001)。CP,慢性胰腺炎;细胞毒性t淋巴细胞,控制;度,差异表达基因;她,世袭;个性,特发性;UMAP,统一的歧管近似和投影。

    把这个表:
    表2

    统计比较控制和CP样本之间的人口结构和特点,一个队列的功能验证分析

    讨论

    人类CP研究一直受阻,在某种程度上,由于缺乏临床标本。利用访问大型的能力分数的外分泌胰腺组织器官捐赠者和CP患者接受胰岛隔离,我们能够执行深入单细胞水平的免疫分析使用最先进的技术。我们的研究不包括病人样本的CP与饮酒有关,患者少这病因学进行总与胰岛移植胰腺切除术,34但是我们收到足够数量的样本遗传CP和特发性CP深入免疫分析。我们之前的研究使用流式细胞仪和散装TCR-seq显示不同的免疫细胞遗传与特发性CP特点,突出关键见解CP在不同的目的的不同的发病机制。21进一步描绘致病性免疫反应信号,发现差异基本CP的不同目的,这里我们使用综合单细胞multiomics测序分析同时评估细胞剧目和RNA /蛋白表达在单细胞水平上。这些无偏深入分析技术使一个全面的比较控制和CP样本,以及不同的CP组之间,引导我们找出小说免疫细胞和他们的相声子集,以及t细胞subset-dependent TCR曲目的变化。符合我们之前的研究中,21遗传和特发性CP样本有不同的免疫特性,不仅在免疫亚种群的频率,而且在他们独特的基因表达模式和t细胞克隆扩张的程度在不同的子集。此外,显示很大一部分的CD4 t细胞分析+t细胞(CCR6子集+Th,肿瘤坏死因子+Th1和Treg)丰富遗传CP胰腺强调免疫签名的胰腺患者遗传跨异构CD4 CP在很大程度上是守恒的+t细胞的子集。然而,特发性CP显示均匀分布的CD4细胞+和CD8+t细胞亚群独特的表达FTH1和PCBP2,这表明人类特发性CP高度与免疫细胞铁代谢有关,这与先前的报道在胰腺炎提供铁代谢。35-37

    独特的t细胞特性之间的遗传和特发性CP也TCR曲目分析。胰腺癌在CD8 T细胞表现出增加克隆扩张+在所有控制和CP组t细胞亚群,这导致遗传性显著降低t细胞单克隆CP CD4的地方+t细胞浸润增加。这些数据表明,不同的细胞中发现控制与CP或世袭CP与特发性CP是高度相关的特定的t细胞亚群的分布。在自身免疫性TCR体验的报告相比,感染和恶性疾病,24 38-40在新浸润免疫细胞通常负责单克隆的增加,渗透胰腺癌CD4+T细胞导致减少单克隆的病变,但增加总T细胞异质性的子集。此外,细胞克隆共享分析scRNA CCR6 / TCR-seq数据公布了独特的相互作用+Th和Th1子集世袭CP CD4支持自然增加+t细胞在遗传异质性CP微环境。更好的理解致病性t细胞浸润及其模式将由独特pancreas-specific信号和TCR曲目我们发现在遗传和特发性CP,以前没有报道,并可能提供基本线索在CP的致病机制和/或疾病进展。考虑到不同的细胞剧目变化和共同antigen-binding图案中发现遗传与特发性CP,未来的研究,包括预测HLA限制和抗原筛选特异识别候选人41将是很重要的。

    其中一个引人注目的发现的单细胞分析的upregulation CCR6-CCL20轴世袭CP。upregulation CCL20的促炎细胞因子,如IL-1βTNF-α,42-44和浸润CCR6+淋巴细胞被发现在炎性微环境,感染和恶性状态在不同的器官,如胃、肠、肝和肺。32 45-48CCL20表达式模式已经在胰腺癌和CP相比,49及其在胰腺癌肿瘤促进作用提出了。50 51然而,CCR6+t细胞浸润在遗传或任何其他类型的CP,据我们所知,还没有被报道。我们的研究结果也表明有一个CP-specific CD4之间的串扰+T细胞和单核细胞在遗传CP CCR6-CCL20轴,新颖的见解,为该疾病的精确定位。有趣的是,在CP的不同原因,遗传CP患胰腺癌的风险最高,累积的风险增加了40%。52 53CCL20-CCR6轴的重要upregulation遗传与特发性CP(和器官捐赠者)可能导致胰腺癌的风险增加遗传CP,虽然应该做进一步的研究来证实这种相关性。

    我们大多数的分析和报告关注的主要免疫细胞识别子集,但我们也发现B细胞和肥大细胞明显分布在遗传与特发性CP,尽管他们的频率限制在低于10%的免疫细胞。在未来它将重要深入分析这些细胞并检查其潜在功能意义CP,自从有了报告建议在胰腺炎他们潜在的致病作用。54-56虽然B细胞的致病作用及其在自身免疫性胰腺炎,激活被描述57 58潜在的B细胞参与CP是几十年前最初报道和讨论。59最近的一项研究与实验CP模型显示B细胞的致病作用在组织再生。60scRNA-seq分析显示显著增加频率的B细胞和浆细胞CP组,签名之间的基因差异表达与遗传和特发性CP (在线补充图12 a, B)。这些数据表明B细胞和其他免疫子集,在CP的immunopathogenic机制,需要将来的调查。集体,我们与综合单细胞分析方法推出了不同的胰腺癌免疫签名和通路之间CP的不同目的,从而扩大我们的理解胰腺癌免疫细胞信号和功能的特定疾病致病微环境。此外,我们的研究有助于越来越多的文献描述人类胰腺癌免疫细胞的功能在健康和疾病。

    数据可用性声明

    合理的请求数据。所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。所有原材料测序数据与基因表达综合数据库,存放GSE165045。可以在代码用于数据分析https://github.com/yangysheep2018/CITE-seq-TCR_paper。所有其他数据处理中可用的主要文本或补充材料。

    伦理语句

    病人同意出版

    伦理批准

    本研究机构审查委员会批准的斯坦福大学。

    确认

    我们感谢我们的合作者,病人和捐助者为本研究提供了宝贵的人类胰腺组织。我们还要感谢Y, Y,技术援助,R霁和D米哈伊尔·琼斯M马诺和E K的科学输入和所有的其他成员Habtezion实验室对他们有帮助的意见和建议。

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    补充材料

    • 补充数据

      仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。

    脚注

    • 贡献者提单和啊设计实验,写手稿,接受全部责任的工作研究中,对数据的访问,决定发布控制。啊提供总体指导和监督。提单完成所有实验和分析数据,HN fluorescence-activated细胞执行排序准备用于单细胞测序的单个细胞,流式细胞仪面板设计和数据分析。YY CITE-seq和scTCR-seq数据分析。HH GLIPH2进行分析、解释和检讨scTCR-seq结果。MB和DH慢性胰腺炎患者的组织和临床资料。gl提供控制胰腺组织和临床资料。多党民主运动,SZH,帕克和MB手稿进行了回顾,并参与了数据的解释。

    • 资金这项研究的部分支持由国家卫生研究所的格兰特DK105263(啊),糖尿病的基因组学和分析斯坦福大学糖尿病研究中心的核心(P30DK116074)国防部授予w81xwh - 19 - 1 - 0888(啊,SZH, SJP)胰腺和国家基础研究资助(提单)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人和公众参与患者或公众没有参与设计、实施、报告或传播计划的研究。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

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