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客观的肥胖症和代谢并发症仍然是主要的全球公共卫生的威胁有限的有效的治疗方法,尤其是可以口服药物。肽是一种很有前途的一类分子获得了增加对他们的应用程序在医学和生物技术。在这项研究中,我们专注于寻找肽,可以管理口服治疗肥胖和探索其机制。
设计在这里,一个叫D3 9-amino-acid肽设计和口服药物无菌(GF)小鼠和野生型(WT)老鼠,老鼠和猕猴。D3对体重的影响和其他基础代谢参数进行评估。D3对肠道微生物群的影响评估使用16 s rRNA扩增子测序。识别和确认机制D3,回肠和分子的转录组分析方法在三个动物模型进行。
结果显著减少体重都被观察到WT(12%)和GF(9%)小鼠接受D3。D3改善瘦素抵抗和调节的表达uroguanylin (UGN),它通过UGN-GUCY2C内分泌轴抑制食欲。类似的效果也被发现在食源性肥胖大鼠和猕猴模型。此外,大量的肠道Akkermansia muciniphila增加约100倍通过IFNγ-Irgm1轴D3治疗后,可能会进一步抑制脂肪吸收的表达下调Cd36。
结论我们的研究结果表明,D3是一种新型药物候选抵消食源性肥胖作为一种无毒和生物活性肽。针对UGN-GUCY2C内分泌轴可能代表治疗肥胖症的治疗策略。
- 肥胖
- 肠道微生物
- 药物开发
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已知关于这个主题是什么呢
Uroguanylin (UGN)是一个厌食症患者激素可以目标GUCY2C受体的下丘脑和激活使食欲减退的途径。
调节肠道微生物群可以改善宿主代谢,减少肥胖。
多肽等glucagon-like peptide-1 (GLP-1)模拟用于防止肥胖代表了药物设计的新方向,但病人注射疗法的依从性较差。
这个研究增加了
D3的口服9-amino-acid肽而不是GLP-1模拟,可以抵消食源性肥胖小鼠、大鼠和恒河猴。
D3可以通过UGN-GUCY2C内分泌轴有效抑制食欲。
D3恢复肠道微生物群失调引起的肥胖和专门增加了丰富的Akkermansia muciniphila在肠道通过IFNγ-Irgm1轴。
这项研究可能会如何影响研究、实践或政策
D3是一种很有前途的候选人的重量减少可以口服药物管理,超重和肥胖。
UGN-GUCY2G轴代表了一种潜在的治疗肥胖的药物发展的目标。
介绍
根据世界卫生组织的数据,2016年有6.5亿成年人肥胖,3900万5岁以下儿童超重或肥胖是在2020年。1肥胖正在成为一个全球流行和姿势主要治疗挑战由于其高风险发展非传染性疾病相关,包括2型糖尿病,心血管疾病、中风、癌症和抑郁症。2肥胖还与预期寿命降低,增加发病率和死亡率医疗体系和经济负担。3各种策略开发对抗肥胖和超重条件,尤其是通过减少能量摄入或提高代谢率。然而,最近的研究发现,过度饮食干预可能会导致身体和精神健康障碍患者,4这进一步增加有效需求,安全的和可接受的治疗选项。
广泛的研究表明,肥胖的人类和老鼠显示一个改变肠道微生物群与减少多样性和增加吸收能量的能力。5肠道微生物群在能量调节宿主体内平衡是至关重要的,脂肪积累和粘膜屏障的完整性。6无序微生物群与代谢紊乱密切相关,如肥胖、胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良。7干预策略,调节肠道微生物群提出了预防和治疗肥胖。例如,tempol可以降低老鼠的体重增加优先减少属乳酸菌。8蔓越莓提取物9和二甲双胍10可以保护小鼠免受食源性肥胖增加Akkermansia muciniphila在肠道微生物群。最近的一些研究表明,日常管理答: muciniphila可以抵消雌性后代的发展(HFD)全身肥胖。11此外,口服填喂法与叫多形拟杆菌12或乳杆菌GG13还可以缓解食源性身体体重增加和肥胖老鼠。
20自然组成的氨基酸和多种非天然的氨基酸,肽有吸引力的药理档案、良好的安全性和耐受性,这代表了一个很好的起点小说疗法的设计。14目前,已经开发的许多肽预防肥胖,如glucagon-like peptide-1 (GLP-1),15心房利钠肽和脑利钠肽。16然而,许多这些肽通常超过20种氨基酸,因此不太可能逃脱消化道的蛋白酶降解。另一方面,在组织apelin最近的研究17和semaglutide18表明,口服药物代表偏好的减肥药物开发的趋势一般患者口服药物比注射疗法。此外,小分子可能有一些固有的缺点,包括肽在器官的积累和潜在的有毒代谢产物引起的副作用。19大多数肽膜不透水,这使得他们的治疗应用局限于细胞外和跨膜目标,和无法渗透肠道粘膜需要通过皮下或静脉注射,注射用相应的损害病人方便和遵从性。基于生物相容性的原则,提高肽的疏水性可以提高他们的能力与细胞表面受体,甚至促进渗透膜和绑定的内部目标。20.仍需要进一步的研究来发现或修改更多的内源性肽更小和缺乏累积毒性治疗肥胖。
在这项研究中,我们设计并优化9-amino-acid肽高疏水性从人类α-defensin 5 (HD-5),发现扭转dyslipidaemia产能和改善glucoregulatory食源性肥胖(戴奥)老鼠通过直接与饲料混合喂养。21通过使用药物和基因的方法,我们识别和确认修改后的肽的作用和机制(D3)抑制肥胖的发展。代谢分析显示,D3可以改善胰岛素和瘦素抵抗。通过执行16 s rRNA扩增子测序和粪便微生物管理实验中,我们观察到大量的肠道共生的增加答: muciniphila之间的因果关系,减少脂肪组织合成代谢。我们的研究报告一个新的和有前途的候选人高安全,可以口服药物预防和治疗肥胖。
结果
口服的D3抵消肥胖
增加电荷和疏水性的膜透性可以提高多肽。因此,为了提高疏水性,四肽名叫D1-4被修改的碎片HD5退化的蛋白酶在人类十二指肠液、HD5(1 - 9),前9 n端氨基酸的defensin HD5。22所有这些肽有一个正电荷,其中D3显示潜力最强的穿透细胞膜(在线补充表1和图1一个)。然后,我们评估D1-4在哺乳动物细胞的细胞毒性。D1-3略有抑制细胞活性(2.71% - -5.42%)在非常高的浓度(29µM),来显示他们的低细胞毒性(在线补充图1)。此外,D1-4化验了潜在的对小鼠红细胞体外毒性的影响。所示在线补充图1 b溶血性D1-4率在28分别µM是1.06% - -3.61%,来显示他们的低溶血的影响。因此,这些小肽的安全浓度范围被设置为07µM。
口服的D3抵消肥胖。HD5 (A)设计(1 - 9)衍生肽D1-4及其两性分子的表面。蓝色、红色和白色代表积极的、消极的和中性的指控,分别。分子模型生成与PyMOL 3.0。(B)实验大纲。(碳氢键)小鼠被分为三组(正常的食物(NC),雌性(HFD)和D3)和美联储标准正常食物的饮食或60%脂肪的饮食10周;与D3 D3组填喂法口头,而盐被用作并行控制(HFD)。(C)代表特定的无菌的照片(SPF)老鼠在第八周。D3组的小鼠表现出减少的重量和更好的梳理。(D-F)防晒系数是显示在顶部和无菌(GF)显示在底部。 (D) Grams of weight gain measured over time, starting at 4 weeks of age; SPF mice (n=10–12 per group); GF mice (n=6–8 per group). Representative of three independent experiments. (E, F) insulin tolerance test (ITT) (E) and oral glucose tolerance test (OGTT) (F) of SPF mice and GF mice. (G) Total weight of white fat content in tissues from different organs. Representative of three independent experiments. (H) H&E staining of liver and epididymal fat from mice in the HFD or D3 group, taken at ×20 magnification. Scale bars: 100 µm. n=10 for each group. (I, J) Experimental outline (above); grams of weight gain measured over time, starting at 4 weeks of age, and the feed was changed at the 14th week. For D–G, I, and J, p values were determined by a two-tailed Wilcoxon test, and data are presented as the means±SEM; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
我们下一个日常管理的影响D1-4相比HFD-fed老鼠。引人注目的是,HFD-fed小鼠口服接种D3而不是其他肽引起的身体体重降低12.06%±2.35%相比HFD-fed控制老鼠HFD暴露在8周(图1罪犯)。最近的研究表明,肥胖和其伴随的代谢状态越来越与肠道微生物群的构成。1检查是否肠道微生物群可能导致这种效果,同样的实验是重复在无菌的(抗生素鸡尾酒,ABX)和无菌小鼠(GF)。同样,9.65%±4.26%和9.14%±2.93% ABX观察减肥(在线补充图1 c和女朋友老鼠图1 d),分别,这表明减少肥胖症D3的口腔填喂法可能部分独立于肠道微生物组。
当挑战和额外的胰岛素和葡萄糖,D3-treated小鼠显示出类似的动力学为葡萄糖间隙老鼠NC组,表明D3可以减少由肥胖导致的胰岛素抵抗(图1 e, F)。显著降低组织的重量腹股沟,附睾的和perirenal脂肪后被检测到D3治疗(p < 0.05, Wilcoxon测试),这可能是由于减少了脂肪细胞的体积(图1 h)。此外,D3治疗也保护肝脏脂肪变性(图1 h)。
基于这些发现,我们进一步研究了4周的口服D3的影响在一个新的群戴奥老鼠(n = 5)经过10周的HFD喂食。显著减少体重在戴奥小鼠(p < 0.01, Wilcoxon测试)(图1我),而这一趋势倾向于温和的瘦老鼠(n = 5)并行,曾用了10周时间进行喂食物的饮食(p < 0.05, Wilcoxon t检验)(图1 j)。值得注意的是,类似的效果观察后交换他们的饮食在第14周(图1 i, J)。总的来说,这些发现表明,D3治疗可以防止戴奥的发生和恶化,特别是在HFD (在线补充图1 e)。
D3保持能量体内平衡通过抑制食欲
考虑到肥胖发生在能量摄入超过能量消耗,因此我们评估是否口服D3可能影响食物摄入量和能量代谢。值得注意的是,在特定的无菌(SPF)小鼠和GF老鼠,D3治疗显著降低食物摄入量随着时间的推移,在24小时食物摄入量而显著减少(p < 0.05, Wilcoxon vehicle-treated动物测试)(在线补充图1 d和图2 a, B)。此外,间接量热法分析解决能量消耗的变化是否导致观察到的D3-mediated减肥。所示图2 c,几乎没有两组之间的能量消耗差异(p > 0.05, Wilcoxon测试),表明D3治疗可能影响能量摄入,而不是能量消耗。Pair-feeding进行探索降低食品过载的影响。结果,老鼠口服接种D3造成10.04%±2.19% (p < 0.01, Wilcoxon测试)身体体重的降低而HFD控制老鼠HFD暴露在8周(图2 d)。此外,老鼠pair-fed组造成了身体体重下降6.02%±2.03%。这些结果表明,D3的生理作用主要是基于对需求的抑制小鼠。
D3治疗减少食物摄入量减少移植uroguanylin回肠(UGN)表达式。(A, B)食物摄入量每周测量一次。(C) D3治疗对急性食物摄入量的影响,这是每隔一天测量1星期。对于A和B, (A)(具体无菌(SPF)小鼠,n = 10 - 12), (B)(无菌小鼠(GF), n = 6 - 8)。(C)的SPF小鼠测量能量消耗20小时(n = 6 /组小鼠)。(D)克pair-feeding小鼠体重测量随着时间的推移,开始在4周的年龄(n = 6小鼠每组)。(E)本地化FITC-labelled D3形象化的共焦显微镜。细胞核与DAPI染色(蓝色)。瑞士卷(规模以上,酒吧:500µm)和肠道横截面(下面,酒吧规模:200µm) 3小时后获得的SPF小鼠口服。最后一列显示的本地化FITC-D3 coincubation 1小时后与HCT细胞。 The magenta colour presented by FITC is a pseudocolour that was replaced later to distinguish it from the immunofluorescence staining of UGN. Images are representative of three independent experiments with similar results. (F) RNA sequencing and KEGG pathways of genes in the ileum. (G) Volcano plot showing relative gene expression in the D3-treated group versus the HFD control group. All genes were plotted, and each circle represents one gene. The diameter of the circle represents the value of FPKM, p<0.05 (green) and p<0.01 (red). The X-axis shows the log2-fold change, and the Y-axis shows the −log10 of the p values. (H) Relative Guca2b mRNA levels in the ileum of mice gavaged with D3 or phosphate buffered saline (PBS). (I) The concentration of UGN (Guca2b protein) (ng/mL) in the serum of mice was determined by ELISA. (J) Double immunofluorescence in ileal sections for UGN (green dots located at the base of intestinal epithelial cells) and nuclei (blue). The diffuse green thin layer refers to background noise. Scale bars: 10 µm. For A, B, H and I, p values were determined by a two-tailed Wilcoxon test, and data are presented as the means±SEM; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
进一步探索D3的机制,FITC-labelled D3 (FITC-D3)被用来想象其系统性分布在老鼠身上。三小时后口服FITC-D3或FITC,强烈的荧光FITC-D3-treated小鼠肠道中可见,特别是在远端小肠,但不是老鼠的FITC集团(图2 e)。没有观察到FITC-D3分布在其他器官(心、脾、肺和肾脏),除了肝脏(略图2 e和在线补充图2)。FITC-D3治疗24小时后,没有观察到荧光在任何上述器官,包括肠道。这些发现表明,D3的主要目标是远端小肠,和它的半衰期很短。
富含精氨酸和赖氨酸残留物,有些小肽显著的细胞吸收能力结合细胞内目标或提供静电生物活性药物进入细胞。23确定D3可以穿透细胞膜,HCT细胞coincubated 10µM FITC-D3 / FITC 2小时。共焦显微镜显示,FITC-D3是均匀分布在HCT细胞的胞质和显示荧光强度显著高于FITC (图2 e和在线补充图2 b),这意味着增强与D3细胞结合后的吸收。D3的高效渗透膜支持其潜在函数作为细胞内的监管机构。
随后,我们调查是否D3可以调节基因的表达在小鼠的小肠远端利用转录组分析。基因集富集分析表明几个KEGG通路参与代谢和炎症反应,包括脂肪细胞分化的规定,积极分解过程的监管和消极的监管I-kappaB激酶/ NF-kappaB信号,是最明显的富集通路内D3-treated老鼠相比HFD控件(图2 f)。此外,微分表达式分析确定了121个调节基因的回肠D3小鼠(p < 0.05,瓦尔德测试)。多个基因参与脂类分解的规定,包括Zbtb1624和酰coa氧化酶2 (Acox2),25和炎症Zfp36 inhibition-related基因26被实时定量PCR验证,特别是Guca2b基因(p < 0.01) (在线补充图3罪犯和图2 g)。类似的结果也在脂肪组织中发现:D3治疗增加了脂肪细胞分化的mRNA的表达标记(例如,CCAAT / enhancer-binding protein-α,由Cebpa编码)和脂质氧化(如Acox2)和表达下调脂肪生成标记(如脂肪酸合酶,编码Fasn) (在线补充图3 b)。先前的研究显示,Guca2b可以作为监管机构的体重体内平衡调节食物摄入量通过UGN-GUCY2C内分泌轴。27我们进一步验证了UGN水平变化在血清ELISA。值得注意的是,D3治疗显著调节的表达UGN SPF小鼠和GF小鼠(p < 0.01, Wilcoxon测试),评估通过免疫荧光(图2 h-j和在线补充图3 e)。
完整的瘦素信号有助于D3的抗肥胖效果
我们试图确定D3治疗能否防止肥胖基因小鼠肥胖(ob / ob)。所示图3一体内无显著差异,观察体重增加之间的ob / ob小鼠D3组和HFD组6周后口服。验证D3瘦素相关的抗肥胖效果,我们下一个回顾性研究瘦素表达的变化在SPF小鼠在以前的实验。事实上,与先前的报道一致,28喂养一个HFD显著调节瘦素的表达在SPF和GF老鼠,可恢复的口服D3 (p < 0.05, Wilcoxon测试)(图3 b)。进一步证明D3可以改善瘦素抵抗,我们第一次调查的反应体重瘦素政府通过急性方法,在WT老鼠瘦素处理腹腔内3天,然后他们的体重改变决心。所示图3 c, A,显著减少体重观察小鼠接受D3外生瘦素治疗后(p < 0.05, Wilcoxon测试)而不是HFD组的老鼠。第二,我们发现leptin-stimulated细胞因子,包括传感器信号和转录激活3 (STAT3)和磷脂酰肌醇3-kinase PI3K通路。29日我们发现瘦素信号的负调控中没有显著差异PTB1B mRNA表达水平(在线补充图4 bHFD和D3团体之间的),但在D3-treated老鼠SOCS-3显著下调。SOCS-3被发现的超表达抑制leptin-induced pSTAT3体内,从而引起瘦素抵抗。30.相比之下,PI3K的表达水平,其水平与总表达水平呈正相关,可以反映了瘦素的敏感性,31日显著调节,这可能代表一个增强应对瘦素(在线补充图4 b)。总的来说,这些结果表明,D3治疗可以恢复leptin-induced瘦素信号通路在戴奥老鼠和敏感度。
D3瘦素敏感性增加,电弧c-Fos表达式在老鼠身上。(A)的体重比例测量随着时间的推移(ob / ob老鼠,每组n = 8)。(B)瘦素mRNA表达特定的无菌/无菌的附睾脂肪水平(SPF / GF)老鼠强饲法与D3或生理盐水作为雌性控制美联储(HFD)或正常的食物(NC)的饮食(SPF小鼠,n = 10 - 12;GF老鼠,n = 6 - 8)。(C)在治疗后体重变化与外生瘦素或生理盐水(野生型小鼠(WT), n = 7 - 8)。琵琶图相同的颜色代表同样分为两组的老鼠相同的待遇。(D)的比例在ob / ob小鼠体重增加正常饮食与不同的治疗(数控,n = 3;D3、瘦素和瘦素D3 + n = 4)。(E) Guca2b mRNA表达水平ob / ob或WT老鼠(ob / ob老鼠,每组n = 3 - 4;WT老鼠n = 8 - 10每组)。 (F) Double immunofluorescence in ileal sections for uroguanylin (UGN) (green dots located at the base of intestinal epithelial cells) and nuclei (blue). Scale bars: 10 µm. (G) AgRp and POMC mRNA expression levels in WT mice (n=3 per group). (H) Representative images showing ARC c-FOS (red) and POMC (green) in SPF mice. Scale bar: 100 µm; 3v, the third cerebral ventricle. (I) Colocalisation of c-Fos positive cells with POMC neurons. (J) Numbers of c-Fos positive cells/slide in ARC of mice. (K) Double immunofluorescence in ARC sections for POMC (green) and nuclei (blue). Scale bars: 100 µm; 3v, the third cerebral ventricle. For A–E, H and J, p values were determined by a two-tailed Wilcoxon test, and data are presented as the means±SEM; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
我们观察到瘦素治疗引起明显倾向减少体重ob / ob老鼠,和瘦素+ D3诱导比独自D3(更显著减少图3 d),这意味着与外源性补充瘦素的功能可以恢复D3 ob / ob老鼠。然后,我们量化和比较的表达水平的回肠Guca2b ob / ob小鼠与WT老鼠。增加2.22倍的表达Guca2b D3治疗后观察ob / ob老鼠(OB-D3)与未经处理的ob / ob老鼠(OB-NC),而WT老鼠SPF-D3集团取得了3.67倍增加(图3 e)。此外,ob / ob小鼠接受瘦素(OB-Lep)增加2.12倍,低于那些瘦素处理+ D3 (OB-Lep + D3,增长了3.46倍)(图3 e),表明瘦素和D3的协同效应调节UGN的表达。的表达UGN回肠的ob / ob小鼠接受D3,瘦素和瘦素D3 +呈现进一步验证了免疫荧光(图3 f)。总的来说,这些发现表明,瘦素可能扮演了一个重要的角色在调解使食欲减退的D3和肥胖的影响。
一些下丘脑中的神经元与禁食胃口被激活,这是伴随着戏剧性的感应c-Fos表达在这些神经元。32观察D3治疗小鼠的食欲的效果,8-week-old SPF小鼠填喂法与D3或车辆在早上10点(生理盐水)。Transcardial c-Fos染色和随后每1小时3小时执行。c-Fos的表达显著增加在D3政府后1小时,然后逐渐回到正常水平(在线补充图4 c),这证实了随后的免疫荧光染色(图3 h, J)。我们进一步测量AgRP的表达和POMC在此过程中确定的人口下丘脑神经元与观察到的效果。POMC的表达显著提高在D3政府2和3小时后(p < 0.05, Wilcoxon测试),但随着AgRP无显著变化(p > 0.05, Wilcoxon测试)(图3 g、K)。此外,colocalisation c-Fos和POMC神经元表达在弓状核(图3 h,我)。这些结果表明,D3政府可能间接影响POMC神经元在弓状核,信号饱腹感,减少食物摄入量,达到抑制食欲的效果。
D3治疗增加了丰富的答: muciniphila在肠道微生物群
肠道微生物群是一个重要的贡献者代谢功能和与人类疾病的发展,33 34如自闭症35和肥胖。36我们下了D3预防肥胖是否与肠道微生物群的改变相关。有一个明显的差异之间的粪便微生物群组成D3-treated和vehicle-treated老鼠(图4 a, B和在线补充图5 a - c)。线性判别分析表明,Oscillospira,Lawsonia和脱磷孤菌属在vehicle-treated大大丰富了老鼠,而属拟杆菌,Bilophila和Akkermansia明显丰富D3-treated组(图4 c)。
D3改变小鼠的肠道微生物群。(一)粪便微生物群组成的雌性(HFD)治疗和D3-treated老鼠在属水平。(B)主成分分析(PCoA)的粪便微生物群在HFD和D3老鼠。两个分开的集群的意义与阿多尼斯的测试测量。(C) LEfSe分析表现出明显不同的细菌类群丰富HFD和D3之间。类群明显丰富和耗尽D3-treated老鼠所示红色和黑色,分别。(D)粪便微生物群移植实验工作流程(FMT)。首先在老鼠的美联储的HFD 10周达到饮食肥胖。在接下来的4周,D3-treated老鼠作为捐赠者。他们的粪便收集,然后分成一个灭活组和一个活跃的组织,最终通过FMT转移到受体的老鼠。 In addition, mice in the “a . m”和“b . v”组是口头和1×10强饲法吗9CFU的Akkermansia muciniphila或拟杆菌 vulgatus。供体和受体,n = 6 /集团”a . m”和“b . v”集团每组,n = 5。(E-F)比例的体重测量随着时间的推移(E, FMT;F,外源性细菌殖民化),在第14周开始。(G)的相对丰度答: muciniphila在老鼠的粪便样本图1 d由定量PCR。(设定H)高碘酸希夫(PAS)和阿尔新蓝(AB)染色(H)和黏液层的厚度(I)结肠部分特定的无菌(SPF)和无菌(GF)小鼠(图1 d老鼠),以及由外源性细菌侵入。白色虚线代表黏液层的边界。(J)的生长曲线答: muciniphila暴露于不同浓度的D3体外。代表三个独立的实验。(K-I) IFNγ(K)和irgm1(左)在ilea从SPF小鼠mRNA表达水平图1 d随着时间的推移,体重增加的比例测量(n = 6小鼠每组)。(N) CD36, Fasn Acox2(肝脏)和Adipoq(附睾)mRNA表达水平的防晒系数控制饮食的老鼠(数控和HFD)或处理D3填喂法答: muciniphila每组)(n = 6小鼠。开开,我和k - n, p值测定的小动物——一张长有Wilcoxon测试和数据提出了±SEM手段;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。
粪便微生物群移植(FMT),这导致了肠道微生物群落健康的捐赠者的转移患者,已成为一种有前途的治疗方法选择一系列慢性疾病。37考虑到肠道细菌的成分变化可能发挥作用在D3治疗,我们采用了FMT确定肠道微生物群导致肥胖的救援。老鼠的粪便微生物群D3 10周收集和处理口头给戴奥老鼠。4周后,FMT提升6.50%±2.91%的体重减少受体小鼠HFD控制老鼠相比,而heat-inactivated粪便样本显示没有影响(图4 d, E)。我们想知道任何特定的粪便细菌物种施加这样的保护作用。因此,我们使用两个大大丰富类群(b . vulgatus和答:muciniphila4周)D3-treated戴奥老鼠。的殖民答:muciniphila导致体重明显降低(p < 0.05, Wilcoxon测试),而殖民b . vulgatus没有这种效果(p > 0.05, Wilcoxon测试)(图4 f)。这一发现表明,个别成员(如答:muciniphila)的肠道微生物群转移到受体小鼠可能推迟戴奥老鼠肥胖发展,与之前的研究结果相一致。38然后我们回到最初的SPF小鼠实验,发现大量的答: muciniphila在老鼠的粪便处理D3大约是100倍高于HFD老鼠(图4 g)。
最近,答: muciniphila被认定为mucin-degrading细菌驻留在黏液层。39的专业化答: muciniphila粘蛋白降解使其成为一个关键球员在粘膜腔与宿主细胞之间的接口。通过染色的结肠上皮粘液,我们发现黏液层的厚度显著减少HFD-fed老鼠(SPF)。D3和答: muciniphila治疗中和这种减少(p < 0.05, Wilcoxon测试)。有趣的是,这一效应消失在使用D3来治疗大鼠GF (图4 h,我)。因此,我们推测,黏液层的增厚是由于殖民答:muciniphila而不是D3的直接行动。
进一步探索大量增加的机制答:muciniphila发生与D3治疗,我们第一次测量的生长曲线答:muciniphila暴露于不同浓度的D3体外。所示图4 j不同D3浓度下,没有明显的变化,表明D3不能促进增长答: muciniphila体外。先前的研究发现,答:muciniphila在IFNγ-deficient显著增加小鼠,恢复IFNγ水平可以减少吗答:muciniphila丰富。40IFNγPaneth抗菌蛋白可以诱导的分泌细胞通过Irgm1,下游分子信号级联。先前的研究表明,受损的生产抗菌肽可以导致的过度生长答: muciniphila当干扰素或Irgm1水平降低。在这项研究中,我们观察到D3治疗显著抑制的表达IFNγ和Irgm1回肠的老鼠相对于HFD集团(图4 k, L)。因此,我们推测,丰度的增加答: muciniphila通过D3治疗可能归因于IFNγ-Irgm1轴的负调控。
调查是否答: muciniphila改善肥胖表型的贡献,我们移植答:muciniphila到老鼠戴奥8周。值得注意的是,答: muciniphila与1×10强饲法9CFU /鼠标每2天导致显著减少(p < 0.01, Wilcoxon测试)在小鼠的体重,类似于D3治疗(图4米)。我们进一步的影响相比答: muciniphila和D3在戴奥小鼠脂质代谢。我们观察到的增加Fasn和CD36 mrna的表达,调节脂类的合成和吸收的基因,41减少的mRNA水平Adipoq附睾的脂肪含量,促进脂质氧化,D3的政府或之后答: muciniphila在老鼠GF (SPF小鼠但不在线补充图5 f),建议增加的额外的积极作用答: muciniphila。有趣的是,一个戏剧性的upregulation Acox2,可以进一步增加脂肪酸氧化和抑制脂质积累在肝脏,观察只有在D3-treated SPF小鼠(图4 n和在线补充图5 f)。42这些结果表明,脂质代谢的调控应该是D3的综合效应答: muciniphila。
最近的研究表明,答: muciniphila可以修复的稀释肠道粘液由高脂肪(高频)的饮食造成的。因此,我们进一步研究了如何D3或管理工作答: muciniphila影响结肠粘液。我们发现MUC2的表达水平和IL4 D3的政府或后显著增加答: muciniphilaSPF小鼠(p < 0.05, Wilcoxon测试),但不是在杯状细胞发展的其他标记,43如Klf4 (p > 0.05, Wilcoxon测试)(在线补充图5 d e)。然而,GF老鼠被D3没有显示相同的结果,这表明黏液层的增厚可能归因于大量的增加答: muciniphila而不是D3的直接行动。
D3的抗肥胖效果在其他动物模型
调查D3的抗肥胖效果在其他动物,我们进一步治疗两个额外的戴奥模型、大鼠和猴,D3 (图5 a, H)。值得注意的是,D3治疗导致了8.96%±3.11%减少体重增加大鼠与未经处理的控制HFD暴露的10周(p < 0.05, Wilcoxon测试)(图5 b, C,我)。正如预期的那样,我们观察到D3治疗显著抑制食物摄取戴奥老鼠而HFD控制大鼠(p < 0.05, Wilcoxon测试)(图5 d)。Guca2b在回肠的表达明显增加(p < 0.05, Wilcoxon测试)和瘦素附睾的脂肪含量显著降低(p < 0.05, Wilcoxon测试)(图5 e, F)。同样的,丰富的答: muciniphila增加(p < 0.05, Wilcoxon测试)(图5克)。戴奥猕猴,D3组平均体重增加增益为7.71%±2.97%低于对照组(第六周图5 j)。(图5我)。此外,我们观察到的食物摄入量猕猴D3组显著降低(p < 0.05, Wilcoxon测试)(图5 j),大量增加答: muciniphila(p < 0.05, Wilcoxon测试)(图5 k)。
D3保护老鼠和猕猴从饮食肥胖。(一)实验工作流老鼠每组(n = 8 - 10)。(B)克的老鼠的体重测量。(C)的老鼠的体重增加比例测量随着时间的推移。括号表示比较高脂肪饮食(HFD)和D3。(D)老鼠的食物摄入量每隔一天测量1星期。(E) Guca2b mRNA表达水平回肠的老鼠。(F)瘦素mRNA表达水平在大鼠附睾的脂肪。(G)的相对丰度Akkermansia muciniphila在大鼠的粪便样本。(H)吃普通食物的同类实验工作流猕猴(正常的食物,NC)或HFD 6周每组(n = 3)。(I)百分比猕猴体重的测量。括号表示比较HFD和D3。(J)食物摄入量在猕猴每隔一天测量1星期。(K)的相对丰度答:muciniphila在猕猴的粪便样本。(L)的总结D3在治疗肥胖的作用。瘦素作为感光剂,D3可以移植的表达uroguanylin (UGN)回肠,针对下丘脑抑制食欲。D3还可以增加丰富的答: muciniphila在肠道,进而可能会影响肝内脂质吸收和新陈代谢。B-G和i (k, p值测定的小动物——一张长有Wilcoxon测试和数据提出了±SEM手段;* p < 0.05;* * p < 0.01。
讨论
尽管肥胖管理有明显改善,治疗这一目标仍然缺乏其基本流程。越来越多的药物疗法,可以支持减肥的兴趣。44目前,一些人类内源性肽用于治疗2型糖尿病和肥胖,比如K-casein-derived glycogenous肽和酪蛋白。45此外,一些肠肽(如α-defensin 5)被用来反向dyslipidaemia产能和改善glucoregulatory戴奥老鼠。21我们发现,口服的D3导致身体12.06%±2.35%减少体重增加和改善肠道微生物群失调在戴奥老鼠。我们进一步证明D3可以上调UGN和瘦素抵抗的表达,两者都可以抑制食欲的老鼠。我们的研究提供了一个新颖的观点和证据,内源性多肽源于降解片段的蛋白质前体可能发挥重要的作用在调节肥胖和其他代谢疾病(图5 l)。
到目前为止,五个药物(奥利司他、芬特明+托吡酯、环丙甲羟二羟吗啡酮+安非他酮,liraglutide和semaglutide),所有这些都有一个使食欲减退的效果,已经批准的食品和药物管理局(FDA)对长期在成年人体重管理。46在这项研究中,我们发现,D3治疗后,SPF小鼠和GF老鼠的食物摄入量明显减少,伴随着在小肠UGN表达增加。UGN, 16-amino-acid厌食症患者激素分泌肠嗜铬细胞的细胞在小肠,已被证明目标GUCY2C受体的下丘脑和激活通过血液循环使食欲减退的途径。47在老鼠身上prouroguanylin静脉注射可能引起饱足。47金等48还发现,转基因UGN brain-specific启动子的控制下可以产生生理水平诱导耐用使食欲减退的反应相反的体重至少24周不改变戴奥老鼠的代谢率。我们发现D3治疗可以抵抗的出现和恶化食源性肥胖小鼠移植UGN的表达和血清中增加内容。这样一个UGN(肠道)-GUCY2C(下丘脑)内分泌轴可能有潜力作为新的治疗目标控制食欲和代谢综合症。此外,我们发现D3恢复补充瘦素海拔引起的高频饮食和瘦素的敏感性增加。瘦素可以减少食欲电弧通过抑制神经元的活动,在下丘脑食欲调节的中心。49c-Fos表达的一个戏剧性的感应弧神经元被激活时发生饥荒,政府可逆转的食欲抑制剂(如雌二醇50和瘦素51)或喂养。32值得注意的是,调节c-Fos表达式及其与老鼠POMC神经元表达colocalisation D3政府后,可能由于D3的综合效应促进UGN表达式和瘦素作为感光剂。
目前,有越来越多的证据的肠道微生物群作用的各种代谢紊乱和肠道微生物群的操作可能是一个新的治疗选择。52 53在我们的研究中,我们发现,D3治疗可以减少大量的脱磷孤菌属和瘤胃球菌属。的管理脱磷孤菌属GF老鼠导致体脂百分比的增加和CD36的表达,41脂质吸收和体内平衡的关键调节器在哺乳动物。54另外,我们观察到一个更高的丰富拟杆菌在D3-treated老鼠。许多观察和介入研究相关贫瘠或体重水平的提高拟杆菌门,它可以产生短链脂肪酸。55然而,这种关系是有争议的,因为观测研究也发现的丰度增加拟杆菌与西方的饮食有关,与肥胖有关。56在这里,我们发现,大大丰富了殖民的分类单元b . vulgatus4周不导致显著改变戴奥老鼠的体重。相比之下,肥胖表型被移植了答: muciniphila肥胖老鼠,这与以前的研究一致。38 57值得注意的是,不同体重的百分比在GF老鼠(9.14%±2.93%)和SPF小鼠(12.06%±2.35%)处理D3进一步演示了肠道微生物群的作用在治疗肥胖。事实上,许多药物和化学物质被发现减少体重会影响肠道微生物群。例如,liraglutide变化的总体组成和相对丰富weight-relevant phylotypes,如减少变形菌门和增加答: muciniphila在对待戴奥老鼠。58有趣的是,D3治疗增加了丰富的答: muciniphila了100倍,这种效果是明显强于前面两种药物(三到五次)。
一些多肽已经被用来作为信号分子在神经内分泌系统的调节,防止肥胖,包括liraglutide和semaglutide,44glucagon-like peptide-1 (GLP-1)受体激动剂和adrenomedullin 2。14然而,几个原因可以解释采用缓慢注射GLP-1R受体激动剂,包括依从性差的患者人群注射疗法和普通病人倾向于口服药物相比,注射疗法。59有趣的是,值得注意的是,在我们的研究中,口服的D3显著降低小鼠的体重,表明潜在的D3作为首选治疗方案有效的肥胖。肥胖是有限的使用药物安全问题。在目前临床使用FDA批准的药物治疗肥胖,似乎大部分都有副作用。例如,GLP-1类似物已被证明导致副作用,包括瞬态恶心、GLP-1RA-related或胰岛素的胃肠道副作用60急性胰腺炎,61年呕吐,食欲不振,限制用量。值得注意的是,没有明显的副作用D3观察小鼠在我们的研究中,老鼠或者猕猴。考虑到我们的实验进行了只有10 - 12周,实验周期较长需要验证的结果。
总之,在此我们报告一个小肽,D3,不是GLP-1模拟,可以抑制肥胖的发展通过抑制食欲和调节肠道微生物群。这项研究增加了新的证据,UGN-GUCY2G轴是一个潜在的治疗目标,治疗肥胖的药物开发和支持的证据表明D3竞争候选人抵消食源性肥胖与有利的安全性。这种肽在人体的潜在的多效性的角色仍然需要在将来的研究中得到解决。
方法
从人类defensin HD5疏水肽的合理优化
一个隐藏的马尔可夫模型中实现TMHMM服务器V.2.0被用来评估肽穿透细胞膜的能力。多肽二级结构是模仿使用瑞士模式62年与人类HD5 zmp(1)作为模板。D1-4的两性分子的表面和三维结构建模使用PyMol V.2.3.2。63年D1-4被Mimotopes合成使用固相合成(无锡,中国)。
菌种、政府和粪便微生物移植
拟杆菌vulgatus写明ATCC 8248和Akkermansia muciniphila(写明ATCC baa - 835)厌氧生长在37°C岐阜厌氧培养基(HB8518-1、Hopepiol、青岛)。老鼠接受b . vulgatus和答: muciniphila通过口服剂量的1×10强饲法9CFU / 0.2毫升悬浮在无菌厌氧磷酸缓冲盐(PBS)。类似的甘油浓度(2.5% /卷卷)被用来控制。继续治疗4周。
FMT实验,2 - 3新鲜粪便颗粒被涡流resuspended厌氧PBS,然后是浮在表面的收获和混合。细菌是收获和resuspended在无菌和无氧PBS FMT之前,和100年µL悬挂的管理的小鼠口服填喂法为4周每天两次。此外,灭活细菌处理高温也接种的小鼠口服填喂法每天两次4周,作为控制。
动物和实验
操作的SPF小鼠和大鼠
所有C57 / Bl6J老鼠和雄性SD (SD)中老鼠(SPF生物技术,北京)和ob / ob小鼠(Hua富康生物技术,北京)被安置在4 - 6组动物每笼在一个无菌设施标准层理和浓缩在一个温控和湿度的房间12小时光/暗周期与免费的食物和水。所有的动物喂养一个标准实验室chow饮食(生长和繁殖饮食、SPFSLFZ003 SPF生物技术,北京,中国),除非另有说明。HFD小鼠或大鼠喂养高频饮食(啮齿动物的饮食以60千卡%脂肪,D12492;研究饮食,美国新泽西州新不伦瑞克)。对于老鼠来说,只有使用D3。经过1周的复苏,动物被随机分配到治疗组,治疗持续了10周。食物摄入量和体重是每周监测。新鲜的排泄物从动物收获和储存在−80°C进行进一步分析。上述所有实验小鼠和大鼠的4周开始的年龄,除非另有注明。
操作的女朋友老鼠
GF C57Bl / 6小鼠获得的实验室动物科学军队医科大学(中国重庆)。小鼠和大鼠被颈椎脱位牺牲。收集有关机关,立即沉浸在液氮和存储在−80°C进行进一步分析。皮下和内脏脂肪存款是精确的解剖和体重。
Pair-feeding
pair-feeding实验是按照之前报告的程序执行。64年对喂养是通过测量广告的食物摄入量libitum-fed D3-treated老鼠每24小时,呈现这的食物量pair-fed接受pbs老鼠两次(12小时内)的一半。得出血液样本,并组织收获如上所述。
操作的猕猴
恒河实验是由北京的生物技术。九个恒河猴饲养标准食物饮食(# 2150230401,主要的生物技术,北京,中国)被随机分配到三个治疗组:D3,数控和HFD。
短期食物摄入量测量
食品重量记录每隔一天1周在一段时间内,对每一个为期两天的时间,每天平均摄入决心和平均周测量周期为每个单独的。
抗生素治疗
SPF WT老鼠与联合抗生素治疗(ABX)包含100 g / L新霉素(σ),100 g / L青霉素(σ),50 g / L万古霉素(σ)和100 g / L甲硝唑(σ)8周。
形态学和组织学
肝脏和脂肪组织样本快速收集和固定在4%多聚甲醛(PFA) 24小时和嵌入式解决方案在石蜡。部分10µm沾染了)。ABPAS染色使用之前的方法进行。65年至少10个不同的测量了垂直于每个领域内黏液层和被ImageJ手工描述和分析。
口服后本地化的D3
FITC-D3用于追踪药物在靶器官和他们的行动路径。瑞士卷是根据以前公布的方法,65年与一些细微的修改。口服后,0.8毫克/公斤FITC-D3 3小时,老鼠牺牲,小肠被割开的内腔的一侧肠使用spring剪刀。棉签被用来卷起的肠子被展开。肠道是在自闭钳轻轻摇均匀,确保每个连续辊巧妙地把过去辊与边缘齐平。辊是轻轻地滑出棉签放入适当的标签包含组织体积的10倍福尔马林锅。Whole-tissue滑动扫描×40放大在显微镜下进行幻灯片扫描仪(Pannoramic MIDI, 3 dhistech)。图像分析与禅宗成像软件由蔡司。照片是通过使用一个LSM 880(蔡司)或一个旋转盘共焦显微镜(奥林巴斯)。
本地化的D3细胞内吸收,HCT116细胞接种到共焦菜(1×105细胞/)和孵化18小时37°C。免费的FITC(10µM)或FITC-labelled D3(10µM)被添加到文化1小时。染色后,这些细胞被洗两次与PBS和后一个旋转盘共焦显微镜下观察(奥林巴斯)后的新鲜培养基。
免疫荧光的回肠和下丘脑
组织部分都被立即删除,用PBS,安装在包埋介质(Tissue-Te, O.C.T.化合物)和存储(−80°C),直到使用。免疫荧光进行使用anti-UGN (1:200;MBS7605526;MyBioSource)抗体。与二次抗体检测和标签进行共轭Alexa萤石- 488驴anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) (1/500, A21206,英杰公司)。
神经细胞识别和c-Fos染色
24老鼠(男,8周大)喂养标准食物饮食同样分成八组(NC-0h、NC-1h NC-2h, NC-3h;D3-0h、D3-1h D3-2h D3-3h)。对基因表达分析,下丘脑是收获后0 - 3小时D3政府(NC:生理盐水),和c-Fos的表达水平,AgRp和Pomc被定量rt - pcr量化。
同样的实验进行了免疫荧光。c-Fos染色进行了一项研究中描述。66年简单地说,老鼠犀牛致命剂量的戊巴比妥,transcardially与PBS其次是4%多聚甲醛灌注。大脑被移除,一夜之间放置在4%多聚甲醛和30%蔗糖脱水1周。大脑被切成25毫米部分。上面描述的部分被视为和孵化一夜之间在室温下鼠标anti-FOS (1:50 0;ab208942;Abcam)或兔子anti-POMC (1:10 0;ab254257;Abcam)。使用二次抗体检测和标签进行共轭Alexa萤石- 594驴anti-mouse免疫球蛋白(H + L) (1/500, ab150108, Abcam)或Alexa萤石- 488驴anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) (1/500, ab150073, Abcam)和影像进行如上所述。图片是pseudocoloured使用Photoshop软件(Adobe)或ImageJ (NIH)。
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引用
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脚注
ZL和BZ是并列第一作者。
推特@Fangqing_Zhao
贡献者FZ负责整体内容作为担保人。FZ构思和监督。FZ ZL设计研究,解释结果和写的手稿。WH的团队给女朋友老鼠和记录实验数据。回肠转录组和粪便菌群多样性分析。ZL、HW ZZ和NW执行所有其他的实验和数据分析和准备数据和表。
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