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摘要
客观的目前解释IBD中促炎免疫反应的假设之一是T细胞对未知肠道抗原的失调反应。因此，通过分析IBD患者和对照组的外周和肠道T细胞受体(TCR)库，有可能确定疾病相关的T细胞克隆型。
设计我们使用高通量测序对244名IBD患者和健康对照组的外周血样本以及59名IBD患者和疾病对照组的匹配血液和肠道组织进行了TCR α和β链的批量TCR库谱分析。我们通过单细胞RNAseq进一步鉴定了特异性T细胞克隆型。
结果我们发现了一组克隆型，其特征是半不变的TCR α链，在克罗恩病(CD)患者的血液中显著富集，特别是在CD8中扩增+T细胞群。单细胞RNAseq数据显示这些细胞具有先天表型，与非传统T细胞(如粘膜相关不变T和自然杀伤T (NKT)细胞)具有相当的基因表达，但具有不同的TCRs。
结论我们鉴定并鉴定了非传统crohn相关不变T (CAIT)细胞亚群。多项证据表明，这些细胞是NKT II型群体的一部分。该群体对CD或其亚群的潜在影响仍有待阐明，CAIT细胞的免疫表型和抗原反应性需要在未来的研究中进一步研究。
- t细胞受体
- T细胞
- 克罗恩氏病
- 粘膜免疫
- 炎症性肠病
数据可用性声明
如有合理要求，可提供资料。数据可以从第三方获得，但并不公开。大量TCR基因库分析的原始测序数据可在ENA数据库中获得，研究登录号为PRJEB50045。单细胞基因表达和TCR处理数据可在FastGenomics数据库(Seurat_objects_Rosati_TCR_IBD)中获得。原始单单元数据(fastq文件)可根据要求从相应作者处获得。HLA基因数据可根据合理要求从通讯作者处获得。全血TCR收集的元数据可通过Popgen生物库获得。
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用属性4.0 Unported (CC BY 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人出于任何目的复制、重新分发、重新混合、转换和构建此作品，前提是原始作品被正确引用，提供到许可证的链接，并表明是否进行了更改。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
T淋巴细胞是已知的驱动克罗恩病(CD)的发病机制和进展。
先前的研究确定了t细胞受体(TCR)库特征和特异性克隆型与疾病状况和预后相关。
个体间的差异性对多个患者共享的疾病相关TCRs的识别和验证提出了挑战。
新的发现是什么?
具有半不变TCRα基序的T细胞在CD患者的血液中强烈富集。
这些克隆型主要存在于CD8+ T细胞中，具有非常规的T细胞表型。
多项证据表明，这些细胞是自然杀伤T (NKT) II型群体的一部分。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
所鉴定的克隆型引起了人们对NKT II型细胞在CD中的可能作用的关注，值得进一步研究。
这些克隆型可能将CD与其他形式的IBD以及其他疾病区分开来，并为CD提供了一种新的生物标志物。
简介
T细胞对肠道抗原的反应失调被认为是IBD的原因或驱动因素。1 2假设也适用于其他炎症和自身免疫性疾病，例如多发性硬化症3.或者1型糖尿病，4IBD中过度的免疫反应可能是针对常见的，但仍然未知的疾病驱动抗原。在遗传易感的宿主中，来自非生物微生物组的抗原可能通过受损的肠上皮屏障与T细胞接触，这可能导致不受控制和失调的免疫反应。2因此，有可能在IBD患者的外周血和/或肠道炎症部位识别特定疾病相关的T细胞。
虽然IBD的两种主要形式，即克罗恩病(CD)和UC通常被称为“IBD”，但它们在临床上是两种独立的疾病，具有不同的疾病表型，但部分重叠的基因型。5乳糜泻可发生在胃肠道的任何部位，主要是在小肠，而结肠炎只发生在结肠。6此外，虽然这两种疾病都被认为是由失调的T细胞反应介导的，但假设不同的T细胞亚群在疾病的发病和进展中发挥作用。7区分这两种疾病的表型和标记存在，但有限，有时导致不正确的诊断。进一步区分两种形式的IBD可以更好地理解病理生理学，以及发展疾病的诊断和治疗策略。
大多数T细胞具有独特的T细胞受体(TCR)，由α和β链形成。T细胞识别由主要组织相容性复合体(MHC)呈现的抗原肽。在通过TCR识别抗原时，T细胞可能会克隆扩增，从而产生具有相同TCR的细胞群(“克隆型”)。TCR保留库定义为一个人的唯一TCR的集合，变量很大，最多可达10个11在一个人身上存在独特的克隆型。8因此，TCR库的组成，即不同TCR的多样性或个体克隆型的扩展，可以为疾病相关的T细胞反应改变提供重要的见解。
使用高通量测序的TCR基因库分析已成为分析各种疾病和病症的一种方法。9在IBD患者中鉴定与疾病相关的T细胞克隆型可能是阐明TCR库变化如何影响疾病、鉴定致病T细胞和抗原触发因子以及开发新的诊断和治疗策略的重要一步。先前的研究发现，与血液样本相比，IBD肠道样本中的克隆型有所扩大9 - 12并将肠组织中患者特异性TCRs的存在与术后疾病复发联系起来。12然而，到目前为止，由于疾病和TCR库的个体间变异性，在多个个体中鉴定疾病相关的克隆型已被证明具有挑战性。此外，肠道物质的获取往往是一个限制因素。9 10 12此外，大多数研究只关注TCR β库，这是更多变的，被认为是更有信息的，以推断独特的克隆型以及抗原和HLA特异性。因此，TCR α基因库的研究不足。只有非常少的数据集，其中没有一个包括IBD，可以同时获得α链和β链。
T细胞的一个子集是由所谓的非传统T细胞形成的，它可以识别非经典的HLA分子。最著名的非传统T细胞包括与MR1结合的粘膜相关不变T (MAIT)细胞，以及与mhc样分子CD1d结合的自然杀伤T (NKT)细胞。MAIT细胞和NKT I型或不变的NKT (iNKT)细胞的特征是由半不变的TCR α序列形成TRAV1-2，TRAJ33/20/12和TRAV10，TRAJ18基因,分别。13 - 16相反，NKT II型细胞表达多克隆库。尽管关于非传统T细胞仍有许多悬而未决的问题，但它们已被描述为识别微生物起源的配体，从而与肠道菌群相互作用。15虽然已知MAIT细胞在IBD患者血液中减少，并积聚在炎症的肠粘膜中，17NKT II型细胞在IBD中的作用尚不清楚，关于这些细胞的保护或致病作用的证据相互矛盾。18
在这里，我们对多个独立的样本收集进行了综合分析，其中包括alpha和beta TCR谱表分析以及HLA数据。我们在CD患者的血液中检测到特定T细胞克隆型的选择性富集，进一步通过单细胞RNAseq和TCRseq进行表征。本文鉴定的克隆型的特征是TCR α链的半不变基元，以及与非传统T细胞共享的基因表达(GEX)标记。基于我们自己的研究成果和其他人的研究成果，19我们假设这些细胞是NKT II型细胞的一个新的特异性亚群，我们首次展示了其在CD患者中的富集。
研究流程及主要成果的图形摘要。两种样本采集用于IBD患者和对照组的t细胞受体(TCR)库谱分析:(1)全血采集包括IBD和健康对照组的大量血液样本;手术收集包括IBD患者和疾病控制(结肠癌，CRC)患者的匹配血液、肠组织和肠淋巴结，均来自(2.1)大块组织和(2.2)分类T细胞群。多个共享半不变TCR α基元的TCRs被发现在CD患者中富集，特别是在CD8中+分数。在三名重新接触的CD患者和三名年龄和性别匹配的健康对照组的单细胞RNA和TCR数据中重新鉴定了携带这种TCR motif的细胞。单细胞基因表达分析显示，cd相关克隆型具有CD8富集的先天性表型+T细胞与非传统T细胞，即黏膜相关不变T (MAIT)和自然杀伤T (NKT)细胞相当。因此，为了简单起见，我们在整个手稿中将这些克隆型称为克罗恩相关不变T (CAIT)细胞。最后，基于我们自己的结果和其他研究，我们假设CAIT克隆型是NKT II型家族的一部分，并对CD1d hla样分子反应。
结果
乳糜泻患者血液中TCRs富集或缺失的鉴定
我们采用前瞻性血液样本收集109例CD, 36例UC患者和99例健康对照(在线补充表S2)，目的是鉴定与CD相关的特定T细胞克隆型。因此，我们对TCR α链和TCR β链进行了TCR谱图分析。20.所分析的大量TCR数据的摘要可在在线补充表S3．
首先，我们研究了是否可以识别CD患者血液中选择性富集或减少的特定克隆型。作为第一个探索性分析，我们比较了CD患者、UC患者和健康对照组中TCR α和TCR β克隆型的频率，这些克隆型由可变(V)基因、连接(J)基因和CDR3区域长度(氨基酸)分组在TCR家族中。结果显示TCR β链无差异(在线补充图S1A,B)．然而，对于TCR α链，克隆型携带12个氨基酸的CDR3序列和基因组合TRAV1-2＿TRAJ33与健康个体和UC患者相比，乳糜泻患者的发病频率较低(图2一个和在线补充图S1C)．这是通过Fisher对该组单个TCR alpha序列的精确测试证实的在线补充表S3B)．这些CDR3长度和基因组合以前被注释为MAIT细胞。14事实上，在IBD患者的血液中，MAIT细胞已被证明是减少的。21日22
血液中crohn相关不变T (CAIT) α链的鉴定。(A)克罗恩病(CD)患者和健康对照组中所有CDR3长度和VJ基因组合的频率散点图。在CD患者中观察到15个aa长的TRAV12-1_TRAJ6克隆型的富集和12个aa长的TRAV1-2_TRAJ33克隆型的缺失。(B)在CD中富集的TRAV12-1_TRAJ6 CDR3氨基酸基序的标志图。具有该基序的t细胞受体(TCRs)以下被称为“crohn相关TCRs”并定义CAIT细胞。(C) CDR3α位置1-15 (CVVNLASGGSYIPTF)的放大图，将氨基酸位置描绘为球形和棒状，并按照下面序列面板所示的颜色进行着色。氨基酸位置4-7 (NLAS)用红色表示。橙色为G8和Y11的氨基酸位置，由于其侧链朝向表面，预测它们与6A和7S直接与表位相互作用。(D)饼图显示携带不同数量cd相关克隆型的个体比例。(E)显示CD中特定序列富集的网络图。仅显示存在CAIT克隆型的样本。每个分离的节点/集群组代表一个个体。每个节点代表一个CAIT TCR的(基序组图2 b)．节点的大小反映了特定样本/个体中克隆型的丰度．淋巴结的颜色代表疾病组。值得注意的是，如果在多个个体中发现相同的TCR，则可能在图中出现多次。(F)每个个体的cd相关克隆型的对数转换累积丰度。丰度为0在对数刻度上表示为- 6。在水平红线以上的患者中，CAIT克隆型占全血库的2.5%以上，详细地说，32/109的CD患者(29.3%)，但只有1/36(2.7%)的UC患者和1/99(1%)的健康个体。采用Mann-Whitney U检验评估疾病组间的差异，然后采用错误发现率(FDR)多重比较校正。
在CD患者中，一组由15个氨基酸CDR3区域定义的TCR α链和基因组合TRAV12-1＿TRAJ6与健康对照组或UC患者相比(图2一个和在线补充图S1C)．Fisher的精确测试证实>有10个克隆型TRAV12-1＿TRAJ6组的CD患者数量明显高于对照组(p值在在线补充表S3B)．该TCR组的克隆型在CD中显著富集，共享半不变CDR3基序CVV**A*GGSYIPTF (图2 b)．为了简单起见，在整个手稿中，我们将这些克隆型称为克罗恩相关不变T (CAIT)克隆型。
所鉴定的CDR3基序的第4位和第5位变化最大，而第6位和第7位则较为保守，分别被A氨基酸和S氨基酸占据。此外，预测的TCR alpha CDR3环的三维结构表明，位置4和5主要埋藏在TCR蛋白结构内部，可能间接影响环的构象。位置6和7被暴露，预计位置8和11与表位相互作用最密切(图2 c和在线补充图S1D)．然而，CDR3循环非常灵活，在与不同表位相互作用时可能适应不同构象。因此，原则上，除末端3-4残基外，所有CDR3氨基酸位置都可能与抗原接触并影响结合亲和力。
与健康对照组相比，在CD患者中发现了更多的不同CAIT克隆型(不同的CDR3区域)(图2 d)．此外，在乳糜泻患者的血液中，它们也更加扩大(图2 e)和它们的累积丰度(每个样本中它们相对丰度的总和)在CD患者中的显著高于对照组(p值=0.008，图2 f)．总而言之，49/109 (45%)CD患者、7/36 (19%)UC患者和37/99(37%)健康对照组中至少存在一种CAIT克隆型。在32/109 (29.3%)CD患者中，CAIT TCRs占全血库的2.5%以上，而只有2.7%的UC患者和1%的健康个体(图2 f)．相反，正如先前在其他研究中观察到的那样，与MAIT细胞相关的克隆型表现出相反的行为，并且在CD中降低(p值=3.7*10)−16，在线补充图S1E,F)．
为了进一步描述CAIT克隆型，我们研究了这些TCRs潜在的HLA特异性，这也将是识别这些TCRs可能反应的抗原的重要一步。此外，已知某些HLA等位基因与乳糜泻有关。23因此，研究与CD相关的TCRs是否可以结合其中一种是有意义的。24我们使用先前发表的参考数据集和方法对患者进行基因分型并估算HLA等位基因。25日26日CAIT克隆型的存在或丰度与I类(-A， -B， -C)或II类(-DP， -DQ， -DR)的特异性HLA等位基因之间未观察到显著相关性(在线补充表S4A,B)．我们还研究了CAIT TCRs是否与表型或临床特征相关。CAIT TCRs的累积丰度或数量与性别、年龄、吸烟行为、疾病部位、疾病严重程度或既往CD治疗等临床参数之间没有发现显著相关性(在线补充图S2A-N和在线补充表S4C)．在开始使用抗tnf生物制剂治疗之前，收集CD患者的样本。观察到一个不显著的趋势，显示在抗tnf治疗无效的患者中CAIT克隆型数量增加(p值=0.089，在线补充图S2N和在线补充表S4D)．虽然没有达到统计学意义，但在受回肠或回结肠CD影响的患者中，CAIT TCRs比结肠CD更丰富(p值=0.07，在线补充图S2A和在线补充表S4C)，这可能是仅在一部分患者中鉴定出CAIT细胞的潜在解释。
CAIT克隆型存在于乳糜泻患者的血液和肠道组织中
为了验证CD中CAIT TCRs的存在和丰度，我们分析了一个独立的样本收集(手术批量在图1)，包括37名接受肠道切除手术的患者的匹配血液和肠道组织，其中11名乳糜泻患者、13名UC患者和13名结肠癌患者作为疾病对照(在线补充表S5)．根据全血容量数据，CAIT TCRs的数量被证实增加(图3一)和CD患者血液中的累积丰度(p值=0.002，图3罪犯)．在9/11 (82%)CD患者、4/13 (31%)UC患者和3/13 (23%)CRC患者的血液中观察到CAIT克隆型。在7/11(63.6%)的CD患者中，CAIT TCRs占全血库的2.5%以上，而在UC患者和CRC患者中，CAIT TCRs占全血库的最大比例分别为0.3%和0.6%。肠组织也无显著性变化趋势(多次检测校正后p值=0.07)。对于一部分患者(4例CD和5例UC)，还分析了切除的肠系膜淋巴结和炎症的肠组织。与UC患者相比，CD患者肠淋巴结中CAIT克隆型明显更丰富(p值=0.02，图3模拟)．虽然在血液中观察到大多数CAIT TCRs，但也观察到在同一个体的多个分析组织中同时存在少数CAIT克隆型(图3 c)．
血液、肠组织和肠淋巴结中的CAIT t细胞受体(TCR) α链。(A)饼图显示了在血液、肠道和肠淋巴结中携带不同数量克罗恩相关不变性T (CAIT)克隆型的个体比例(11例克罗恩病(CD)、13例UC、13例结肠癌(CRC))。(B)每个个体和组织的克罗恩相关克隆型的对数转换累积丰度。在水平红线以上的患者中，CAIT克隆型占全血库的2.5%以上(7/11 (63.6%)CD患者，0% UC患者和CRC患者)。采用Mann-Whitney U检验评估疾病组间的差异，随后采用FDR多重比较校正。(C)一个有代表性的CD患者的组织(x轴)中CAIT TCRs对数转换相对丰度的热图(#15)。y轴上的标签表示变量的位置4 - 7CAIT TCRs的CDR3序列。(D)网络图显示CAIT序列在CD中在三个分析的组织样本中富集。因此，每个分离的聚类代表一个个体/样本。每个节点是基序组的一个TCR图1 b．节点的大小表示特定样本/个体中克隆型的丰度。顶点的颜色代表疾病组。值得注意的是，如果在多个个体中发现相同的TCR，则可能在图中出现多次。
为了回答CAIT细胞是否发生在特定的T细胞室中的问题，血液和肠道T细胞在CD4中进行了分类+天真,CD4+常规记忆，CD4+调控和CD8+T细胞用于另外7例CD患者，5例UC患者和9例CRC患者(在线补充表S1和S6)．令人惊讶的是，在所有分析的分数中都发现了CAIT TCRs，但频率不同。CD8细胞中CAIT细胞最多+与其他细胞区室相比，每个个体检测到多达22个CAIT TCRs，且累积丰度更高(图4 a, B)．相比之下，UC患者血液中几乎没有CAIT序列，CRC患者中CAIT序列丰度较高的多在T中注册和T天真的分数。
克隆相关不变T (CAIT) T细胞受体(TCR) α链在分类T细胞群。(A)在分类的T细胞群和分析的组织中，每个个体中CAIT TCRs的存在和log10转换的相对丰度(y轴)。特别是CD8+(从上到下的第一个面板)和CD4+在克罗恩病(CD)患者中发现更多的CAIT TCRs。(B)饼图显示了按疾病组(CD:左，UC:中，结肠癌(CRC):右)在两种组织和四种细胞群中携带不同数量克罗恩相关克隆型的个体比例。其中CD 7例，UC 5例，CRC 9例。
与CAIT α链配对的β链是单个个体的私有链，并表现出优先使用V基因
对于三名CAIT细胞比例很高的CD患者，我们接下来用facs纯化CD4细胞+和CD8+使用10× Genomics的Chromium技术进行单细胞RNA GEX和TCR测序。对三个性别匹配和年龄匹配的健康对照进行了同样的分析。
根据我们最初的发现，在三名CD患者的TCRs中，CAIT细胞被鉴定为高丰度(22-238个CAIT细胞/例)(图5 a, B和在线补充表S7A)，而在健康对照组中很少见(每个健康个体有0-2个CAIT细胞，图5一个)．对TCR α / β对的分析显示，不同的TCR β链与半不变的CAIT α序列相关(图5 b和在线补充表S7B)．对CAIT克隆型中TCR α / β链配对的分析显示优先配对(38%)- - - - - -55%的CAIT克隆型)，β链携带TRBV7-9三名患者的基因(图5 c)．在之前分析的大量TCR数据集中(244个全血和59个手术样本)的任何其他个体中都没有发现已确定的配对TCR β链。因此，这些TCR beta序列似乎对单个个体来说是私有的，或者在被检查的人群中非常罕见(在线补充表S7C)．
对3名克罗恩病(CD)患者和3名匹配的健康对照的分类记忆CD4和CD8细胞进行单细胞分析。(A)粘膜相关不变T (MAIT)(绿色)、不变NKT (iNKT)(紫色)和克伦相关不变T (CAIT)(粉红色)细胞的均匀流形近似和投影(UMAP)(联合)定位。在CD患者(上3个面板)和健康对照组(下3个面板)中都有丰富的MAIT细胞，而CAIT细胞在CD患者中丰富而在健康对照组中非常稀疏，在健康对照组中分别只有1个(左下面板)和2个(右下面板)CAIT细胞。(B)通过单细胞TCR分析，在三名CD患者中观察到扩增最多的CAIT克隆型的配对t细胞受体(TCR) α和β链。(C)分析了三名CD患者中TCR β链配对CAIT的V基因。绘制为具有特定V基因贝塔配对的独特克隆型的比例。(D) Seurat功能簇的UMAP单细胞可视化。(E)定义CD4的Seurat聚类标记基因的气泡图+和CD8+不同的人群。(F)相同功能簇的MAIT和CAIT细胞之间差异表达的基因(簇12，效应记忆CD8+CD161+T细胞)。
CAIT克隆型显示先天性GEX型
基于GEX分析的Seurat聚类，27我们定义了12个分类CD4的T细胞群+和CD8+单元，如图所示图5 d．每个聚类的标记基因列于在线补充表S7D总结在图5 e．CAIT细胞以CD8细胞为主+部分，更准确地说，在效应记忆集群的特点是高表达KLRD1(CD94)和KLRB1(CD161)，它们是已知的先天性类T细胞和自然杀伤细胞的标记物(图5 a e和在线补充图S3A)．大多数CAIT细胞在CD8中发现+效应存储器CD161+包括已知的非传统T细胞亚型，如MAIT和NKT细胞。该集群的特征还包括基因的上调，如SLC4A10，CEBDP和IL18R它们是MAIT细胞的典型GEX标记28 29（图5 e和在线补充图S3A,B)．事实上，MAIT和iNKT细胞是通过它们的TCRs在这个簇中被鉴定出来的30 31（图5一个)．在CD8效应记忆簇中也发现了CAIT、MAIT和iNKT细胞的一个较小子集，其主要特征是表达KLRD1CD94是先天性免疫的另一个标记物，存在于NK细胞、NKT细胞和MAIT细胞亚群中。32 33因此，CAIT细胞显示出与已知的非传统T细胞相当的先天性GEX特征。此外，在这些患者中，它们的丰度与MAIT细胞相当，而iNKT细胞非常罕见。为了进一步研究CAIT和MAIT细胞之间的表型差异，我们对这两组细胞进行了差异表达分析。结果表明，尽管CAIT细胞和MAIT细胞的GEX图谱非常相似，但CAIT细胞表达更高水平的自然杀伤相关基因，如Klrd1, gzmh, fgfbp2和CX3CR1，而他们会下调IL7R（图5 f和在线补充表S7E)．34 35此外，CAIT细胞表达CD69，IFNg和肿瘤坏死因子(在线补充表S7E)．
CD4细胞中还发现个别CAIT和MAIT细胞+这证实了我们在大量TCR水平上的观察，即CAIT克隆型出现在CD8富集的两个分数中+细胞(图4 a, B）
TRAV12-1+细胞中CAIT克隆型的变化频率
接下来，我们想评估是否有可能通过流式细胞术有效地捕获和表征CAIT克隆型。我们分析了39名CD患者、20名UC患者和18名健康对照者的外周血，以及14名CD患者、7名UC患者和19名CRC患者的肠道活检(在线补充表S8和S9)．通过控制CD3+TRAV12-1+CD161+IL18R+单元格(门控策略在线补充图4A)，我们发现，与健康对照组相比，乳糜泻患者血液中这一种群显著富集，令人惊讶的是，UC患者血液中这一种群也显著富集(在线补充图4B)．在这些细胞中，CD8+分数(CD8+TRAV12-1+CD161+IL18R+与健康供者相比，乳糜泻患者中明显富集(在线补充图4C)．相反，正如之前其他研究表明的那样，17MAIT细胞(CD3+TRAV1-2+CD161+IL18R+)在IBD患者血液中的总CD3均有所下降+和CD3+CD8+室(在线补充图4D,E)．然而，肠道活检的分析并没有完全概括这些发现。虽然“cait样”人群(CD3+TRAV12-1+CD161+IL18R+)通常在肠道组织中有较高的频率(0%-4%的CD3+细胞)与血液(0%-1.8%的CD3+细胞)时，我们只观察到一个趋势，但在CD (在线补充图4F-H)，与MAIT单元相反(在线补充图4I,J)．
如果HLA表位未知，流式细胞仪无法捕获特异性克隆型，因此其检测的准确性仅限于TCR V区域，而该区域的特异性抗体可在市售。因此，我们使用我们的单细胞数据来评估CAIT克隆型在表达TCR的克隆型中的频率TRAV12-1基因。我们还将其与TRAV1-2中MAIT克隆型的频率进行了比较+细胞。MAIT TCRs占33%- - - - - -所分析的TRAV1-2的80%+乳糜泻患者的细胞和58%- - - - - -健康对照组的95%相比之下，在TRAV12-1中CAIT克隆型的百分比+细胞的变化很大，CD患者的变化范围为1.9%至36%，健康对照组为0%至0.3% (图6)．当关注细胞表达时，CAIT细胞的频率增加KLRB1（图6 b)，编码CD161蛋白。在这个子集中，CAIT克隆型为6.0%- - - - - -70%的TRAV12-1+和0%- - - - - -健康对照中MAIT克隆型占TRAV1-2的比例为2%+是64%- - - - - -96%的乳糜泻患者，82%的患者- - - - - -99%的对照组(图6 c)．在TRAV12-1中达到了最大频率+CD161+CD8+CD患者的CAIT细胞为18%至77%，健康对照组为0%至5.8% (图6 d)．
粘膜相关不变T (MAIT)和克罗恩相关不变T (CAIT)细胞在TRAV1 - 2中的分布+和TRAV12−1+单元格是单单元数据集。TRAV1-2+和TRAV12-1+中的单细胞数据集中选择单元格图5．(A) MAIT和CAIT细胞在三名CD患者和三名TRAV1-2健康对照样本中的分布+和TRAV12-1+细胞。(B) KLRB1表达水平的分布。在MAIT和CAIT细胞主要定位的同一细胞组中表达较高。(C)表达KLRB1 (CD161蛋白编码)的细胞亚群中MAIT和CAIT细胞的分布。(D) MAIT和CAIT细胞在CD8中的分布+表达KLRB1的细胞子集。
这些GEX数据表明，MAIT克隆型在TRAV1-2的流式细胞术分析中有很强的代表性+CD161+T细胞，CAIT克隆型在一些个体中有很高的频率但在另一些个体中有很低的频率。因此，尽管GEX水平不能直接转化为蛋白质表达水平，但我们有理由假设TRAV12-1+CD161+通过流式细胞术分析的细胞包括CAIT克隆型，但个体之间的高度变异性限制了流式细胞术对其检测的使用。
讨论
通过高通量TCR分析，我们在这里鉴定了一组特定的T细胞，由存在于血液和肠道组织中的半不变TCR α motif定义。CD中CAIT克隆型在血液和肠系膜淋巴结中富集显著，而在肠组织中仅有富集趋势。这些细胞可能被激活进入肠道，然后进入外周循环。它们在外周血中的积累也可能是全身性疾病的标志。我们没有观察到CAIT TCR α基序的发生与临床参数或其他混杂因素之间的相关性。
我们观察到CAIT细胞存在于CD4+和CD8+分数，但通过单细胞GEX进一步表征预先排序的血液记忆CD4+和CD8+T细胞在CD8中表现出较高的富集+分数。单细胞数据也揭示了CAIT细胞的α / β TCR对。观察到与不同的β链配对，优先使用TRBV7-9基因。
CAIT细胞多见于CD8+效应记忆簇，与MAIT和NKT细胞等非传统T细胞表型兼容。先天类细胞标记物如KLRB1(CD161),Slc4a10, cebpd, il18r和KLRD1(CD94)确实在CAIT细胞中高表达。与已知CD患者血液中的MAIT细胞减少相反，我们患者血液中的CAIT克隆型显著增加，这表明CAIT细胞在CD中的作用不同。尽管在某些受试者中CAIT克隆型含量很高，但这些细胞在个体中的比例差异很大。因此，根据我们目前的分析，流式细胞术可捕获T细胞群，即TRAV12-1+CD161+的特异性不足以进一步解剖CAIT克隆型的免疫表型和功能特征。在血液和肠道组织中观察到的流式细胞术检测的差异也可能与TRAV12-1的不同细胞组成有关+CD161+隔室，这需要在未来的研究中进行调查。此外，疾病活动性和疾病位置也可能对观察结果产生影响，因为大多数结肠活检和疾病缓解患者可以进行流式细胞术分析。因此，尽管TCR分析强调了肠道中CAIT克隆型的存在，但进一步的分析不仅根据疾病状况，还根据CD3中CAIT细胞的频率对患者进行了分层+，将有必要澄清这些克隆型在肠组织和IBD中的作用。
最近,阿尔梅达等发表了一项研究，描述了cd1d反应性NKT II型细胞的一个子集。19除了MAIT细胞外，到目前为止，已知只有cd1d反应性iNKT细胞具有有限的TCR α序列。15据描述，NKT II型细胞具有寡克隆序列。15Almeida所描述的细胞确实显示出多克隆TCR库，但优先使用TRAV12-1，TRAJ6基因组合，在CAIT克隆型中观察到相同的结果。人NKT II型细胞的主要GEX标记物为CD161，符合CAIT细胞的表型。15日18此外，其中描述的两个TCR α克隆型符合CAIT CDR3 motif (图1 b)．19 36鉴于这些结果，我们假设CAIT细胞可能对CD1d有反应，因此是NKT II型家族的半不变亚群。事实上，HLA和抗原特异性的鉴定是T细胞特征的重要步骤。在CAIT细胞丰度较高的患者中，我们没有观察到与特定的经典MHC等位基因的相关性，这表明经典MHC限制确实没有驱动这些细胞的扩张。这一假设进一步得到了CAIT细胞在CD4细胞和CD4细胞中的发现这一事实的支持+和CD8+隔间。
阿尔梅达鉴定的细胞等对微生物组产生的小脂类以及五甲基苯并呋喃磺酸盐(PBFs)反应。因此，CAIT细胞可能对微生物组代谢物或小脂质的潜在反应，最近被证明可以调节肠道中的NKT细胞反应。37
本文描述的研究也有局限性，我们想在这里强调一下。在我们的研究中，我们只能控制一些混杂因素，如年龄、性别、疾病活动度、吸烟行为和抗tnf治疗，而其他因素，如药物和病史可能会影响观察到的细胞群。此外，乳糜泻是一种非常异质的疾病，具有很高的个体间变异性，需要比本研究更大的样本量来确定更大的亚组进行分层分析。此外，对照肠道样本仅适用于非炎症性疾病对照组(CRC)，而不适用于健康个体，这是我们研究的另一个局限性。最后，技术限制和个体间的变异性不允许通过流式细胞术有效地捕获CAIT细胞。因此，进一步的研究，包括纵向采样策略，将是必要的，以更好地评估药物的影响，以及从活跃性疾病到疾病缓解的转变，可能对CAIT细胞。
总之，我们描述了在CD患者血液中特异性富集的一种新的半不变的非传统T细胞亚群，证据表明这些细胞是NKT II型细胞。这种富集的后果仍有待澄清，CAIT细胞的免疫表型和抗原反应性需要在未来的研究中进一步阐明。最后，鉴于CAIT细胞的半不变性质，类似于MAIT和iNKT细胞，它们可能在人群水平上在人类中是公共的，因此构成了健康和疾病研究的有趣目标。
材料与方法
研究设计:总结
由于针对肠道抗原的失调T细胞反应被认为是导致CD的原因或驱动因素，我们的目标是通过分析TCR库来识别潜在的与疾病相关的特异性T细胞克隆型。识别疾病相关的TCRs可能会揭示特定的失调T细胞反应，并可能使我们更接近于识别疾病的潜在抗原触发因素。在我们最初的分析中，乳糜泻患者的血液样本是从接受生物制剂治疗的前瞻性乳糜泻患者注册表的可用基线样本中选择的，该注册表是由德国Kiel的IBD“能力网络”于2008年建立的。其他目标包括研究已确定的疾病相关TCRs之间的相关性20 38-42和基因型43以及患者的临床表型。因此，纳入我们初步分析的患者以活动性疾病状态为特征44-47并且在基线取样后6个月对抗tnf治疗有反应或无反应。年龄和性别相匹配的健康对照是从当地的献血者登记册中挑选出来的。UC样本从当地医院收集的患者队列中选取，以验证已确定的cd相关TCRs的疾病特异性。最后，109例CD患者、36例UC患者和99例健康对照纳入分析。由于文库准备、测序失败或未通过质量筛选而被排除的样本未被纳入稿件。分析了第二次收集的样本，以验证第一次收集的结果，并调查肠组织中已确定的克罗恩相关克隆型的存在和丰度。手术标本采集自接受肠道切除的患者(N＝37)。CRC患者纳入疾病对照。值得注意的是，CRC患者使用的肠道组织不是肿瘤组织，而是邻近的宏观健康组织。T细胞亚群从另一亚组患者(N＝21)研究已确定的克隆相关克隆型的起源细胞群。为了详细研究疾病相关细胞的表型以及TCR α / β配对，这些细胞最富集的T细胞群，即CD4+和CD8+记忆细胞，从三名重新接触的CD患者的新鲜采集的血液中进行分类，并进行单细胞TCR-seq和RNA-seq。27 48 49
中描述了详细的方法在线补充材料和方法．
数据可用性声明
如有合理要求，可提供资料。数据可以从第三方获得，但并不公开。大量TCR基因库分析的原始测序数据可在ENA数据库中获得，研究登录号为PRJEB50045。单细胞基因表达和TCR处理数据可在FastGenomics数据库(Seurat_objects_Rosati_TCR_IBD)中获得。原始单单元数据(fastq文件)可根据要求从相应作者处获得。HLA基因数据可根据合理要求从通讯作者处获得。全血TCR收集的元数据可通过Popgen生物库获得。
伦理语句
患者发表同意书
伦理批准
该研究已获得当地伦理委员会(基尔大学)的批准。对于全血采集，伦理投票:A156/03 vs . 29.7.2010, A156/03- 3/15 vs . 21.1.16, A156/03-2/13, A161/08。手术收集:与UKSH的普通和胸外科诊所合作收集样本。道德投票:D553/16。所有研究参与者都签署了书面知情同意书。参与者在参与研究前均知情同意参与研究。
致谢
我们感谢Julia Wilking和Christian Röder在收集手术样本期间的支持，感谢Susanne Nicolaus教授和Julia Kümpers博士在重新联系单细胞实验患者方面的帮助。我们感谢Nicole Bekel、Berith Messner、Tanja Wesse、Sandra Ussat、Wolfgang Albrecht、Nicole Braun、Maria Eloina Figuera Basso、Yewgenia Dolshawskaya、Melanie Vollstedt、Catharina Von der Lancken、Melanie schlapp -kohl、Janina Fuß和Sören Franzenburg在样品制备和测序过程中的技术支持。
参考文献
脚注
IZM, PB和AF是联合资深作者。
推特@elisarosix， @gabyriosmar， @pogorely， @Minervina_Asya， @medinflame， @PhilipCRosensti， @KonradAden， @an_franke
IZM、PB和AF贡献相当。
贡献者AFranke、PB和IZM构思并协调了这项研究。AF为研究担保人。CJ, KA, FT, WL, SSchreiber和BB帮助收集全血样本和患者元数据。MH帮助选择了全血样本。AH, CS, CH和J-HE收集手术样本并提供患者元数据。MD, ER和PB收集并处理手术样本。ER、AFazio、SSS、MAS和AAM分离RNA，制备TCR文库。FD和MWendorff进行HLA归算。ES、GRM和AS对单细胞实验进行流式细胞术和分选。GRM, SSari, PGT, MW, WS和JP在同行修订过程中采集样品并支持分析。 ER performed the data analysis with the help of MVP, AAM, JBG, IZM and PB. GB performed the structural data analysis. ER wrote the first draft of the manuscript with support from PB, GRM, AAM, MVP, MH, PCR, IZM and AFranke. All authors read and approved the final version of the manuscript.
资金这项工作得到了欧盟地平线2020 SYSCID计划的支持，根据拨款协议No . 733100, DFG卓越群EXC306“界面处炎症”和慢性炎症中的精准医学(EXC2167-390884018)， DFG研究培训小组1743 [RTG1743]， RFBR 19-54-12011拨款，俄罗斯联邦科学和高等教育部(075-15-2019-1789)拨款，DFG拨款n. 4096610003，RU5042-miTarget和欧洲克罗恩病和结肠炎组织(ECCO)
相互竞争的利益ER, AF, PB和IZM持有基于本文描述的结果的未决专利申请(EP21217058.3)。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
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