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摘要
客观的溃疡性结肠炎(UC)是一种由黏膜稳态紊乱引起的慢性、衰弱性免疫介导疾病，其表现为肠道效应T细胞过多和粘膜调节性T细胞(treg)扩张不足。我们在此报道一例目前尚无有效治疗方法的难治性UC和相关原发性硬化性胆管炎(PSC)患者成功过继移植自体体外扩增treg。
设计患者接受了一次1×10输注6在过继移植Treg 4周和12周后，评估每公斤体重的自体、体外扩增、多克隆Treg，以及临床、生化、内镜和组织学反应。
结果患者在过继Treg移植后12周出现临床、生化、内窥镜和组织学反应迹象，这与肠道CD3的富集有关+/ FoxP3+和CD3+/ il - 10+T细胞和增加的粘膜转化生长因子β和双调节蛋白水平。此外，随着肝酶的降低，PSC有明显的改善。这种显著的效果持续了4周后，数值又开始上升。
结论这些发现表明，过继Treg治疗可能对难治性UC有效，并可能为PSC的临床试验开辟新的途径。
试用注册号NCT04691232．
- 原发性硬化性胆管炎
- 溃疡性结肠炎
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
实验动物结肠炎模型表明，给药调节性T细胞(treg)可改善结肠炎免疫反应。
新的发现是什么?
多克隆Tregs的过继转移与肠道炎症的改善、肝功能测试和肠道CD3的丰富有关+/ FoxP3+和CD3+/白介素-10+顽固性溃疡性结肠炎(UC)和伴发原发性硬化性胆管炎(PSC)患者中的T细胞。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这项研究加强了共同的肝-肠免疫轴的想法，并支持在难治性UC和伴发PSC中过继转移多克隆Tregs的进一步临床评估。
简介
溃疡性结肠炎(UC)是IBD的主要形式之一，以慢性、复发性肠道炎症为特征。结肠炎是一种全身性疾病，不仅出现在肠道，还出现在肠外器官，包括皮肤、关节、眼睛和肝胆道。肠道效应T细胞过多和粘膜调节性T细胞(treg)扩张不足，是UC的一个标志。1有限数量的局部treg无法控制持续的免疫反应，导致UC中炎症的持续，导致腹泻、直肠出血和腹部绞痛的症状。在这种情况下，treg和treg衍生的细胞因子，如转化生长因子β (TGF-β)和白细胞介素(IL)-10在限制肠道慢性炎症中发挥核心作用。这是基于动物模型，显示小鼠treg中IL-10基因被破坏会发生肠道炎症2IL-10是维持肠道中Treg抑制活性所必需的。3.此外，实验性结肠炎模型的研究表明，给药treg可以改善结肠炎免疫反应，4而过继移植体外TGF-β诱导的Treg细胞可以预防结肠炎的发生，5为UC中的treg细胞治疗提供了科学依据。我们已经开发了一种在良好生产规范(GMP)条件下生产用于临床的自体多克隆Tregs的方案，6这使我们能够启动体外扩增自体treg治疗UC的剂量寻找临床试验。
我们在此报告一例伴有原发性硬化性胆管炎(PSC)的UC患者，他接受了一次自体体外扩增treg。PSC是一种特发性、异质性、胆汁淤积性肝病，以持续性、进行性胆道炎症和纤维化为特征，常与IBD相关。目前尚无有效的药物治疗方法，受影响的患者最终可能发展为需要肝移植的终末期肝病。7据报道，PSC的外周和肝内Treg频率降低，可能通过促进促炎免疫反应参与PSC的免疫发病机制。8在这里，我们进行了独特的观察，过继转移treg在难治性UC伴PSC患者中诱导了反应。
方法
自体体外扩增treg的生成和过继转移
如前所述，在皮肤科的GMP设备中制备了自体多克隆treg。6简而言之，CD25+通过使用CliniMACS设备(Miltenyi Biotec)的自动CliniMACS Enrichment V.3.2程序从初始自体白细胞提取产品中富集细胞，随后在体外培养。促进体外CD25+细胞扩增时，向细胞培养物中添加IL-2 (Proleucin, 1000 IU/mL)、雷帕霉素(Miltenyi Biotec, 100 ng/mL)和抗cd3 /抗cd28膨胀珠(Miltenyi Biotec，细胞与珠比1:4)。细胞培养在37°C, 5% CO下培养2．在体外扩增的第4、7、11和18天，用新鲜IL-2和雷帕霉素替代细胞培养物。在体外扩增的第7、11和18天，将细胞培养物调整至0.5×10的最终浓度6细胞/毫升。在体外扩增的第14天，细胞被收获并耗尽潜在的不需要的CD19+和CD8+使用CliniMACS设备的自动CliniMACS Depletion V.2.1程序检测细胞。在体外扩增的第21天，使用CliniMACS设备的自动CliniMACS Depletion V.2.1程序收集和耗尽细胞中的抗cd3 /抗cd28膨胀珠。计数抗cd3 /抗cd28膨胀珠耗尽细胞，冷冻于45×10的等份中6每瓶细胞置于由人血清白蛋白(医药级)、葡萄糖一水合物40%(医药级)和二甲基亚砜(无菌，无内毒素)组成的冷冻液中。体外扩增的Tregs符合预定义的释放标准，有效地阻止了自体CD8的增殖+体外效应细胞(在线补充表S1)．根据我们目前的临床方案，采用自体体外扩增多克隆treg细胞。9
免疫组化和定量PCR
在基线、第4周和第12周进行柔性乙状结肠镜检查，活检样本取自炎症最严重的区域。石蜡包埋组织脱蜡，用柠檬酸缓冲液进行抗原揭罩。阻断后，用单克隆抗cd3(克隆CD3-12，稀释1:25;Bio-Rad)、多克隆抗foxp3(稀释1:100,Atlas)和多克隆抗il -10(稀释1:40,Abcam)一抗。过夜后，用抗大鼠IgG alexa fluor 488(稀释1:500，室温孵育90 min;生命技术)。FoxP3和IL-10抗体用抗兔IgG生物素(稀释1:800,Sigma)在室温下二次染色30分钟。最后，为了检测FoxP3和IL-10，根据制造商的说明，使用TSA Cyanine 3 Kit(稀释1:100,Akoya)进行最终染色。从每个样本中，每个患者使用×40物镜放大分析4-5个高功率场。
RNA从肠道活检中分离出来，1µg总RNA根据制造商说明书(Bio-Rad)使用iScript cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA。定量表达分析使用QuantiNova SYBR绿色PCR试剂盒，按照厂家说明书(Qiagen)进行，包括TGF-β特异性quantitec引物(Qiagen GeneGlobe ID: QT00000728)、双调节蛋白(AREG) (Qiagen GeneGlobe ID: QT00030772)和管家基因HPRT (Qiagen GeneGlobe ID: QT00059066)。数据归一化为管家基因HPRT。
结果
一例48岁女性并发难治性UC伴PSC。她在18岁时被诊断出患有UC，涉及整个结肠(泛结炎)。之前使用5-氨基水杨酸、皮质类固醇、硫唑嘌呤、抗tnf抗体golimumab、α4β7整合素抗体vedolizumab和IL-12/IL-23抑制剂ustekinumab的治疗没有诱导长期的临床反应，如果使用tnf抑制剂，则由于严重的皮肤过敏反应而过早终止(在线补充表S2)．患者拒绝开始额外的药物治疗(英夫利昔单抗、环孢素和托法替尼)或结肠切除术。她在33岁时发生了相关的大导管PSC, 38岁时进行了肝活检，诊断为界面肝炎，符合纤维化前阶段(2期)发现的低级别慢性PSC。磁共振胰胆管造影示肝内、肝外胆管广泛狭窄，尤其是胆总管近端狭窄，两侧肝主支狭窄，周围肝内胆管扩张加重。此外，血管和胆管稀疏，结构损伤明显。
就诊时，患者报告血性腹泻达7次/天，伴有腹部绞痛和健康状况下降，反映病情严重。内镜检查有明显的炎症征象和黏膜溃疡，Mayo总分为8分。除了美沙拉明4 g/天(30年)和熊去氧胆酸1000 mg/天(16年)的长期治疗外，患者没有服用任何其他药物，最后一次生物制剂治疗在计划Treg转移前12周以上终止。在准备性白细胞电泳和随后的自体多克隆Tregs体外扩增后，患者接受了一次1.0×10输注6treg /kg体重，总计8400万treg。输注前和输注后均未进行条件调节。患者未发生任何治疗医师认为与Treg治疗有关的不良事件，过继Treg移植后伴随药物治疗无变化。之前和伴随的药物以及评估的临床和实验室参数在过继Treg转移之前和之后的表格列表中提供在线补充表3-5,分别。
过继Treg移植后，患者症状逐渐改善，大便次数减少，直肠出血消失，临床疾病活动评分(部分Mayo评分)由移植当天的7分下降至移植后的4分(随访第2周)和2分(随访第8周)。这种临床改善也反映在内镜评估中，因为溃疡已经显著消退。在Treg移植后4周和12周，Mayo内镜评分分别从基线时的3分下降到2分(图1一个)， Mayo总分分别为8分(基线)、6分(随访第4周)和4分(随访第12周)。此外，收养Treg移植后，组织学活动评分(Nancy评分)也从4分(基线)下降到2分(随访第4周)和3分(随访第12周)(图1 b)．这些显著的改善还伴随着粪便钙保护素(fCalprotectin)水平的显著快速降低，在过继Treg转移后2周从基线的5637µg/g降至2326µg/g，并在过继Treg转移后4周和12周持续降低(图1 c)．额外的实验室检测显示，Treg移植后2周和4周，实验室肝功能值显著改善。具体来说，我们注意到血清碱性磷酸酶(ALP)和γ -谷氨酰转移酶(GGT)水平显著下降(图1 d)，以及天冬氨酸氨基转移酶(AST)和谷丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平(图1 e)，在收养Treg移植后2周，ALP水平分别下降了12%和47%，甚至更明显。这种影响是短暂的，在过继Treg移植后12周，数值恢复到基线水平。
过继Treg移植后黏膜溃疡的消退，fCalprotectin水平的降低和PSC的短暂改善。(A)内镜检查显示过继Treg移植后4周和12周黏膜溃疡消退，同时内镜Mayo评分降低。(B)具有代表性的20× H&E染色显示收养Treg移植后4周和12周Nancy评分有所改善。(C)过继Treg转移后fCalprotectin水平降低。(D)过继Treg移植后血清ALP和GGT水平的短暂改善。(E)过继Treg移植后血清AST和ALT水平的短暂改善。碱性磷酸酶;谷丙转氨酶;天冬氨酸氨基转移酶;fCalprotectin，粪便钙保护素; GGT, gamma-glutamyl transferase; Treg, regulatory T cell.
一致的Treg转移相关的UC改善使我们假设注入的Treg可能已经迁移到肠道。我们对基线、过继Treg移植后4周和12周取自同一粘膜区域的活检组织进行免疫组化，并对Treg特异性FoxP3和IL-10的表达进行染色。在过继Treg移植4周和12周后，染色显示肠道相关表达foxp3和表达il -10的T细胞随之增加，反映Treg (图2)．此外，通过定量PCR，我们检测到TGF-β mRNA的表达增加了1.75倍(在线补充图1A)和AREG表达增加5.39倍(在线补充图1B)在收养Treg移植后的4周内。
CD3的富集+FoxP3+和CD3+il - 10+肠道内的细胞群。(A)免疫组化染色图像显示CD3富集+FoxP3+细胞和CD3+il - 10+过继Treg移植后4周和12周细胞。样品分析使用×40物镜放大。绿色细胞代表CD3+T细胞，红细胞是Foxp3+或il - 10+细胞，如所示。(B) CD3的定量+FoxP3+(C) CD3+il - 10+细胞与总CD3的关系+过继Treg移植后4周和12周细胞。IL,白介素;Treg，调节性T细胞。
讨论
我们的研究结果表明，过继移植自体体外扩增多克隆Tregs可诱导难治性UC的临床、生化、内窥镜和组织学反应。黏膜调节FoxP3的增加+IL-10相应上调的T细胞与转移的treg转移到炎症结肠并改善局部疾病活性的概念一致。到目前为止，在IBD中只进行了一项研究，研究了卵清蛋白特异性Tregs对克罗恩病的疗效。10在过继Treg移植后5周和8周使用克罗恩病活动指数的患者中有40%(8/20)注意到临床反应。本研究未评估内镜反应，fCalprotectin水平在整个研究人群中呈小幅下降趋势。
该患者病理性肝脏值的显著改善表明Treg治疗也可能诱导相关PSC的生化反应。PSC是一种免疫介导的慢性肝病，其特征是炎症、纤维化和肝内外胆管的进行性破坏，导致肝硬化和终末期肝病的发生。患胆管癌的风险也会增加，终生风险高达20%。目前，还没有批准的PSC药物疗法，而肝移植是唯一可用的治疗选择，以改善临床结果。IBD，主要是UC，与PSC密切相关，因为它存在于高达62%-83%的PSC患者中。PSC与UC的密切关联意味着存在一个共同的肝-肠免疫轴，驱动这些免疫介导的疾病。T细胞在UC和PSC的发病机制中都起着关键作用，因为肠道归巢粘膜记忆淋巴细胞的异常迁移与疾病的发病机制密切相关。在肠道相关淋巴组织中的树突状细胞进行抗原识别后，naïve T细胞被肠道特异性趋化因子受体CCR9和整合素α4β7印迹。这些启动的T细胞被认为是通过其相关配体、粘膜血管地址细胞粘附分子(MAdCAM)-1和趋化蛋白CCL25在PSC门静脉周围内皮细胞中的异常表达迁移到肝脏的。这与α4β7的含量有关+CCR9+效应T细胞，约占PSC患者肝浸润淋巴细胞的20%。11此外，CCL28不仅在门脉内皮中上调，而且在炎症的结肠中也上调，引发α4的阻滞+β7+淋巴细胞。12胆管细胞表达血管细胞粘附蛋白(VCAM)-1进一步促进肝内表达α4β7的T淋巴细胞的存活，使PSC中持续的肝脏炎症持续下去。13这些结果表明α4β7+CCR9+UC中来自发炎肠道的效应T细胞回到肝脏，使免疫介导的肝脏炎症永久化。T细胞运输驱动PSC的机制由TCRβ库的测序数据加强，其中在PSC/IBD患者的配对肠道和肝脏样本中检测到共同克隆来源的记忆T细胞，这表明由共享抗原驱动的记忆T细胞存在于PSC/IBD患者的肠道和肝脏中14．然而，肠源性T细胞的异常肝脏募集并不局限于PSC，似乎也是其他慢性肝病的普遍特征，因为这可能表明，MAdCAM-1、CCL25的异常肝脏表达以及随后α4β7和CCR9表达T细胞浸润到肝脏是慢性肝病的共同特征。15这些发现表明淋巴细胞转运的改变不能被认为是PSC发展的唯一原因。此外，最近的一项试验没有发现PSC/IBD患者应用α4β7-整合素抗体vedolizumab的生化反应，但该抗体在控制治疗患者的肠道炎症方面表现出良好的效果。16这表明粘膜效应T细胞向肝脏的运输并不严重依赖于α4β7。重要的是，有报道称外周和肝内Treg频率受损与PSC有关，这为该疾病中Treg细胞的转移提供了合理的治疗概念。具体而言，与健康受试者和原发性胆道胆管炎(PBC)患者相比，PSC患者血液中外周Treg频率显著降低。8此外，肝内FOXP3+与诊断时的PBC患者相比，PSC患者的细胞数量显著减少，甚至可能存在PSC患者血液treg功能受损的情况，因为与健康受试者相比，它们含有明显较少的IL-10。8
在这里，在过继Treg转移后第4周，观察到血清ALP水平降低了55%，这与观察到的ALP降低是由Treg转移诱导的生物学效应的观点是一致的，因为PSC的自然史通常与ALP水平随着时间的推移稳定或增加有关。这种缺乏自然疾病改善最近在一项临床试验中得到证实，该试验调查了24-去甲熊去氧胆酸(norUDCA)在PSC患者中的作用，表明接受安慰剂的患者在12周内平均增加了1.2%的ALP。17Treg诱导的UC效应是持久的，而Treg诱导的PSC效应是短暂的，这一观察结果很有趣，这表明重复的过过性Treg转移可能是诱导PSC长期缓解的必要条件。对治疗的时间限制效应和无反应可能是由转移treg的生存能力降低所解释的。一项I期研究调查了非放射性标记的treg在1型糖尿病患者中的应用，该研究报告称，在90天后，只有25%的转移细胞被保留，尽管在1年内仍然可以检测到小信号，这表明一小部分转移的treg能够长期存活。18需要对标记的Treg细胞进行进一步研究，以确定它们在相关组织中的持久性。更多的研究也应该排除treg随时间的潜在表型和功能损失，这也可能有助于过继移植后的短暂临床疗效。
本报告的局限性在于仅为一例病例，需要更大规模的研究来证实自体Treg移植在UC和PSC患者中的有效性和安全性。此外，这项研究没有涉及Treg转移在维持治疗反应方面的疗效。然而，由于早期缓解是UC长期预后的最佳预测因子，记录疗效可能是Treg转移对长期疾病控制潜力的重要信号。需要进一步的重复Treg转移试验来证实。此外，Treg转移后肠粘膜Treg细胞的增加并不一定证明转移细胞迁移到肠道，而可能是由于组织中的局部Treg扩张。因此，验证转移T细胞的肠道归巢是未来UC中Treg转移研究的一个重要点，这可以通过给药标记的Treg细胞来解决。
据我们所知，这是第一篇显示单次输注自体体外扩增多克隆Tregs后UC和相关PSC改善的报道。我们的数据显示，Treg治疗可能在UC中诱导临床、生化、内镜和组织学反应，在PSC中诱导显著的生化反应。鉴于Treg在多种免疫介导疾病中的作用，过继移植自体体外扩增Treg细胞可能在与效应子和Treg亚群之间失衡相关的慢性炎症性疾病中具有广泛的治疗应用。
数据可用性声明
所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。不适用。
伦理语句
患者发表同意书
伦理批准
这项研究涉及人类参与者，并得到了弗里德里希-亚历山大大学伦理委员会的批准Erlangen-Nürnberg(编号417_19 Az)。受试者在纳入试验前给予书面知情同意参与研究。
参考文献
补充材料
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补充数据
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脚注
RA和MFN是联合资深作者。
贡献者CV、DS、MR、MW、MK和BS-T生产并发布临床试验药品。Fv, sz, mg, hk, jw;TR, AH, ES, BS和HH收集并分析数据。CV, RA, GS和MFN参与了研究项目的开发和概念设计。CV、RA和MFN启动了临床试验。CV和RA在MFN的帮助下起草了手稿。所有作者都批判性地修改了手稿。CV为本次稿件的整体内容担保人。
资金本研究由德国研究基金会(DFG)资助，由Caroline Voskens和Markus Neurath (SFB/TransRegio 241项目C04)资助。
相互竞争的利益GS是与手稿(出版号EP 1379625，人体血液中的CD4+CD25+调节性T细胞)相关的已获授权专利的发明人。
患者和公众参与患者和/或公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
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