条文本
PDF
摘要
客观的腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是一种有缺陷的单链DNA病毒，在人群中流行(35%-80%)。复发性克隆AAV2插入与发生在正常肝脏上的罕见人肝细胞癌(HCC)的发病机制有关。本研究旨在描述肝脏中AAV感染的自然史及其在肿瘤发展中的后果。
设计在1461名患者的肿瘤和非肿瘤肝组织中定量检测了病毒DNA。采用基于DNAse/ taqman的检测方法和定量RT-PCR方法分析episomal的存在和病毒mRNA的表达。在硅分析中，利用病毒捕获数据探索病毒变异和新的克隆插入。
结果在21%的患者中检测到AAV DNA，包括8%的肿瘤组织，平均分布在两种主要病毒亚型中:一种类似于AAV2，另一种是AAV2和AAV13序列的杂交。在4%的非肿瘤组织中发现了Episomal病毒形式，通常与病毒RNA表达和人类疱疹病毒6型(候选天然AAV辅助病毒)相关。在30例HCC中，克隆性AAV插入在CCNA2，CCNE1，叔，TNFSF10，KMT2B而且GLI1/INHBE．AAV插入通过多种机制触发致癌过表达，这些机制根据整合位点的定位而不同。
结论我们对肝脏野生型AAV感染进行了综合分析，包括病毒基因型、分子形态、辅助病毒关系和病毒整合。在非肝硬化肝细胞癌发展过程中，克隆性AAV插入被选择为阳性，这挑战了AAV作为非致病性病毒的概念。
- 肝细胞癌
- 致癌基因
- 致癌作用
- 肝
- 慢性病毒性肝炎
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)在一般人群中的血清流行率为40% ~ 80%，其中AAV2型是人类最常见的血清型。
AAV具有潜伏期和溶解期两阶段的生命周期。
辅助病毒的存在是AAV复制所必需的。
人们普遍认为腺病毒是天然的AAV辅助病毒。
虽然AAV被认为是一种非致病性病毒，但反复的克隆性AAV2插入与肝细胞癌(HCC)的发展有关。
新的发现是什么?
21%的肝组织中存在两种病毒亚型:AAV2和AAV2/13杂交序列。
在4%的非肿瘤肝组织中发现Episomal AAV形式，主要是在没有肝纤维化的年轻女性患者中。
人类疱疹病毒6型是肝脏中最常见的AAV辅助病毒。
2%的HCC患者在癌症驱动基因中显示出AAV克隆整合。
AAV克隆插入在HCC中通过多种机制激活癌基因。
本研究的意义
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这些发现对于了解野生型AAV生物学及其与肝癌发生的关系非常重要。
考虑到AAV载体在肝脏靶向基因治疗中的大量使用，我们的数据尤其相关。
即使罕见，AAV插入突变是HCC发展的一个新的危险因素，因此AAV作为非致病性病毒的概念应该重新审视。
简介
腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是一种小的非包膜DNA病毒，具有二十面体衣壳，包含4.7 kb线性单链基因组。1 2AAV基因组编码非结构蛋白(Rep78、68、52和40)、衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)和组装激活蛋白(AAP)。3 4在末端，逆串联重复序列(inverse tandem repeats, ITR)在宿主基因组的整合中起着重要作用。5个6AAV是一种有缺陷的病毒，主动感染需要辅助病毒，否则它可以通过整合到宿主基因组或维持为环状集体形式来建立潜伏感染。7号到9号AAV血清流行率显示，该感染在人群中流行(30%-80%)，始于儿童时期。10 - 12目前已鉴定出12种不同的血清型和100多种自然变异，其中AAV2是人类最常见的类型。13 - 16
这种小病毒缺乏可识别的相关疾病，重组AAV (rAAV)载体具有高效、长期转基因表达、低免疫原性和特异性组织趋向性的转导分裂和非分裂细胞的显著能力，因此对基因治疗具有吸引力。17虽然AAV在1965年被发现，但关于人类感染AAV的自然史的许多问题仍然没有答案。2众所周知，载体主要以集体形式存在于细胞核中，RNA持续表达，这对野生型感染中假定的集体AAV形式提出了疑问。8已经鉴定出几种辅助病毒，但它们与野生型肝脏AAV感染的确切关联尚不清楚。不同AAV基因型在人群中的频率和首次感染后AAV在组织中的持久性仍有待确定。18此外，AAV与肿瘤发展的关系存在争议，一些研究报告了AAV感染在动物模型中的致癌作用，另一些研究表明AAV感染具有抑制肿瘤的作用。19到24
最近，我们报道了AAV2参与在正常肝脏上发生的人肝细胞癌(HCC)的发病机制，这些HCC没有典型的HCC危险因素，如HBV和HCV感染、高酒精摄入量、血色症或黄曲霉毒素B1暴露。25与HBV相似，在叔，CCNE1而且CCNA2癌症驱动基因，导致它们的过度表达。25 - 28AAV插入可以通过最近在与病毒3'ITR相邻的最小共同AAV插入序列中确定的肝脏启动子激活位于人类基因组附近的癌基因。29
在这项工作中，我们在1461例良性或恶性肝脏肿瘤患者中调查了肝脏中野生型AAV感染的自然史及其在肿瘤发展中的后果。
材料与方法
患者和组织样本
1461例患者被纳入我们当地机构审查委员会(IRB)委员会批准的研究(CCPRB Paris Saint-Louis, 1997和2004;波尔多2010-A00498-31，法兰西岛VII:项目C0-15-003和PP 16-001)。法国医院在手术后立即冷冻肝组织。对1269例患者的肿瘤组织和非肿瘤组织进行了分析，分别对138例和54例患者的肿瘤组织和非肿瘤组织进行了研究。目前的系列包括HCC (n=936)，肝细胞腺瘤(HCA, n=225)，局灶性结节增生(FNH, n=97)，肝母细胞瘤或移行肿瘤(n=87)，胆管癌(n=46)，纤维层癌(n=36)和其他肿瘤(n=34，在线补充表1)．
病毒DNA筛选
在Fluidigm 96.96动态阵列上使用BioMark Real-Time PCR系统，使用Primer3Plus软件设计的TaqMan探针组，通过定量RT-PCR (qRT-PCR)分析基因组DNA是否存在病毒DNA补充图1A及表2)．使用Fluidigm Real-Time PCR分析软件(V.4.1.3)对结果进行分析，并报告给一个内参基因HMBS。定量表达为病毒拷贝数/细胞。的normalmixEM函数测试拷贝数/细胞值的单峰和双峰分布mixtoolsR包装。30.
利用病毒捕获测序分离人AAV
对肿瘤和匹配的正常样本进行基因组DNA的病毒捕获，序列如前所述，使用120 mer引物识别所有AAV基因型1-13，已经用大约305个探针/基因型描述。25使用Burrows-Wheeler Aligner (V.0.7.15)将病毒reads映射到所有AAV1到AAV13参考序列。31AAV读取数与病毒拷贝数/细胞相关(在线补充图1B)．使用samtools (V.1.3)提取病毒上至少有一个读取对齐的读对，32并与包括人类染色体和病毒序列在内的自定义参考基因组对齐。我们通过为hg19基因组生成一个20k-bin大小的床来计算每个样本中AAV/人类嵌合和配偶区域的reads数量，并使用bedtools multicov实用程序进行计算。33对于每个箱子，我们计算了在泛基因组图中显示的样本覆盖率的平均值。我们使用嵌合读取通过在连接两侧映射序列来识别基分辨率的插入断点。克隆事件被认为是当>25个读段重叠在同一位点时，当4-24个读段重叠时被认为是亚克隆插入。所有的病毒插入都通过整合基因组Viewer的视觉检查进行验证。序列已存入Genbank数据库MK231253来MK231264而且KT258720来KT258730．
网上详细介绍了人- aav全长序列的分析补充材料和方法。序列已存入Genbank数据库MK139243来MK139299而且MK163929来MK163942．
RNAseq
poly(A)+ RNA富集的样品使用Illumina TruSeq链mRNA试剂盒在HiSeq2000测序仪上测序，得到大约4500万个100碱基对(bp)配对的末端reads (IntegraGen, Evry)。34对Reads进行比对，用TopHat2重建嵌合序列35V.2.2.1袖扣。36我们使用了ElemeNT37预测转录起始位点(TSS)， Alamut Visual软件(交互式生物软件)识别嵌合DNA序列上的剪接信号，ATGpr38识别翻译起始位点和Poly(A) Signal Miner识别PolyA位点。39序列存入EGA数据库(EGAS00001002879、EGAS00001001284和EGAS00001003310)。
病毒片段形式的检测
基于DNAse/ taqman的特异性检测方法改编自Werle-Lapostolle的方案等40检测AAV发作形式(详细程序在网上补充材料和方法)。使用围绕ITRs的两对引物扩增圆形AAV的连接(在线补充表2)加入2.5%的甘油和5%的二甲基亚砜。PCR产物经ExoSAP-IT (Applied Biosystem)纯化后用Sanger进行测序。41
定量rt - pcr
采用qRT-PCR方法分析AAV mRNA和插入靶基因的表达。具体来说，我们使用了七个AAV定制和人类目录TaqMan探针(在线补充表2)采用AB7900HT PCR系统(Applied Biosystem)和BioMark实时PCR系统。表达式数据用2−ΔCt方法相对于核糖体18S (Hs03928990_g1)。5个正常组织作为参考。
定点诱变
病毒polyA信号在AAV诱导的基因过表达中的作用被研究在含有AAV插入的两个质粒的3'UTRTNFSF10。25使用QuikChange Lightning位点定向突变试剂盒(Agilent)在病毒polyA信号中引入四个点突变(NC_001401: 4424 A>C, 4426 T>G, 4427 A>C, 4429 A>C)。所有突变均采用Sanger测序进行验证。
细胞培养，转染和双荧光素酶检测
HuH7、HepG2和HuH6细胞购自ATCC，在添加10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素的Dulbecco 's Modified Eagle培养基中培养。检测细胞支原体污染。外显子组测序验证身份。细胞用Lipofectamine 3000 (Life Technologies)转染含野生型pmirGLO质粒(Promega)TNFSF103'UTR，即带有AAV2插入的3'UTR或被打乱的AAV2序列在荧光素酶报告基因下游。萤火虫荧光素酶的发光在相应的肾肾荧光素酶活性上正常化。计算相对于野生型的折叠变化TNFSF103 'utr构造。
统计分析
使用RStudio (V.1.0.136)和GraphPad Prism (V.6.0a)进行统计分析。AAV与患者临床、组织学特征的关系通过Χ进行调查2测试。计算了2000个排列的蒙特卡洛检验的P值调整。定量变量采用Wilcoxon秩和检验进行统计学检验。变量间的关联采用多项逻辑回归模型。用Student 's t检验比较转染细胞与对照细胞的荧光素酶活性。所有检验均为双侧检验，p值<0.05为有统计学意义。
结果
肝脏中两种主要AAV基因型的鉴定
用6个Taqman探针对1319名患者的冷冻肝组织进行筛查，这些探针分布在基因组上，共同识别所有AAV基因型1-13，在18% (n=233)的非肿瘤肝组织中鉴定出AAV DNA(在线)补充图1)．为了捕获所有已知基因型1-13的AAV病毒DNA，我们选择了80个非肿瘤肝脏样本，包括68个阳性样本，范围从2×104到0.18拷贝数/cell。测序后，在57个样本中重建了AAV全长序列，并鉴定出两种主要的AAV亚型(图1 a - b)．第一个亚型(n=25)与AAV2参考序列(NC_001401)和人分离的VP1分支B基因型高度相似14 42(在线补充表2)．第二种亚型(n=32)显示了包括AAV13衣壳不同部分的杂交序列(类似于分支C)14 42和c-ter在AAV2 5 '部件的背景下，它被命名为AAV2/13 (图1 b和在线补充图2)．我们沿着病毒基因组确定了42种AAV亚型共享的沉默变异，但不同于AAV2参考NC_001401 (图1 c)．相比之下，AAV2/13序列中导致氨基酸取代的几个核苷酸变体位于高变区(HVRs) 5,6,7和10，起源于AAV13序列(图1 c)．使用两种特异于AAV2/13亚型并位于CAP2区域的探针筛选1319个样本的整体系列(在线补充图1)， 143份样本中AAV2基因型和AAV2/13基因型的阳性率分别为47.6%和52.4%。
57例人肝组织腺相关病毒(AAV)全长序列。(A) AAV基因组示意图(参考文献NC_001401)，包括编码复制蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)、结构蛋白(VP1、VP2和VP3)和组装激活蛋白(AAP)的两个开放阅读框的位置。反向末端重复(ITR)表示在5 '和3 '端。启动子(p5, p19和p40)用箭头表示。(B)从人肝组织中分离出的57个全长AAV (ID编号为#)的核苷酸序列(4679 bp)与上方参考序列AAV2 (NC_001401，白色)、AAV3 (NC_001729.1)和AAV13 (EU285562.1)进行了ClustalW算法多对齐。两种不同的病毒基因型，AAV2和AAV2/13被鉴定。色条表示与AAV2参考基因组相似(绿色)或与AAV3和/或AAV13基因组相似(灰色)，与NC_001401相似(白色)。与AAV2参考相比，触发器ITR配置的变化以浅灰色标记。Logan描述的肝脏特异性增强子启动子元件(LSP)等是表示。29(C)与AAV2参考对照的氨基酸变化。三角形表示57个人类肝脏AAV分离株中特定AAV2/13(上)或AAV2(中)变体的基因组位置。下图显示了两种基因型共有的常见变异。灰色和黑色分别指无声和误感AAV变体;数字对应野生型AAV2核苷酸序列坐标(NC_001401)。
AAV感染和发病形式
在233个AAV阳性肝脏样本中，病毒DNA的定量显示出双峰分布:97%的组织表现出低数量的拷贝/细胞(范围从4.6×105- 0.04)，只有8例患者的AAV数量高于0.07 - 0.18拷贝/细胞(图2一个)．AAV在女性(p<0.001)和年轻患者(p=0.016)中显著富集，在非纤维化肝背景下更频繁发生(p<0.001;图2 b)．
腺相关病毒(AAV) DNA在非肿瘤组织和病毒插曲形式。(A) 233个样本的拷贝数/细胞分布。密度线分别用蓝色和红色定义低阳性组和高阳性组。(B)根据性别、年龄和Metavir纤维化评分对AAV阳性和阴性患者进行权变分析。显示aav阳性患者的频率(χ²蒙特卡罗模拟检验和Metavir评分比例趋势χ²检验)。(C)根据REP和CAP病毒转录本，偶集性和非偶集性AAV患者的RNA表达频率(χ²检验，蒙特卡罗模拟)。(D)病毒拷贝数/细胞(日志)10)在aav阳性样本中，根据片段状态和片段的转录活性(Wilcoxon秩和检验)进行检测。(E)根据患者年龄不同的病毒分子形式分布。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。
在64/233(27.5%)的AAV阳性组织中，所有的AAV基因组区域都被扩增，这表明整个病毒基因组的存在。我们设计了基于DNAse/ taqman的检测方法(在线补充图3A)，可在60例患者中检测到episomal AAV，对应于26%的AAV阳性样本和4.6%的所有患者。利用AAV捕获测序的计算机分析，在57例具有完整重建的AAV基因组序列的病例中，我们确定了14例具有3'ITR-5'ITR连接。圆形的串联结构可能会从我们的实验方法中逃脱出来，43然而，我们没有发现在硅片中插入串联体。3'ITR-5'ITR连接显示多种双d ITR结构序列，有翻转或翻转配置，Sanger测序证实缺失125 bp(在线)补充图3C-D和4)．
AAV的转录与片段形式有关
然后，我们用qRT-PCR方法在101个AAV阳性的非肿瘤肝组织中筛选AAV RNA的表达。在64%的被测肝组织中鉴定出AAV转录本。AAV REP或CAP的表达在伴有附带体形式的肝组织中富集(p<0.001)，并且这两种转录本在附带体形式的AAV中比非附带体形式的AAV更频繁地相关(p=0.022)，确定了“附带体表达AAV”的患者群体(图2 c)．在episomal-表达AAV的肝组织中，每个细胞的AAV拷贝数较高，这支持了这些肝脏样本中病毒活性感染的假设(图2 d)．Episomal AAV在女性患者(p<0.001)和无肝硬化患者(p<0.001;在线补充图5A)．AAV阳性的年龄函数分析显示，在30-40岁年龄组出现频率最高，为25%。AAV发作形式在年轻患者(年龄<40岁)中更为常见，在20多岁时达到最高频率(图2 e和在线补充图5B)．这些结果表明，AAV活动性感染在生命的第二和第三个十年更为频繁，而非活动性的非发作型在原发感染后仍然存在。
与AAV辅助病毒合并感染
由于AAV是一种缺陷病毒，我们通过qRT-PCR对整个1319个肝脏组织进行人类腺病毒(AdV类型a - f)、人类疱疹病毒(HHV类型1、2、4、5、6、7和8)和人类乳头瘤病毒16型(HPV16)的筛查，寻找潜在的AAV辅助病毒的存在。43%的患者(n=570)中至少检测到其中一种病毒，39%的患者(n=520)中每个患者仅检测到一种病毒。HHV6最常见(39%)，其次是HHV4 (eb病毒，6%)，而HHV7和腺病毒则很少被检测到(分别为2%和0.5%)。图3一)．在我们队列的肝组织中未发现HPV16和HHV 1型(HSV1)， 2型(HSV2)， 5型(CMV)和8型(KSHV)。HHV6是aav阳性患者中唯一富集的辅助病毒(37.3% vs 44.8%， p=0.039)，特别是在发作型或表达型患者中富集(分别为52.5%和67.9%，p<0.001;图3 b)．
根据腺相关病毒(AAV)状态的辅助病毒。(A)辅助病毒在非肿瘤组织中感染和合并感染的频率(n=1319)。(B)根据人疱疹病毒(HHV)6、eb病毒(EBV)、HHV7和人腺病毒(AdV)感染的全球频率(χ²比例趋势检验)。(C)全局AAV阳性的多变量分析(左)，包括单变量分析(逻辑回归)中与AAV存在密切相关的变量。同样的分析也进行了集体AAV(中)和集体和表达形式(右)的存在。* * * * P < 0.05, P < 0.001。Ns，不显著。
为了在整个队列患者中确定与AAV感染相关的独立特征，我们进行了多变量分析(图3 c)．女性(OR=1.83, p<0.001)、年龄(OR=1.42, p=0.044)、非肝硬化(OR=1.96, p<0.001)和合并HHV6 (OR=1.15, p=0.031)与AAV阳性独立相关。3个因素也与episomal和表达AAV的存在显著相关:女性(OR=4.71, p=0.013)、非纤维化肝(OR=12.13, p=0.018)和合并HHV6 (OR=1.61, p=0.01)。
肿瘤组织中的AAV
与非肿瘤肝组织(n= 233,18%)相比，肿瘤组织中AAV DNA阳性的频率较低(n= 109,8%)，只有4.7%的患者在肿瘤和非肿瘤肝组织中都出现AAV (图4一)．109例阳性肿瘤中有20例AAV拷贝数较高，在0.07 ~ 6.08之间。考虑到正常细胞的潜在污染和肿瘤肝细胞的倍性，这个值可能被低估了。绝大多数(n= 83,76%)只有一个或两个扩增病毒区域，病毒的3'ITR区域富集(在线)补充图6A-B)．在恶性肿瘤和良性肿瘤中检测到AAV的频率相似，但在恶性肿瘤中对应于克隆AAV插入事件的拷贝数更高(图4 c；在线补充表3)．相反，在除局灶性结节增生(FNH)外的所有良性肿瘤患者中，AAV在非肿瘤对应物中的阳性程度高于相应肿瘤(图4 c)．最后，在肿瘤中很少发现病毒片段形式(n=8, 0.6%)，大多数在良性肿瘤中(4例HCA和2例FNH)，只有2例HCC (补充图3C-D和4)．
肿瘤组织和非肿瘤肝脏组织中的腺相关病毒(AAV)。(A)副本编号/单元格(日志10)的配对肿瘤(T)和非肿瘤(NT)组织的每个患者(n=1269)。实线和虚线分别定义了阳性的阈值以及病毒拷贝/细胞数量的高低界限。AAV患者在肿瘤和非肿瘤对应物中或仅在其中一种中出现的频率是指示的。(B)恶性肿瘤和良性肿瘤患者肿瘤组织和非肿瘤组织中AAV的频率(χ²蒙特卡罗模拟和Cochran-Mantel-Haenszel性别调整)。(C) 270例AAV阳性患者分为恶性肿瘤患者和良性肿瘤患者，配对肿瘤组织和非肿瘤组织的AAV拷贝数/细胞。三角形表示有克隆AAV插入的肿瘤(Wilcoxon秩和检验)。(D)肿瘤(上)和非肿瘤(下)样本中人/病毒匹配嵌合物和配偶reads基因组位置的泛基因组视图。一行对应一个20k-bin区域，颜色表示每个bin的平均读取数。考虑到94个肿瘤和82个用病毒捕获deepseq研究的非肿瘤，线的高度对应于一系列样本中reads存在的频率。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。 ns, not significant.
AAV在肝组织的插入
我们在6个hcc中鉴定了7个新的克隆插入GLI1/INHBE, (图5 a - b）叔（图5 c),CCNA2（图5 d)．在良性局灶性结节增生中只发现了一个克隆插入，它发生在10号染色体的基因间区(图5克)而不会影响最近基因的表达(图4D及5)．结合在TCGA和ICGC测序的HCC中发现的AAV插入44 45之前在我们队列中描述过的病例，25 34我们重新分析了肝脏肿瘤中总共30个独立的AAV插入(在线)补充表4)．病毒插入发生在两个方向，AAV2和AAV2/13亚型的比例相同(分别为55%和45%的可解释病例)，在30个插入病例中有25个确定了通常插入的最小AAV区域(核苷酸4390-4570)。
腺相关病毒(AAV)克隆整合位点和转录本在肿瘤中的作用。基因结构用框表示外显子，线表示内含子区域。转录起始位点的位置显示在基因的5 '。红色箭头表示我们系列肿瘤中的病毒插入位点，绿色箭头表示TCGA和ICGC肿瘤中的病毒插入位点。星号表示新插入的大小写。顶部线条为插入的AAV病毒区域，箭头指向5 ' >3 '序列方向。表示翻转或翻转3'ITR。观察到的转录本表示在基因结构的底部，融合病毒序列为红色。WT，野生型。
6个癌基因被AAV反复激活(在线补充图7)．插入的GLI1/INHBE(4个腺瘤转化为HCC，图5 a - b)，叔(两个肝细胞癌,图5 c)，CCNE1(七肝癌,图5 e)，TNFSF10(两个肝细胞癌,图5 f),KMT2B(两个肝细胞癌,图5 h)在几乎所有病例中，通过启动子和/或增强子顺式机制导致这些致癌基因全长编码区过表达(图5)．CCNA29例HCC被插入;除了一个插入之外，所有插入都集中在一起CCNA2内含子2，它们导致异常的AAV-CCNA2转录，导致稳定的致癌截断蛋白缺乏n端调控域(图5 d)．34的3'UTRTNFSF10在两例HCC中显示AAV插入诱导TNFSF10过表达，转录本在病毒多聚腺苷酸化时过早结束(图5 f)．在这里，我们使用这两种插入的位点定向诱变，证明了病毒polyA信号是确保在三种不同的测试细胞系中强荧光素酶过表达所必需的补充图8)．
在非肿瘤肝组织中，未发现AAV克隆插入;与肿瘤样本相比，非克隆插入与episomal AAV的存在显著相关(p<0.001)。在非肿瘤组织和肿瘤组织中，非克隆AAV插入沿基因组随机分布(图4 d和在线补充图9)．先前在细胞系中描述的AAV主要靶点未发现特异性富集。46个47
AAV特征与肿瘤异质性
我们通过分析186例患者的多结节(n=475)的病毒DNA、克隆插入和片段形式来探索肿瘤间异质性。其中，在25名患者中检测到AAV DNA补充图6C)，包括4例在至少一个结节中插入克隆性AAV的患者。2例HCC患者在所有结节中均显示AAV克隆整合。得益于下一代测序(NGS)数据，我们能够通过观察每个结节中常见和私有的体细胞突变和拷贝数改变(CNA)来预测这些肿瘤的进化。有趣的是，来自2557号病人的两个肿瘤显示了相同的病毒插入TNFSF10，相似的基因突变和CNA谱，表明AAV插入是发生在肝内转移之前的卡车改变(图6)．相反，1919号患者的三个肿瘤，由癌中腺瘤的恶性转化引起，有三种不同的克隆插入，都是靶向的GLI1，基因突变谱不同且无CNA，提示3个结节起源独立(图6 b)．
多发性结节和克隆性腺相关病毒(AAV)插入患者的肿瘤发展。肿瘤之间的关系是根据每个结节的基因突变谱和拷贝数改变(CNA)来确定的。共享和私有变更的数量显示在每个分支的上面。主要改变氨基酸的后果列出;驱动基因和主要cna的突变为粗体。AAV的状态，诊断和基因组信息的来源(WGS, WES)为每个结节指定。分支的粗细表示改变的次数。右侧为每个患者的结节位置。(A) 2557号患者的两个肝细胞癌(HCC)结节显示相同的AAV插入TNFSF10它们共有199个体细胞突变和几个CNAs。这表明结节起源于同一原发肿瘤。(B) 1919号患者的三个结节在突变谱和AAV插入方面是不同的，这表明肿瘤的起源是独立的。NT, non-tumour。
讨论
在本研究中，我们对肝脏中不同的AAV病毒形式及其致癌后果进行了大规模的全面描述，有助于更好地了解人类AAV感染的自然史。
在21%的非肿瘤和/或肿瘤肝脏患者中观察到AAV的流行，与30%-80%的普通人群中确定的抗AAV抗体的血清流行率一致。10 - 12 48我们的结果显示，五分之一的患者在一生中肝脏中表现出持久的AAV DNA，主要是在没有肝纤维化的年轻和女性患者人群中(图7)．然而，由于我们的大多数肝组织样本来自肝病患者，因此AAV DNA在健康个体肝脏中的确切流行率仍有待评估。
在我们的队列中，只有两种AAV基因型，即AAV2和AAV2/13杂交基因型，在患者中平均分布。AAV2/13序列为5 '部分AAV2与3 '部分AAV13的杂交，对应VP1分类的前分支C。14由于只有一个来自进化支C的全长AAV序列是公开的，42我们的工作显著增加了人类AAV全长序列的数量，揭示了与肝脏中有效的自然AAV感染相关的基因组变异。与之前的血清学分析相比，10 11 49我们没有在肝脏中发现其他AAV基因型，即使AAV5和AAV8经常出现在循环单核细胞中。48
在4.6%的患者的非肿瘤组织中鉴定出AAV的片段形式，占所有AAV阳性肝脏样本的26%，而片段AAV以前只在人类扁桃体和腺样体中描述过。9它经常与病毒mRNA表达相关，这表明episomal AAV在肝脏中很大一部分人群中也具有转录活性(图7)．一些病毒50 51都能支持AAV的体外复制，腺病毒是AAV的天然助手是公认的。在这里，我们确定HHV6是最常与肝脏中episomal和转录AAV相关的病毒。健康献血者也曾出现过这种情况48HHV6能够感染肝细胞。52-54在episoman表达AAV形式的患者中HHV6频率的增加可能表明2.1%的患者肝脏中存在持续的活动性感染。相反，只有非常罕见的患者表现出与腺病毒或其他候选辅助病毒的关联，即使在episomal和表达AAV的肝脏中(图7)．这些结果提示HHV6在肝脏中可能是AAV的天然辅助病毒。然而，与其他辅助病毒合并感染可能发生在最初的急性AAV感染，随后清除。复制能力传染性AAV已从人扁桃体、腺样组织和淋巴细胞中抢救出，在新鲜肝组织中仍有待寻找。48 55分离出病毒克隆，并在HeLa细胞中测试其传染性，结果表明只有具有完整双d ITR结构的AAV克隆能够复制并产生传染性病毒。55有趣的是，在我们的系列文章中，对集体形式的ITRs连接的分析强调了支持其在活动性AAV感染中的作用的相同的双d结构的存在。此外，肝脏中episomin表达的AAV与年龄之间的特殊联系表明，AAV活动性感染发生在生命的前30年，然后保持潜伏。
对肿瘤组织的分析证实，在非肝硬化的肝细胞癌发展中选择了克隆性AAV插入。在我们的HCC队列中，有2%的人发现了复发性体细胞病毒整合CCNA2(33.3%),CCNE1(27.8%),GLI1/INHBE(11.1%),叔(11.1%),TNFSF10(11.1%)和KMT2B(5.6%)。AAV插入通过多种机制诱导靶基因过表达，这些机制根据靶基因和整合的定位而不同。克隆插入在TSS上游或基因的5 '区域内导致获得积极的调节机制，如使用病毒增强子和转录因子结合位点(TFBS)。有趣的是，洛根最近的一项研究等在HCC肿瘤的常见插入区域的野生型AAV基因组中描述了一种肝脏特异性增强子-启动子元件。29它由124个核苷酸序列组成，包含HNF1-α， HNF6和GATA6的TFBSs。值得注意的是，该区域在目前使用的许多AAV载体中是不存在的，应该提高生物安全标志或在其余的AAV载体中删除。与我们的发现一致，这一结果有力地支持了aav诱导靶基因过表达的机制。此外，病毒插入CCNA2而且TNFSF10基因分别导致病毒polyA中截断蛋白的表达或转录本的过早结束。
在我们的欧洲HCC患者队列中发现了AAV癌基因整合。在ICGC-Japan队列中，268例HCC中有3例(1.1%)观察到它们，45在TCGA队列的334例HCC中有4例(1.2%)34韩国289例HCC中2例(0.7%)。56有趣的是，最常见的AAV整合癌基因与HBV相似，即:CCNA2，CCNE1,叔而且KMT2B．AAV患病率较低可能是由于与慢性HBV感染相比，缺乏与活跃AAV复制相关的慢性肝病。在本系列研究中，我们强调了AAV致癌插入与正常肝脏中HCC发生之间的联系，包括在肝癌靶向的肝细胞腺瘤恶性转化过程中反复插入AAVGLI1它定义了腺瘤的激活超音hedgehog分子亚群，shHCA。57与此同时，肝癌细胞周期蛋白A2或E1中AAV插入与独特的染色体重排特征和不良预后相关，主要发生在正常肝脏的肝癌中。34这些结果强调了AAV插入在没有其他病因的特定HCC亚组的发展中的作用。
总之，我们提供了一幅肝脏AAV感染的图像，描述了病毒的基因型、分子形式和辅助病毒，为重新研究野生型AAV生物学铺平了道路。在这项工作中，对肝癌肿瘤中AAV整合的致癌后果的理解出现了新的亮点。然而，需要进一步的研究来阐明AAV感染在其他队列患者中的影响以及不同国家插入突变的频率。
致谢
作者要感谢外科医生、病理学家和所有收集样本和临床数据的临床医生。Sophie Prevost，病理解剖服务，APHP, Hôpital Antoine-Béclère，法国Clamart。Anne de Muret，解剖病理处，医院中心Régional法国图尔大学。Eric Viber, Centre Hépato-Biliaire, INSERM U785, Hôpital Paul Brousse, Villejuif，法国。Philippe Merle，法国里昂Croix-Rousse大学医院里昂平民临终关怀医院肝脏科。莫尼克·法布尔，解剖服务，胡内克尔Enfants Malades APHP，巴黎。Nathalie Sturm，法国格勒诺布尔大学解剖与细胞病理学部。Thomas Decaens, Service Hépato-gastroentérologie et Tumeurs du foie, CHU de Grenoble，格勒诺布尔，法国。Sophie Michalak, Département《细胞与组织病理学》，CHU ANGERS。乔治-菲利普·佩多，服务'hépato-gastro-entérologie Hôpital圣埃洛伊·朱蒙彼利埃。 Jean-Michel Fabre, service de chirurgie digestive Hôpital St Eloi CHU Montpellier. Emmanuel Boleslawski, service de chirurgie digestive et transplantation. Hôpital Huriez. Chru de lille. 59037 lille cedex. Marie Christine Saint Paul, service d’Anatomie Pathologique, CHU de Nice, Nice. Dominique Wendum, Department of Pathology, Saint-Antoine Hospital, APHP, Paris, France. Olivier Rosmorduc, Department of Gastroenterology and Hepatology, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, APHP, Université Pierre et Marie Curie UPMC, Paris. Jean Christophe Vaillant, service de chirurgie hépato-bilio- pancréatique, CHU Pitié-Salpetriere, Université Pierre et Marie Curie UPMC, Paris. Marianne Ziol, Service d’Anatomopathologie, Hôpital Jean Verdier, Hôpitaux universitaires Paris-Seine- Saint-Denis, APHP, Bondy, France. Nathalie Ganne, Department of Hepatogastroenterology, Hôpital Jean Verdier, APHP, Bondy, France. Luigi Terraciano, Basel University Hospital, Department of Pathology, Basel, Switzerland. Vincenzo Mazzaferro, University of Milan at the Istituto Nazionale Tumori IRCCS (National Cancer Institute). Celine Bazille, Service d’Anatomie Pathologie, CHU de Caen, Caen, France.
参考文献
脚注
TLB和SI的贡献相同。
贡献者研究设计:J-CN, JZ-R, TLB, SI。实验数据生成:TLB, SI, CP, IM, SD。数据分析及解释:TLB、SI、CP、IM、SD、QB、SC、TZH、EL、J-CN、JZ-R。样本收集及相关组织学和临床资料:J-CN, JZ-R, JC, GM, CG, VP, GA, AL, LP, LC, PB-S, J-FB和调查人员。稿件起草:JZ-R, TLB, SI。审定稿稿:JZ-R、J-CN、TLB、SI、IM、SD、QB、SC、TZH、EL、JC、GM、CG、VP、GA、AL、LP、LC、PB-S、J-FB。
资金这项工作得到了INSERM、ICGC项目内的INCa、法国Génomique、Cancéropole法国岛(排气管项目)、ITMO癌症AVIESAN(国家生命科学联盟Santé，国家生命科学与健康联盟)在癌症计划框架内的支持(“HTE计划- hetcoli网络”和“癌症与环境计划”)、Réseau国家CRB Foie、国家抗癌联盟:项目équipe Labellisée, Schueller Bettencourt基金会“coup d’élan”，法国癌症大奖赛comité de Paris René et Andrée Duquesne 2018, SIRIC CARPEM和基金会Mérieux, Labex OncoImmunology (investissement d’avenir) ANRS和法国肝脏生物库网络inca, BB-0033-00085，肝生物库。QB由HOB博士学院和教育研究部的奖学金支持，TLB由IUH的“Attractivité IDEX”奖学金支持，CP由ANRS资助的博士奖学金支持。
相互竞争的利益没有宣布。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据共享声明本文报道的测序数据已存入Genbank(资料来源:KT258720-KT258730，MK139243-MK139299，MK163929-MK163942而且MK231253-MK231264)和EGA (European Genome-phenome Archive)数据库(RNA-seq接入:EGAS00001002879, EGAS00001001284和EGAS00001003310)。所有补充数据和序列可在http://zucmanlab.com/wp-content/uploads/2019/05/Zucman-CaptureVirusProbes.xlsx．