你在这里

条文本

菜单条

下载PDF

肝脏病学
原始研究
肝腺相关病毒:肿瘤发展的自然历史和后果
免费的
  1. 蒂齐亚娜·拉·贝拉1，2，
  2. Sandrine Imbeaud1，2，
  3. 卡米尔Peneau1，2，
  4. Iadh麻美1，2，
  5. 莎莉尼·达塔1，2，3.，
  6. 昆汀Bayard1，2，
  7. 斯特凡诺卡鲁索1，2，
  8. 西奥·赫施1，2，
  9. 朱利安Calderaro1，2，4，
  10. Guillaume Morcrette1，2，5，6，
  11. 凯瑟琳Guettier5，6，
  12. 瓦莱丽-2，7，8，
  13. 古丽亚娜Amaddeo9，10，
  14. 亚历克西斯·洛朗11，
  15. Laurent Possenti12，
  16. 劳伦斯Chiche13，
  17. 波莱特Bioulac-Sage14，15，
  18. Jean-Frederic布兰科12，14，15，
  19. Eric Letouze1，2，
  20. 租用Nault1，2，16，
  21. 杰西卡Zucman-Rossi1，2，17
  1. 1科德利埃研究中心，索邦大学(Sorbonne university，巴黎，巴黎大区、法国
  2. 2实体肿瘤功能基因组学，免疫肿瘤学，肿瘤控制，巴黎大学，巴黎大学，巴黎，巴黎大区、法国
  3. 3.印度统计研究所，卡利亚尼大学，Kalyani，西孟加拉、印度
  4. 4病理部门，我是朱·亨利·蒙多，完成，巴黎大区、法国
  5. 5病理部门，比塞特-保罗·布鲁斯医院，克里姆林宫Bicêtre，巴黎大区、法国
  6. 6肝脏疾病的生理病理发生与治疗，INSERM，巴黎，巴黎大区、法国
  7. 7病理部门，博洪医院的APHP，巴黎，巴黎大区、法国
  8. 8炎症研究中心标明，INSERM，巴黎，巴黎大区
  9. 9肝脏病学部门，亨利·蒙多医院，完成，巴黎大区、法国
  10. 10分子病毒学和免疫学，法国生物医学研究所(INSERM)，完成，巴黎大区、法国
  11. 11消化外科，亨利·蒙多医院，完成，巴黎大区、法国
  12. 12肝消化肿瘤科，CHU de Bordeaux, Haut-Lévêque医院，波尔多，阿基坦、法国
  13. 13麦哲伦医学中心消化外科，CHU de Bordeaux, Haut-Lévêque医院，波尔多，阿基坦、法国
  14. 14病理学系，CHU de Bordeaux, Pellegrin医院，波尔多，阿基坦、法国
  15. 15波尔多转化肿瘤学研究，大学波尔多，波尔多，阿基坦、法国
  16. 16巴黎北部大学肝病学系，Jean Verdier医院的APHP，Bondy，巴黎大区、法国
  17. 17肿瘤科，欧洲蓬皮杜医院，巴黎，巴黎大区、法国
  1. 对应到Jessica Zucman-Rossi教授;jessica.zucman在}{gmail.com，jessica.zucman在}{gmail.com

摘要

客观的腺相关病毒(AAV)是一种有缺陷的单链DNA病毒，在人群中流行(35%-80%)。复发性克隆AAV2插入与罕见的人类肝细胞癌(HCC)的发病机制有关。本研究旨在描述肝内AAV感染的自然历史及其在肿瘤发展中的后果。

设计在1461例患者的肿瘤和非肿瘤肝组织中定量检测病毒DNA。采用基于DNAse/ taqman的检测和定量RT-PCR分析外体形式的存在和病毒mRNA的表达。利用病毒捕获数据的计算机分析探索了病毒变体和新的克隆插入。

结果在21%的患者中检测到AAV DNA，包括8%的肿瘤组织，平均分布在两种主要的病毒亚型中:一种类似于AAV2，另一种介于AAV2和AAV13序列之间。在4%的非肿瘤组织中发现Episomal病毒形式，通常与病毒RNA表达和人类疱疹病毒6型(候选的天然AAV辅助病毒)相关。在30例HCC中，AAV克隆插入反复出现在CCNA2，CCNE1，叔，TNFSF10，KMT2B和GLI1/INHBE。AAV插入通过多种机制触发致癌过表达，这些机制因整合位点的定位而异。

结论我们对野生型AAV在肝脏中的感染进行了综合分析，鉴定了病毒的基因型、分子形式、辅助病毒关系和病毒整合。在非肝硬化肝脏的HCC发展过程中，克隆AAV插入阳性选择，挑战了AAV是非致病性病毒的概念。

  • 肝细胞癌
  • 致癌基因
  • 致癌作用
  • 肝
  • 慢性病毒性肝炎

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2019-318281

来自Altmetric.com的统计数据

    请求的权限

    如果您希望重用这篇文章的任何或全部，请使用下面的链接，这将带您到版权清算中心的RightsLink服务。您将能够得到一个快速的价格和即时许可，以许多不同的方式重用的内容。

    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 腺相关病毒(AAV)在一般人群中血清阳性率为40%-80%，其中AAV2型是人类中最常见的血清型。

    • AAV具有两相生命周期，分为潜伏期和裂解期。

    • 辅助病毒的存在是AAV复制所必需的。

    • 一般认为腺病毒是天然的AAV辅助病毒。

    • 虽然AAV被认为是一种非致病性病毒，但复发性克隆AAV2插入与肝细胞癌(HCC)的发展有关。

    有什么新发现?

    • 两种病毒亚型存在于21%的肝组织中:AAV2和混合AAV2/13序列。

    • 在4%的非肿瘤性肝组织中发现外体型AAV，主要见于无肝纤维化的年轻女性患者。

    • 人类6型疱疹病毒是肝脏中最常见的AAV辅助病毒。

    • 2%的HCC患者在癌驱动基因中表现出AAV克隆整合。

    • 在HCC中插入AAV克隆可通过多种机制激活癌基因。

    本研究的意义

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 这些发现对于了解野生型AAV生物学及其与肝癌发生的关系具有重要意义。

    • 考虑到AAV载体在肝脏靶向基因治疗中的大量使用，我们的数据尤其相关。

    • 即使罕见，AAV插入突变也是HCC发展的一个新的危险因素，因此AAV作为非致病性病毒的概念应该重新审视。

    介绍

    腺相关病毒(AAV)是一种小型无包膜DNA病毒，具有二十面体衣壳，内含4.7 kb线性单链基因组。１ ２AAV基因组编码非结构蛋白(Rep78、68、52和40)、衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)和装配激活蛋白(AAP)。3 4在末端，逆串联重复序列(ITR)在宿主基因组整合中起着重要作用。5个6AAV是一种有缺陷的病毒，需要辅助病毒才能发生活动性感染，否则它可以通过整合到宿主基因组或维持为圆形小体形式建立潜伏感染。7号到9号AAV血清阳性率显示，该感染在儿童期开始在人群中流行(30%-80%)。10 - 12已鉴定出12种不同的血清型和100多种自然变异，其中AAV2是人类最常见的类型。13 - 16

    由于缺乏可识别的相关疾病，并且重组AAV (rAAV)载体具有高效、长期转基因表达、低免疫原性和特异性组织亲和性的卓越转导分裂和非分裂细胞的能力，这种小病毒对基因治疗具有吸引力。17尽管AAV早在1965年就被发现，但关于人类AAV感染的自然史仍有许多问题没有得到解答。2众所周知，载体主要以附着体形式存在于细胞核中，并持续表达RNA，这对野生型感染中假定的附着体AAV形式提出了质疑。8已经发现了几种辅助病毒，但它们与野生型肝AAV感染的确切关联尚不清楚。不同AAV基因型在人群中的频率以及首次感染后AAV在组织中的持久性仍有待确定。18此外，AAV与肿瘤发展的联系是有争议的，一些研究报道了动物模型中AAV感染的致癌作用，而另一些研究则表明AAV感染具有肿瘤抑制作用。19到24

    最近，我们报道了在没有HBV和HCV感染、高酒精摄入、血色素沉着病或黄曲霉毒素B1暴露等经典HCC危险因素的情况下，AAV2参与正常肝脏发生的人肝细胞癌(HCC)的发病机制。25与HBV类似，AAV2克隆的反复插入在叔，CCNE1和CCNA2癌症驱动基因，导致它们过度表达。25 - 28AAV插入可以通过最近在病毒3'ITR附近的最小常见AAV插入序列中发现的肝脏启动子激活位于人类基因组附近的癌基因。29

    在这项工作中，我们对1461例良性或恶性肝肿瘤患者的肝脏野生型AAV感染的自然历史及其在肿瘤发展中的影响进行了研究。

    材料与方法

    患者和组织样本

    1461名患者纳入了我们当地机构审查委员会(IRB)委员会批准的研究(CCPRB Paris Saint-Louis, 1997和2004;波尔多2010-A00498-31，法兰西岛7:项目C0-15-003和PP 16-001)。在法国医院，肝组织在手术后立即被冷冻。对1269例患者的肿瘤组织和非肿瘤组织进行了分析，分别对138例和54例患者的肿瘤组织和非肿瘤组织进行了调查。本系列包括HCC (n=936)、肝细胞腺瘤(HCA, n=225)、局灶性结节性增生(FNH, n=97)、肝母细胞瘤或移行性肿瘤(n=87)、胆管癌(n=46)、纤维板层癌(n=36)和其他肿瘤(n=34)补充表1)。

    病毒DNA筛选

    在Fluidigm 96.96动态阵列上，使用BioMark实时荧光定量PCR系统，采用Primer3Plus软件(在线)设计的TaqMan探针组，对基因组DNA进行定量RT-PCR (qRT-PCR)分析补充图1A和表2)。使用Fluidigm Real-Time PCR分析软件(V.4.1.3)分析结果，并报告内参基因HMBS。定量以病毒拷贝数/细胞表示。使用的normalmixEM函数测试拷贝数/单元格值的单峰和双峰分布mixtools包在R中。30.

    利用病毒捕获测序技术分离人AAV

    对肿瘤和匹配的正常样本进行基因组DNA的病毒捕获，序列如前所述，使用120-mer引物识别所有AAV基因型1-13，已经描述了大约305个探针/基因型。25使用Burrows-Wheeler Aligner (V.0.7.15)将病毒reads映射到所有AAV1至AAV13参考序列。31AAV读取数与病毒拷贝数/细胞(在线)相关补充图1B)。使用samtools (V.1.3)提取至少有一个读取对与病毒对齐的读取对;32并与包括人类染色体和病毒序列在内的定制参考基因组对齐。我们通过生成一个20k-bin大小的hg19基因组床，计算每个样本中映射AAV/人类嵌合和配偶区域的reads数，该床用于bedtools multicov utility的计算。33对于每个箱，我们计算了在泛基因组图中显示的样本覆盖率的平均值。我们使用嵌合读取通过在连接的两侧绘制序列来确定插入断点的碱基分辨率。当bbb25序列与同一位点重叠时，考虑克隆事件，当鉴定出4-24个重叠序列时，考虑亚克隆插入。在Integrative Genomics Viewer上通过目视检查验证所有病毒插入。序列已存入Genbank数据库MK231253来MK231264和KT258720来KT258730。

    人类aav全长序列分析详见网上补充材料和方法。序列已存入Genbank数据库MK139243来MK139299和MK163929来MK163942。

    RNAseq

    在HiSeq2000测序仪上使用Illumina TruSeq mRNA测序试剂盒对富含poly(A)+ RNA的样品进行测序，得到约4500万个100碱基对(bp)成对的末端reads (IntegraGen, Evry)。34利用TopHat2对Reads进行比对，重构嵌合序列35袖扣V.2.2.1。36我们使用ElemeNT37用于预测转录起始位点(TSS)， Alamut Visual软件(Interactive Biosoftware)用于识别嵌合DNA序列ATGpr上的剪接信号38鉴定翻译起始位点，用Poly(A) Signal Miner鉴定PolyA位点。39序列存入EGA数据库(EGAS00001002879、EGAS00001001284和EGAS00001003310)。

    病毒插曲形式的检测

    一种基于DNAse/ taqman的特异性检测方法改编自Werle-Lapostolle的方案等40检测AAV个体形态(详细步骤见网上)补充材料和方法)。利用围绕itr的两对引物扩增环状AAV的连接补充表2)，加入2.5%甘油和5%二甲基亚砜。PCR产物经ExoSAP-IT (Applied Biosystem)纯化后进行Sanger测序。41

    定量rt - pcr

    采用qRT-PCR分析AAV mRNA和插入目的基因的表达情况。具体来说，我们使用了7个AAV定制和人类目录TaqMan探针(在线)补充表2)，采用AB7900HT PCR系统(Applied Biosystem)和BioMark Real-Time PCR系统。表达数据用2−ΔCt方法相对核糖体18S (Hs03928990_g1)。5个正常组织作为对照。

    定点诱变

    研究了病毒多a信号在AAV诱导的基因过表达中的作用TNFSF10。25使用QuikChange Lightning定点突变试剂盒(Agilent)在病毒polyA信号(NC_001401: 4424 A>C, 4426 T>G, 4427 A>C, 4429 A>C)中引入4个点突变。所有突变均采用Sanger测序进行验证。

    细胞培养、转染和双荧光素酶测定

    HuH7、HepG2和HuH6细胞购自ATCC，在添加10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素的Dulbecco 's Modified Eagle培养基中培养。检测细胞是否受支原体污染。通过外显子组测序验证了身份。细胞用Lipofectamine 3000 (Life Technologies)转染含有野生型pmirGLO质粒(Promega)TNFSF103'UTR，在荧光素酶报告基因下游有AAV2插入或打乱的AAV2序列的3'UTR。萤火虫荧光素酶的发光在相应的肾荧光素酶活性上归一化。计算相对于野生型的折叠变化TNFSF103 'utr构造。

    统计分析

    使用RStudio (V.1.0.136)和GraphPad Prism (V.6.0a)进行统计分析。通过Χ调查AAV与患者临床、组织学特征的关系2测试。P值调整计算了2000个排列的蒙特卡罗检验。定量变量的统计学显著性采用Wilcoxon秩和检验。变量之间的关联通过多项逻辑回归建模。用学生t检验比较转染细胞和对照细胞的荧光素酶活性。所有检验均为双尾检验，p值<0.05认为有统计学意义。

    结果

    肝脏中两种主要AAV基因型的鉴定

    对1319例患者的冷冻肝组织进行筛选，6个Taqman探针沿基因组分布，共同识别所有AAV基因型1-13在18% (n=233)的非肿瘤肝组织中鉴定出AAV DNA(在线)补充图1)。对于所有已知基因型1-13的病毒AAV DNA捕获，我们选择了80个非肿瘤肝脏样本，包括68个阳性样本，范围从2×104到0.18拷贝数/单元格。测序后，重建了57份样本的AAV全长序列，鉴定出两种主要AAV亚型(图1 a - b)。第一亚型(n=25)与AAV2参考序列NC_001401和人分离的VP1分支B基因型高度相似14 42(在线补充表2)。第二亚型(n=32)显示混杂序列，包括AAV13衣壳的各个部分(类似于进化支C)14 42在aav25 '部分的背景下，它被命名为AAV2/13 (图1 b和在线补充图2)。我们在病毒基因组中发现了42个AAV亚型共有的沉默变异，但不同于AAV2参考基因NC_001401 (图1 c)。相比之下，导致AAV2/13序列氨基酸替换的几个核苷酸变异位于高变区(HVRs) 5、6、7和10，起源于AAV13序列(图1 c)。筛选整个系列的1319个样本，使用两个探针特异性的AAV2/13亚型，位于CAP2区域(在线)补充图1)，在143份变异区阳性样本中鉴定出47.6%的AAV2基因型和52.4%的AAV2/13基因型。

    Adeno-associated virus (AAV) full-length sequences in 57 human liver tissues. (A) Schematic representation of AAV genome (reference NC_001401) with location of the two open reading frames encoding replication proteins (Rep78, Rep68, Rep52 and Rep40), structural proteins (VP1, VP2 and VP3) and assembly activating protein (AAP) protein. Inverted terminal repeats (ITR) are represented on the 5’ and 3’ ends. Promoters (p5, p19 and p40) are indicated with arrows. (B) Nucleotides sequences (4679 bp) from 57 full-length AAV isolated from human liver tissues (ID number indicated with #) multialigned with the ClustalW algorithm compared with reference sequences on the top, AAV2 (NC_001401, in white), AAV3 (NC_001729.1) and AAV13 (EU285562.1). Two distinct viral genotypes, AAV2 and AAV2/13 were identified. Colour bars indicated nucleotide divergence with the AAV2 reference genome similar to AAV3 and/or AAV13 genomes (green) or not (grey), similarities with NC_001401 are in white. Variations due to flip-flop ITR configurations compared with AAV2 reference are labelled in light grey. The liver-specific enhancer-promoter element (LSP) described by Logan et al is indicated.29 (C) Amino acid variations compared with the AAV2 reference are indicated. The triangles indicate genome location of specific AAV2/13 (top) or AAV2 (middle) variants in the series of 57 human liver AAV isolates. Common variants shared by both genotypes are shown (bottom). Grey and black colours refer to silent and missense AAV variants, respectively; numbers correspond to wild-type AAV2 nucleotide sequence coordinates (NC_001401).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    57个人肝组织中腺相关病毒(AAV)的全长序列。(A) AAV基因组示意图(参考文献NC_001401)，两个开放阅读框编码复制蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)、结构蛋白(VP1、VP2和VP3)和组装激活蛋白(AAP)的位置。反向末端重复序列(ITR)表示在5 '和3 '端。启动子(p5, p19和p40)用箭头表示。(B)从人肝组织中分离的57个全长AAV(编号以#表示)的核苷酸序列(4679 bp)与顶部的参考序列AAV2 (NC_001401，白色)、AAV3 (NC_001729.1)和AAV13 (EU285562.1)进行了ClustalW算法比对。鉴定出两种不同的病毒基因型，AAV2和AAV2/13。颜色条表示与AAV2参考基因组的核苷酸差异，与AAV3和/或AAV13基因组相似(绿色)或不相似(灰色)，与NC_001401相似(白色)。与AAV2参考值相比，触发器ITR配置的变化以浅灰色标记。Logan描述的肝脏特异性增强-启动子元件(LSP)等是表示。29(C)显示了与AAV2参考物相比的氨基酸变化。三角形表示特定的AAV2/13(上)或AAV2(中)变体在57个人类肝脏AAV分离株系列中的基因组位置。下面显示了两种基因型共有的常见变异。灰色和黑色分别代表沉默型和错义型AAV;编号对应野生型AAV2核苷酸序列坐标(NC_001401)。

    AAV感染和偶发形式

    在233例AAV阳性肝脏样本中，病毒DNA的定量显示双峰分布:97%的组织表现出低拷贝/细胞数(范围从4.6×105~ 0.04)，只有8例患者的AAV含量较高，范围为0.07 ~ 0.18拷贝/细胞(图2一个)。AAV在女性(p<0.001)和年轻患者(p=0.016)中显著富集，在非纤维化肝背景中更常发生(p<0.001;图2 b)。

    Adeno-associated virus (AAV) DNA in non-tumour tissues and viral episomal form. (A) Copy number/cell distribution in 233 samples. The density line defines the low and high positivity groups in blue and red, respectively. (B) Contingency analysis of AAV positive and negative patients according to gender, age and Metavir fibrosis score. Frequency of AAV-positive patients is displayed (χ² test with Monte Carlo simulation and χ² test for trend in proportions for Metavir score). (C) Frequency of RNA expression according to REP and CAP viral transcripts in patients with episomal and not-episomal AAV (χ² test with Monte Carlo simulation). (D) Viral copy number/cell (log10) in AAV-positive samples according to the episomal status and the transcriptional activity of the episome (Wilcoxon rank-sum test). (E) Distribution of the different viral molecular forms according to the age of the patients. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    腺相关病毒(AAV) DNA在非肿瘤组织和病毒附属体形式。(A) 233个样本的拷贝数/细胞分布。密度线以蓝色和红色分别表示低阳性组和高阳性组。(B)按性别、年龄、Metavir纤维化评分对AAV阳性和阴性患者的偶发性分析。显示aav阳性患者的频率(蒙特卡罗模拟χ 2检验和Metavir评分比例趋势χ 2检验)。(C)根据episomal和非episomal AAV患者REP和CAP病毒转录本的RNA表达频率(蒙特卡洛模拟χ 2检验)。(D)病毒拷贝数/细胞(log10)根据发作体状态和发作体的转录活性(Wilcoxon秩和检验)在aav阳性样本中进行比较。(E)不同病毒分子形态随患者年龄的分布。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。

    在64/233(27.5%)的AAV阳性组织中，所有AAV基因组区域都被扩增，表明存在整个病毒基因组。我们设计了一种基于DNAse/ taqman的检测方法(在线)补充图3A)，在60例患者中检测到episomal AAV，对应于26%的AAV阳性样本和4.6%的所有患者。通过对AAV捕获序列的计算机分析，在57例具有完整重建AAV基因组序列的病例中，我们鉴定出14例具有3'ITR-5'ITR连接。圆形的串联结构可能会脱离我们的实验方法来识别附着物的形式，43然而，我们没有发现在硅中插入串联体。3'ITR-5'ITR连接处显示各种序列呈现双d ITR结构，呈翻转或翻转构型，Sanger测序(在线)证实有125 bp的缺失补充图3C-D和4)。

    AAV转录与集体形式有关

    然后，我们用qRT-PCR方法在101个AAV阳性的非肿瘤肝组织中筛选AAV RNA的表达。在64%的检测肝组织中鉴定出AAV转录物。AAV REP或CAP在episomal形式的肝组织中表达丰富(p<0.001)，并且这两种转录本与episomal形式的AAV存在比非episomal形式的AAV存在更频繁地相关(p=0.022)，定义了“episomal表达的AAV”患者群体(p=0.022)。图2 c)。在表皮体表达AAV的肝组织中，每个细胞的AAV拷贝数较高，支持了这些肝脏样本中病毒活动性感染的假设(图2 d)。Episomal AAV在女性患者(p<0.001)和无肝硬化患者(p<0.001;在线补充图5A)。AAV阳性与年龄的关系分析显示，在30-40岁年龄组中，AAV阳性的频率最高，为25%。AAV发作形式以年轻患者(<40岁)多见，在20多岁时发生率最高(图2 e和在线补充图5B)。这些结果表明，AAV活动性感染在生命的第二和第三个十年更常见，而非活动性非发作形式在初次感染后存在。

    与AAV辅助病毒合并感染

    由于AAV是一种缺陷病毒，我们采用qRT-PCR技术对1319例肝脏组织进行了人腺病毒(AdV a - f型)、人疱疹病毒(HHV 1、2、4、5、6、7和8型)和人乳头瘤病毒16型(HPV16)的筛选，寻找潜在的AAV辅助病毒的存在。43%的患者(n=570)至少检测到其中一种病毒，39%的患者(n=520)仅检测到一种病毒。HHV6病毒感染率最高(39%)，其次是HHV4病毒(Epstein-Barr病毒，6%)，HHV7和腺病毒感染率较低(分别为2%和0.5%)。图3一)。在我们的肝脏组织队列中未发现HPV16和HHV 1型(HSV1)、2型(HSV2)、5型(CMV)和8型(KSHV)。HHV6是唯一在aav阳性患者中富集的辅助病毒(37.3% vs 44.8%， p=0.039)，特别是在episomal或表达episomal型患者中(分别为52.5%和67.9%，p<0.001);图3 b)。

    Helper viruses according to adeno-associated virus (AAV) status. (A) Frequency of helper viruses’ infections and co-infection in non-tumour tissues (n=1319). (B) Global frequency of human herpesvirus (HHV)6, Epstein-Barr virus (EBV), HHV7 and human adenovirus (AdV) infection according to AAV presence and form (χ² test for trend in proportions). (C) Multivariate analysis for global AAV positivity (left) including the variables closely related to AAV presence in the univariate analysis (logistic regression). The same analysis was performed for the presence of episomal AAV (middle) and episomal and expressed form (right). *P<0.05, ***p<0.001. ns, not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    辅助病毒根据腺相关病毒(AAV)状态。(A)辅助病毒感染和非肿瘤组织合并感染的频率(n=1319)。(B)根据AAV的存在和形式，全球人疱疹病毒(HHV)6、eb病毒(EBV)、HHV7和人腺病毒(AdV)感染的频率(χ 2检验比例趋势)。(C)全球AAV阳性的多变量分析(左)，包括单变量分析(逻辑回归)中与AAV存在密切相关的变量。对episomal AAV(中)和episomal及其表达形式(右)的存在进行了相同的分析。* * * * P < 0.05, P < 0.001。n，不显著。

    为了在整个队列患者中确定与AAV感染相关的独立特征，我们进行了多变量分析(图3 c)。女性(OR=1.83, p<0.001)、年龄(OR=1.42, p=0.044)、非肝硬化(OR=1.96, p<0.001)和合并HHV6感染(OR=1.15, p=0.031)与AAV阳性独立相关。女性(OR=4.71, p=0.013)、非纤维化肝(OR=12.13, p=0.018)和合并HHV6感染(OR=1.61, p=0.01)三个因素也与episomal和表达AAV的存在显著相关。

    肿瘤组织中的AAV

    与非肿瘤肝组织(n=233, 18%)相比，肿瘤组织中AAV DNA阳性的频率较低(n=109, 8%)，只有4.7%的患者在肿瘤和非肿瘤区室中均出现AAV (图4一)。109例阳性肿瘤中有20例显示高数量的AAV拷贝/细胞，范围在0.07 ~ 6.08之间。考虑到正常细胞的潜在污染和肿瘤肝细胞的倍性，这个值可能被低估了。绝大多数(n= 83,76%)只有一个或两个扩增的病毒区域富集于病毒的3'ITR区域(在线)补充图6A-B)。在恶性肿瘤和良性肿瘤中检测到AAV的频率相似，但在恶性肿瘤中，与克隆AAV插入事件(图4 c;在线补充表3)。相反，在除局灶性结节增生(FNH)患者外的所有良性肿瘤患者中，AAV在非肿瘤对应体中的阳性程度高于相应肿瘤(图4 c)。最后，病毒外溢形式很少在肿瘤中被发现(n= 8.6%)，主要是在良性肿瘤中(4例HCA和2例FNH)，只有2例HCC (补充图3C-D和4)。

    Adeno-associated virus (AAV) in tumour tissues and non-tumour liver counterparts. (A) Copy number/cell (log10) of paired tumour (T) and non-tumour (NT) tissues of each patient (n=1269). Solid and dashed line define, respectively, the threshold of positivity and the boundaries between high and low number of viral copies/cell. The frequency of patients with AAV in both tumour and non-tumour counterparts or only in one of them is indicated. (B) Frequency of AAV in tumour and non-tumour tissues of patients with malignant and benign tumours (χ² test with Monte Carlo simulation and Cochran-Mantel-Haenszel for gender adjustment). (C) AAV copy number/cell of paired tumour and non-tumour tissues of 270 AAV-positive patients grouped in malignant and benign tumour patients. Triangles represent the tumours with clonal AAV insertions (Wilcoxon rank-sum test). (D) Pan-genomic views of genomic location of the human/virus matching chimeric and mate reads in tumour (top) and non-tumour (bottom) samples. A line corresponds to a 20k-bin region, colour refers to the average number of reads counted per bin. The height of the lines corresponds to the frequency of presence of reads in the series of samples, considering 94 tumours and 82 non-tumours investigated with viral capture deepseq. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. ns, not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    腺相关病毒(AAV)在肿瘤组织和非肿瘤肝脏中的对应体。(A)副本编号/单元格(日志)10每个患者配对的肿瘤(T)和非肿瘤(NT)组织(n=1269)。实线和虚线分别定义了阳性阈值和病毒拷贝数/细胞的高低界限。AAV患者在肿瘤和非肿瘤中出现的频率或仅在其中一种情况下显示。(B)恶性肿瘤和良性肿瘤患者肿瘤组织和非肿瘤组织中AAV的频率(χ 2检验采用Monte Carlo模拟，性别校正采用Cochran-Mantel-Haenszel)。(C) 270例AAV阳性的恶性和良性肿瘤患者配对肿瘤和非肿瘤组织的AAV拷贝数/细胞。三角形表示克隆AAV插入的肿瘤(Wilcoxon秩和检验)。(D)肿瘤(上)和非肿瘤(下)样本中匹配的人/病毒嵌合和配偶序列的基因组位置的泛基因组视图。一条线对应一个20k-bin区域，颜色表示每个bin的平均读取次数。考虑到用病毒捕获deepseq研究的94个肿瘤和82个非肿瘤，线条的高度对应于一系列样品中reads存在的频率。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。 ns, not significant.

    AAV插入肝组织

    我们在6个hcc中发现了7个新的克隆插入GLI1/INHBE, (图5 a - b）叔（图5 c),CCNA2（图5 d)。仅在良性局灶性结节增生中发现了一个克隆插入，它发生在10号染色体的基因间区(图5克)而不影响最近基因的表达(图4D和图5)。结合TCGA和ICGC序列HCC中鉴定的AAV插入44 45在我们的队列中，先前描述的病例，25 34我们重新分析了肝肿瘤中总共30个独立的AAV插入(在线)补充表4)。病毒插入发生在两个方向，AAV2和AAV2/13亚型的代表性相同(分别占可解释病例的55%和45%)，30个插入中有25个确定了通常插入的最小AAV区域(核苷酸4390-4570)。

    Adeno-associated virus (AAV) clonal integration sites and transcripts consequences in tumours. Genes structure are schematised with boxes referring to exons and lines to introns regions. Transcription start sites location is shown on 5’ of the gene. Arrows indicate viral insertion sites in our series, in red, and in TCGA and ICGC tumours, in green. Asterisks refer to new inserted cases. Top lines refer to inserted AAV viral regions and arrows to 5’>3’ sequence orientation. Flip or flop 3’ITR are indicated. Observed transcripts are represented at the bottom of the gene structure with fusion viral sequences in red. WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    腺相关病毒(AAV)克隆整合位点和转录本在肿瘤中的作用。基因结构用框表示外显子，线表示内含子区域。转录起始位点位于基因的5 '处。红色箭头表示本系列中的病毒插入位点，绿色箭头表示TCGA和ICGC肿瘤中的病毒插入位点。星号表示新插入的案例。顶线为插入的AAV病毒区，箭头指向5 ' >3 '序列方向。指示翻转或触发器3'ITR。观察到的转录本在基因结构的底部用红色表示融合病毒序列。野生型。

    6个癌基因被AAV反复激活(在线)补充图7)。插入的GLI1/INHBE(4例腺瘤转化为HCC;图5 a - b)，叔(两个肝细胞癌,图5 c)，CCNE1(七肝癌,图5 e)，TNFSF10(两个肝细胞癌,图5 f),KMT2B(两个肝细胞癌,图5 h)在几乎所有情况下，通过启动子和/或增强子顺式机制导致这些癌基因全长编码区过表达(图5)。CCNA2在9例HCC中置入;除了一个以外的所有插入都聚集在一起CCNA2内含子2，它们导致异常的AAV-CCNA2转录，导致缺乏n端调节结构域的稳定的致癌截断蛋白(图5 d)。34的3'UTRTNFSF10在两种HCC中，AAV插入诱导TNFSF10过表达，转录物在病毒聚腺苷化时过早终止(图5 f)。在这里，使用两个插入的定点诱变，我们证明了病毒多a信号是确保在三种不同的测试细胞系(在线)中强荧光素酶过表达所必需的补充图8)。

    在非肿瘤肝组织中，未发现AAV克隆插入;与肿瘤样本相比，非克隆插入与episomal AAV的存在显著相关(p<0.001)。在非肿瘤组织和肿瘤组织中，非克隆AAV插入片段沿基因组随机分布(图4 d和在线补充图9)。在细胞系中未发现先前描述的AAV主要靶点特异性富集。46个47

    AAV特征和肿瘤异质性

    我们通过分析来自186名患者的多结节(n=475)来探讨肿瘤间的异质性，以确定病毒DNA、克隆插入和外泌体形式的存在。其中，在25例患者(在线)中检测到AAV DNA补充图6C)，包括4例克隆性AAV植入至少一个结节的患者。2例HCC患者在所有结节中均显示AAV克隆整合。得益于下一代测序(NGS)数据，我们能够通过观察每个结节中常见和私有的体细胞突变和拷贝数改变(CNA)来预测这些肿瘤的进化。有趣的是，2557号患者的两个肿瘤显示出相同的病毒插入TNFSF10，类似的基因突变和CNA谱，表明AAV插入是肝内转移前发生的卡车改变(图6)。相反，来自患者#1919的三个肿瘤，由癌中腺瘤的恶性转化引起，含有三种不同的克隆插入，都是靶向的GLI1，不同的基因突变谱和没有CNA提示这三个结节有独立的起源(图6 b)。

    Tumour development in patients with multiple nodules and clonal adeno-associated virus (AAV) insertions. The relation between the tumours is determined according to gene mutation profile and copy number alteration (CNA) of each nodule. The number of shared and private alterations is indicated above each branch. The major alterations with amino acid consequences are listed; mutations in driver genes and main CNAs are in bold. The AAV status, diagnosis and sources of genomic information (WGS, WES) are specified for each nodule. The thickness of the branch indicates the number of alterations. The position of the nodules for each patient is represented on the right. (A) The two hepatocellular carcinoma (HCC) nodules of patients #2557 display the same AAV insertion in TNFSF10 and they share 199 somatic mutations and several CNAs. This profile suggests that the nodules originate from the same primary tumour. (B) The three nodules of patient #1919 are heterogeneous for mutation profile and AAV insertions suggesting an independent origin of the tumours. NT, non-tumour.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    多结节和克隆腺相关病毒(AAV)插入患者的肿瘤发展根据每个结节的基因突变谱和拷贝数改变(CNA)来确定肿瘤之间的关系。每个分支的上方显示了共享和私有更改的数量。列出了对氨基酸产生影响的主要改变;驱动基因和主要cna的突变用粗体表示。每个结节指定AAV状态，诊断和基因组信息来源(WGS, WES)。树枝的粗细表示变化的数量。每个患者的结节位置在右侧。(A)患者#2557的两个肝细胞癌(HCC)结节显示相同的AAV插入TNFSF10它们共有199个体细胞突变和几个cna。这表明结节起源于同一原发肿瘤。(B)患者#1919的三个结节在突变谱和AAV插入上是异质的，表明肿瘤的起源是独立的。NT, non-tumour。

    讨论

    在这项研究中，我们对肝脏中不同的AAV病毒形式及其致癌后果进行了大规模的全面描述，有助于更好地了解人类AAV感染的自然史。

    在21%的非肿瘤和/或肿瘤肝脏患者中观察到AAV的患病率，这与在30%-80%的普通人群中发现的AAV抗体血清阳性率一致。10 - 12 48我们的研究结果显示，五分之一的患者在一生中肝脏中存在持续的AAV DNA，主要是在没有肝纤维化的年轻和女性患者中(图7)。然而，由于我们的大多数肝脏组织样本来自肝病患者，因此健康个体肝脏中AAV DNA的确切患病率仍有待评估。

    Adeno-associated virus (AAV) and helper viruses in the general population and in human liver. Frequency of different AAV genotypes and seroprevalence of AAV10–12 and helper viruses50 51 in the general population are showed in the upper panel. The error bar in the histogram represents the range of helper viruses seroprevalence according to the literature. The bottom panel summarises the results found in this study, with estimated frequencies in the general population. For men and women, the global AAV frequency, the presence of episomal transcribed AAV and the prevalence of oncogenic clonal AAV insertions are indicated. *This prevalence is normalised according to the frequency of clonal AAV insertion in hepatocellular carcinoma (HCC) (2%) and the prevalence of HCC in France (0.013%). AdV, human adenovirus; EBV, Epstein Barr virus; HHV, human herpesvirus.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    腺相关病毒(AAV)和辅助病毒在一般人群和人类肝脏。不同AAV基因型发生频率及血清AAV阳性率10 - 12辅助病毒50 51在一般人群中显示在上面的面板中。直方图中的误差条表示文献中辅助病毒血清流行率的范围。底部的面板总结了本研究的结果，以及在一般人群中的估计频率。对于男性和女性，全球AAV频率，外体转录AAV的存在以及致癌克隆AAV插入的流行程度均显示出来。*根据肝细胞癌(HCC)中克隆AAV插入的频率(2%)和法国HCC的患病率(0.013%)，该患病率归一化。AdV，人腺病毒;EBV，爱泼斯坦巴尔病毒;人类疱疹病毒。

    在我们的队列中，只有两种AAV基因型，AAV2和杂种AAV2/13，在患者中均匀分布。AAV2/13序列为5′部分的AAV2和3′部分的AAV13的杂种，对应于VP1分类的前一分支C。14由于只有一个来自C支的全长AAV序列是公开的，42我们的工作显著增加了人类AAV全长序列的数量，揭示了与肝脏中有效的自然AAV感染相关的基因组变异。与之前的血清学分析相比，10 11 49我们没有在肝脏中发现其他AAV基因型，即使AAV5和AAV8在循环单核细胞中很常见。48

    在4.6%的患者的非肿瘤组织中发现AAV表体形式，占所有AAV阳性肝脏样本的26%，而表体AAV先前仅在人类扁桃体和腺样体中被描述。9它经常与病毒mRNA表达有关，这表明在肝脏中相当大比例的人群中，表皮AAV也具有转录活性(图7)。一些病毒50 51腺病毒能够在体外支持AAV的复制，并且人们普遍认为腺病毒是AAV的天然助手。在这里，我们确定HHV6是与肝脏中episomal和转录AAV最常见的病毒。这种共存现象以前在健康献血者中有过报道48HHV6能够感染肝细胞。52-54在episomal表达AAV型患者中HHV6的频率增加可能表明2.1%的患者肝脏存在持续的活动性感染。相比之下，只有非常罕见的患者表现出与腺病毒或其他候选辅助病毒的关联，即使是在具有外源性和表达的AAV的肝脏中(图7)。这些结果可能提示HHV6作为AAV在肝脏中的天然辅助病毒的作用。然而，与其他辅助病毒的合并感染可能发生在最初的急性AAV感染，随后其清除。具有复制能力的传染性AAV已经从人类扁桃体、腺样组织和淋巴细胞中分离出来，但仍有待在新鲜肝组织中寻找。48 55分离病毒克隆并在体外HeLa细胞中检测其传染性，结果表明只有具有完整双d ITR结构的AAV克隆才能复制并产生感染性病毒。55有趣的是，在我们的系列研究中，对插曲形式的ITRs连接的分析强调了相同的双d结构的存在，支持其在活动性AAV感染中的作用。此外，在肝脏外体表达的AAV与年龄之间的特殊联系表明，AAV活动性感染发生在生命的前30年，然后保持潜伏。

    肿瘤组织的分析证实了克隆AAV插入在非肝硬化肝脏HCC发展中的选择。在我们的HCC队列中，有2%的患者发现了复发性体细胞病毒整合CCNA2(33.3%),CCNE1(27.8%),GLI1/INHBE(11.1%),叔(11.1%),TNFSF10(11.1%)和KMT2B(5.6%)。AAV插入通过多种机制诱导目标基因的过表达，这些机制根据目标和整合的定位而不同。克隆插入在TSS上游或基因的5 '区域内可获得积极的调控机制，如使用病毒增强子和转录因子结合位点(TFBS)。有趣的是，洛根最近的一项研究等在HCC肿瘤中常见插入区域的野生型AAV基因组中描述了肝脏特异性增强-启动子元件。29它由124个核苷酸序列组成，包含HNF1-α、HNF6和GATA6的TFBSs。值得注意的是，该区域在目前使用的许多AAV载体中不存在，在其余载体中应提高生物安全标志或删除。与我们的发现一致，这一结果有力地支持了aav诱导靶基因过表达的机制。另外，病毒插入CCNA2和TNFSF10基因分别导致了病毒polyA中截断蛋白的表达或转录物的过早结束。

    在我们的欧洲HCC患者队列中发现了AAV致癌整合。在ICGC-Japan队列中，在268例HCC中的3例(1.1%)中也观察到它们。45在TCGA队列中，334例HCC中有4例(1.2%)34289例HCC中有2例(0.7%)来自韩国。56有趣的是，最常见的AAV整合癌基因与HBV相似，即，CCNA2，CCNE1,叔和KMT2B。与慢性HBV感染相比，AAV患病率较低可能是由于缺乏与活跃AAV复制相关的慢性肝脏疾病。在本系列中，我们加强了AAV致癌插入与正常肝脏中HCC发生之间的联系，包括肝癌靶向中肝细胞腺瘤恶性转化中的复发性AAV插入GLI1定义了腺瘤的激活超音刺猬分子亚群，shHCA。57同样，HCC中细胞周期蛋白A2或E1中的AAV插入与独特的染色体重排特征和不良预后相关，主要发生在正常肝脏发生的HCC中。34这些结果强调了AAV插入在无其他病因的特定HCC亚组发展中的作用。

    总之，我们通过对病毒基因型、分子形式和辅助病毒的描述，提供了AAV在肝脏感染的描述，为对野生型AAV生物学的重新关注铺平了道路。从这项工作中出现了对AAV整合在HCC肿瘤中的致癌后果的理解的新亮点。然而，需要进一步的研究来阐明AAV感染对其他患者队列的影响以及不同国家插入突变的频率。

    致谢

    作者要感谢外科医生、病理学家和所有收集样本和临床数据的临床医生。Sophie Prevost, Service d 'anatomie pathologique, APHP, Hôpital antoine - b cl，法国克拉马尔。Anne de Muret，解剖病理学处，图尔大学附属医院中心，图尔，法国。Eric Viber, hcv - biliaire中心，INSERM U785, Hôpital Paul Brousse, Villejuif，法国。Philippe Merle，法国里昂克鲁瓦大学医院里昂平民医院肝病科。Monique Fabre, Service Anatomie, HU-Necker Enfants Malades，巴黎。Nathalie Sturm，法国格勒诺布尔市格勒诺布尔大学解剖与细胞学病理学系。Thomas Decaens，法国格勒诺布尔省，法国格勒诺布尔市，服务社，hcv - gastroentersamoologie et tumeures du foie。Sophie Michalak，病理细胞和组织学，CHU ANGERS。Georges-Philippe pagaux, service d ' hsamatatatgastroentsamatrologie Hôpital St Eloi CHU蒙彼利埃。 Jean-Michel Fabre, service de chirurgie digestive Hôpital St Eloi CHU Montpellier. Emmanuel Boleslawski, service de chirurgie digestive et transplantation. Hôpital Huriez. Chru de lille. 59037 lille cedex. Marie Christine Saint Paul, service d’Anatomie Pathologique, CHU de Nice, Nice. Dominique Wendum, Department of Pathology, Saint-Antoine Hospital, APHP, Paris, France. Olivier Rosmorduc, Department of Gastroenterology and Hepatology, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, APHP, Université Pierre et Marie Curie UPMC, Paris. Jean Christophe Vaillant, service de chirurgie hépato-bilio- pancréatique, CHU Pitié-Salpetriere, Université Pierre et Marie Curie UPMC, Paris. Marianne Ziol, Service d’Anatomopathologie, Hôpital Jean Verdier, Hôpitaux universitaires Paris-Seine- Saint-Denis, APHP, Bondy, France. Nathalie Ganne, Department of Hepatogastroenterology, Hôpital Jean Verdier, APHP, Bondy, France. Luigi Terraciano, Basel University Hospital, Department of Pathology, Basel, Switzerland. Vincenzo Mazzaferro, University of Milan at the Istituto Nazionale Tumori IRCCS (National Cancer Institute). Celine Bazille, Service d’Anatomie Pathologie, CHU de Caen, Caen, France.

    参考文献

    1. ↵
      2. 玫瑰晶澳，
      3. BernsKI，
      4. 霍根医学博士，等
      。单链腺病毒相关病毒基因组的证据:释放病毒DNA时形成DNA密度杂交体。美国国家科学基金委1969;64：863- - - - - -9。doi: 10.1073 / pnas.64.3.863
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    2. ↵
      2. AtchisonRW，
      3. Casto公元前，
      4. 地WM
      。腺病毒相关的缺陷病毒颗粒。科学1965;149：754- - - - - -5。doi: 10.1126 / science.149.3685.754
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    3. ↵
      2. 巴拉科瑞斯南B，
      3. JayandharanGR
      。用于基因治疗的腺相关病毒(AAV)载体的基础生物学。当前基因2014;14：86- - - - - -One hundred.。doi: 10.2174 / 1566523214666140302193709
      OpenUrl
    4. ↵
      2. 星期日F，
      3. 施密特K，
      4. Kleinschmidt晶澳
      。病毒组装因子促进核仁中AAV2衣壳的形成。美国国家科学基金委2010;107：10220- - - - - -5。doi: 10.1073 / pnas.1001673107
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    5. ↵
      2. 杨CC，
      3. 肖X，
      4. 朱X，等
      。细胞重组途径和病毒末端重复发夹结构足以在体内和体外整合腺相关病毒。J性研究1997;71：9231- - - - - -47。
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    6. ↵
      2. 南开H，
      3. 吴X，
      4. Fuess年代，等
      。腺相关病毒载体在小鼠肝脏整合的大规模分子表征。J性研究2005;79：3606- - - - - -14。doi: 10.1128 / jvi.79.6.3606 - 3614.2005
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    7. ↵
      2. 溶血性尿毒综合征D，
      3. Gogol-Doring一个，
      4. 陈W，等
      。第三代PacBio DNA测序分析了腺相关病毒2型野生型和载体介导的人二倍体成纤维细胞基因组整合谱。J性研究2014;88：11253- - - - - -63。doi: 10.1128 / JVI.01356-14
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    8. ↵
      2. 舒尔茨BR，
      3. 张伯伦JS
      。重组腺相关病毒的转导与整合。摩尔其他2008;16：1189- - - - - -99。doi: 10.1038 / mt.2008.103
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    9. ↵
      2. Schnepp公元前，
      3. 詹森RL，
      4. 陈CL，等
      。从人体组织中分离的腺相关病毒基因组的特性分析。J性研究2005;79：14793- - - - - -803。doi: 10.1128 / jvi.79.23.14793 - 14803.2005
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    10. ↵
      2. Boutin年代，
      3. MonteilhetV，
      4. 贝隆P，等
      。健康人群中1、2、5、6、8和9型腺相关病毒(AAV)血清IgG和中和因子的流行:使用AAV载体进行基因治疗的意义。哼，吉恩。2010;21：704- - - - - -12。doi: 10.1089 / hum.2009.182
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    11. ↵
      2. CalcedoR，
      3. Vandenberghe韩，
      4. 高G，等
      。腺相关病毒中和抗体的全球流行病学研究。J传染病2009;199：381- - - - - -90。doi: 10.1086/595830
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    12. ↵
      2. 话务量K，
      3. SebokovaP，
      4. Schlehofer小
      。腺相关病毒(AAV)血清抗体(IgG和IgM)流行率的最新情况。医学病毒学1999;59：406- - - - - -11。doi: 10.1002 / (SICI) 1096 - 9071 (199911) 59:3 < 406:: AID-JMV22 > 3.0.CO; 2 n
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    13. ↵
      2. 高全科医生，
      3. Alvira先生，
      4. 王l，等
      。恒河猴新型腺相关病毒作为人类基因治疗载体。美国国家科学基金委2002;99：11854- - - - - -9。doi: 10.1073 / pnas.182412299
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    14. ↵
      2. 高G，
      3. Vandenberghe韩，
      4. Alvira先生，等
      。腺相关病毒分支在人体组织中广泛传播。J性研究2004;78：6381- - - - - -8。doi: 10.1128 / jvi.78.12.6381 - 6388.2004
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    15. ↵
      2. 森年代，
      3. 王l，
      4. 竹内T，等
      。两种新的食蟹猴腺相关病毒:衣壳蛋白的假分型特征。病毒学2004;330：375- - - - - -83。doi: 10.1016 / j.virol.2004.10.012
      OpenUrl CrossRef PubMed
    16. ↵
      2. 施密特米，
      3. Voutetakis一个，
      4. Afione年代，等
      。腺相关病毒12型(AAV12):一种新的AAV血清型，具有不依赖唾液酸和硫酸肝素蛋白聚糖的转导活性。J性研究2008;82：1399- - - - - -406。doi: 10.1128 / JVI.02012-07
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    17. ↵
      2. 钱德勒RJ，
      3. 金沙女士，
      4. VendittiCP
      。重组腺相关病毒整合和遗传毒性:来自动物模型的见解。哼，吉恩。2017;28：314- - - - - -22。doi: 10.1089 / hum.2017.009
      OpenUrl
    18. ↵
      2. BernsKI，
      3. MuzyczkaN
      。AAV:对未解决问题的概述。哼，吉恩。2017;28：308- - - - - -13。doi: 10.1089 / hum.2017.048
      OpenUrl
    19. ↵
      2. Donsante一个，
      3. 米勒DG，
      4. 李Y，等
      。AAV载体在小鼠肝细胞癌中的整合位点。科学2007;317：477。doi: 10.1126 / science.1142658
    20. ↵
      2. 钱德勒RJ，
      3. LaFaveMC，
      4. Varshney门将，等
      。载体设计对腺相关病毒基因治疗后肝脏遗传毒性的影响。J临床投资2015;125：870- - - - - -80。doi: 10.1172 / JCI79213
      OpenUrl CrossRef PubMed
    21. ↵
      2. 王公关，
      3. 徐米，
      4. Toffanin年代，等
      。体内基因靶向诱导肝癌的研究。美国国家科学基金委2012;109：11264- - - - - -9。doi: 10.1073 / pnas.1117032109
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    22. ↵
      2. HermonatPL，
      3. 普罗特RT，
      4. Santin广告，等
      。腺相关病毒Rep78通过人乳头瘤病毒16-ras嵌合物抑制原代人角质形成细胞的癌性转化。Gynecol杂志1997;66：487- - - - - -94。doi: 10.1006 / gyno.1997.4789
      OpenUrl CrossRef PubMed
    23. ↵
      2. 刘T，
      3. 琮米，
      4. 王P，等
      。腺相关病毒Rep78蛋白通过调控HBV核心启动子抑制乙型肝炎病毒复制。生物化学，生物物理学，公共科学2009;385：106- - - - - -11。doi: 10.1016 / j.bbrc.2009.04.132
      OpenUrl PubMed
    24. ↵
      2. KokorinaNA，
      3. Santin广告，
      4. 李C，等
      。蛋白- dna相互作用参与腺相关病毒rep78介导的HIV-1抑制。jhum Virol1998;1：441- - - - - -50。
      OpenUrl PubMed
    25. ↵
      2. NaultJC，
      3. 达塔年代，
      4. Imbeaud年代，等
      。人肝细胞癌中复发性aav2相关插入突变。Nat麝猫2015;47：1187- - - - - -93。doi: 10.1038 / ng.3389
      OpenUrl CrossRef PubMed
    26. ↵
      2. 赵韩，
      3. 刘X，
      4. 杨ydF4y2BaHX，等
      。HBV在肝细胞癌中整合的基因组和致癌偏好。Nat Commun2016;7：12992。doi: 10.1038 / ncomms12992
      OpenUrl CrossRef
    27. ↵
      2. 唱周，
      3. 郑H，
      4. 李年代，等
      。肝细胞癌复发性HBV整合的全基因组调查。Nat麝猫2012;44：765- - - - - -9。doi: 10.1038 / ng.2295
      OpenUrl CrossRef PubMed
    28. ↵
      2. LlovetJM，
      3. Zucman-RossiJ，
      4. PikarskyE，等
      。肝细胞癌。Nat Rev Dis primer2016;2：16018。doi: 10.1038 / nrdp.2016.18
      OpenUrl CrossRef PubMed
    29. ↵
      2. 洛根GJ，
      3. 丹麦人美联社，
      4. Hallwirth简历，等
      。野生型AAV2基因组3'非翻译区肝脏特异性增强-启动子活性的鉴定。Nat麝猫2017;49：1267- - - - - -73。doi: 10.1038 / ng.3893
      OpenUrl
    30. ↵
      2. BenagliaT，
      3. ChauveauD，
      4. 猎人博士，等
      。mixtools:一个用于分析混合模型的R包。统计软件杂志2009;32：1- - - - - -29。
      OpenUrl
    31. ↵
      2. 李H，
      3. 德宾R
      。快速和准确的长读对齐与Burrows-Wheeler变换。生物信息学2010;26：589- - - - - -95。doi: 10.1093 /生物信息学/ btp698
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    32. ↵
      2. 李H，
      3. HandsakerB，
      4. Wysoker一个，等
      。序列比对/映射格式和SAMtools。生物信息学2009;25：2078- - - - - -9。doi: 10.1093 /生物信息学/ btp352
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    33. ↵
      2. 昆兰基于“增大化现实”技术，
      3. 大厅即时通讯
      。BEDTools:一套灵活的工具，用于比较基因组特征。生物信息学2010;26：841- - - - - -2。doi: 10.1093 /生物信息学/ btq033
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    34. ↵
      2. Bayard问，
      3. 莫尼耶l，
      4. PeneauC，等
      。细胞周期蛋白A2/E1的激活定义了一个具有复制应激重排特征的肝细胞癌亚类。Nat Commun2018;9：5235。doi: 10.1038 / s41467 - 018 - 07552 - 9
      OpenUrl
    35. ↵
      2. 金D，
      3. PerteaG，
      4. 杰尔C，等
      。TopHat2:在存在插入、缺失和基因融合的情况下精确排列转录组。基因组医学杂志2013;14：R36。doi: 10.1186 / gb - 2013 - 14 - 4 - r36
      OpenUrl CrossRef PubMed
    36. ↵
      2. 杰尔C，
      3. 罗伯茨一个，
      4. 高夫l，等
      。TopHat和Cufflinks的RNA-seq实验差异基因和转录物表达分析。Nat Protoc2012;7：562- - - - - -78。doi: 10.1038 / nprot.2012.016
      OpenUrl CrossRef PubMed
    37. ↵
      2. Sloutskin一个，
      3. DaninoYM，
      4. 奥伦斯坦Y，等
      。ElemeNT:用于检测核心启动子元件的计算工具。转录2015;6：41- - - - - -50。doi: 10.1080 / 21541264.2015.1067286
      OpenUrl CrossRef PubMed
    38. ↵
      2. NishikawaT，
      3. 在线旅行社T，
      4. IsogaiT
      。结合统计信息和与蛋白质序列的相似性预测人类cDNA序列是否含有起始密码子。生物信息学2000;16：960- - - - - -7。doi: 10.1093 /生物信息学/ 16.11.960
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    39. ↵
      2. 刘H，
      3. 汉H，
      4. 李J，等
      。预测人类序列中聚腺苷化信号的计算机方法。基因组的通知2003;14：84- - - - - -93。
      OpenUrl PubMed
    40. ↵
      2. Werle-LapostolleB，
      3. 鲍登年代，
      4. Locarnini年代，等
      。cccDNA在慢性乙型肝炎的自然史中持续存在，在阿德福韦酯治疗期间下降。胃肠病学2004;126：1750- - - - - -8。doi: 10.1053 / j.gastro.2004.03.018
      OpenUrl CrossRef PubMed
    41. ↵
      2. MroskeC，
      3. 里维拉H，
      4. Ul-HasanT，等
      。一种用于鉴定腺相关病毒反向末端重复序列突变的毛细管电泳测序方法。基因和方法2012;23：128- - - - - -36。doi: 10.1089 / hgtb.2011.231
      OpenUrl PubMed
    42. ↵
      2. 陈CL，
      3. 詹森RL，
      4. Schnepp公元前，等
      。感染儿童的腺相关病毒的分子特征。J性研究2005;79：14781- - - - - -92。doi: 10.1128 / jvi.79.23.14781 - 14792.2005
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    43. ↵
      2. Penaud-Budloo米，
      3. Le豹头王C，
      4. Nowrouzi一个，等
      。腺相关病毒载体基因组在灵长类肌肉中作为外体细胞染色质存在。J性研究2008;82：7875- - - - - -85。doi: 10.1128 / JVI.00649-08
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    44. ↵
      癌症基因组图谱研究网络。癌症基因组图谱研究N.肝细胞癌的综合和整合基因组特征。细胞2017;169：1327- - - - - -41。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    45. ↵
      2. 藤本一个，
      3. Furuta米，
      4. TotokiY，等
      。肝癌非编码和结构突变的全基因组突变景观和表征。Nat麝猫2016;48：500- - - - - -9。doi: 10.1038 / ng.3547
      OpenUrl CrossRef PubMed
    46. ↵
      2. KotinRM，
      3. Siniscalco米，
      4. SamulskiRJ，等
      。腺相关病毒的位点特异性整合。美国国家科学基金委1990;87：2211- - - - - -5。doi: 10.1073 / pnas.87.6.2211
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    47. ↵
      2. SamulskiRJ，
      3. 朱X，
      4. 肖X，等
      。腺相关病毒(AAV)在人19号染色体上的靶向整合。Embo J1991;10：3941- - - - - -50。doi: 10.1002 / j.1460-2075.1991.tb04964.x
      OpenUrl CrossRef PubMed
    48. ↵
      2. 溶血性尿毒综合征D，
      3. 哈立德D，
      4. 附近地区T，等
      。传染性腺相关病毒(AAV)在人外周血单个核细胞中的高流行率表明t淋巴细胞是AAV持续存在的部位。J性研究2017;91。doi: 10.1128 / JVI.02137-16
    49. ↵
      2. 李C，
      3. NarkbunnamN，
      4. SamulskiRJ，等
      。针对腺相关病毒的中和抗体在儿童血友病患者中的前瞻性检测。其他基因2012;19：288- - - - - -94。doi: 10.1038 / gt.2011.90
      OpenUrl CrossRef PubMed
    50. ↵
      2. 桅杆TC，
      3. Kiersteadl，
      4. 古普塔某人，等
      。人类预先存在腺病毒(Ad) 5型、6型、26型和36型中和抗体的国际流行病学:Ad5高滴度的相关性以及对潜在的艾滋病毒疫苗试验的影响。疫苗2010;28：950- - - - - -7。doi: 10.1016 / j.vaccine.2009.10.145
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    51. ↵
      2. 。施C，
      3. Rassenti楼主的，
      4. VanuraK，等
      。人疱疹病毒在慢性淋巴细胞白血病患者中的相对血清阳性率。欧元J临床投资2009;39：497- - - - - -506。doi: 10.1111 / j.1365-2362.2009.02131.x
      OpenUrl CrossRef PubMed
    52. ↵
      2. OzakiY，
      3. 在H，
      4. Tanaka-TayaK，等
      。各种肝脏疾病儿童肝脏中频繁检测到人类疱疹病毒6特异性基因组。临床微生物学杂志2001;39：2173- - - - - -7。doi: 10.1128 / jcm.39.6.2173 - 2177.2001
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    53. ↵
      2. 石川K，
      3. 长谷川K，
      4. NaritomiT，等
      。日本病因不明的暴发性肝炎患者肝脏中疱疹病毒和肝炎病毒序列的流行。杂志2002;37：523- - - - - -30.。doi: 10.1007 / s005350200081
      OpenUrl CrossRef PubMed
    54. ↵
      2. CermelliC，
      3. Concari米，
      4. CarubbiF，等
      。人疱疹病毒6在HEPG2细胞中的生长。病毒Res1996;45：75- - - - - -85。doi: 10.1016 / s0168 - 1702 (96) 01364 - 0
      OpenUrl CrossRef PubMed
    55. ↵
      2. Schnepp公元前，
      3. 詹森RL，
      4. 克拉克基米-雷克南，等
      。直接从人体组织分离的腺相关病毒的传染性分子克隆。J性研究2009;83：1456- - - - - -64。doi: 10.1128 / JVI.01686-08
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    56. ↵
      2. 公园KJ，
      3. 李J，
      4. 公园JH，等
      。腺相关病毒2介导的肝细胞癌在韩国患者中非常罕见。Ann Lab Med2016;36：469- - - - - -74。doi: 10.3343 / alm.2016.36.5.469
      OpenUrl
    57. ↵
      2. NaultJC，
      3. 茅草丛生的G，
      4. BalabaudC，等
      。肝细胞腺瘤的分子分类与危险因素、出血和恶性转化有关。胃肠病学2017;152：880- - - - - -94。doi: 10.1053 / j.gastro.2016.11.042
      OpenUrl CrossRef PubMed

    脚注

    • TLB和SI的贡献相同。

    • 贡献者研究设计:J-CN, JZ-R, TLB, SI。生成实验数据:TLB, SI, CP, IM, SD。数据分析与解释:TLB、SI、CP、IM、SD、QB、SC、TZH、EL、J-CN、JZ-R。收集样本及相关组织学和临床资料:J-CN、JZ-R、JC、GM、CG、VP、GA、AL、LP、LC、PB-S、J-FB和研究者。起草稿件:JZ-R, TLB, SI。审稿及审稿定稿:JZ-R、J-CN、TLB、SI、IM、SD、QB、SC、TZH、EL、JC、GM、CG、VP、GA、AL、LP、LC、PB-S、J-FB。

    • 资金这项工作得到了INSERM、INCa在ICGC项目内的支持、法国gcv、cancv (energitrans项目)、ITMO癌症AVIESAN(国家生命科学与健康联盟，国家生命科学与健康联盟)在癌症计划框架内(“HTE计划- hetcoli网络”和“癌症与环境计划”)、rcv国家CRB Foie、法国国家癌症控制联盟的支持。项目，seller Bettencourt“政变”，2018年巴黎癌症控制委员会，SIRIC CARPEM和msamrieux基金会，Labex OncoImmunology (investiement d ' avenir) ANRS和法国肝脏生物银行网络- inca, BB-0033-00085, Hepatobio bank。QB由HOB博士学院和教育研究部提供奖学金支持，TLB由IUH提供“attractive vit IDEX”奖学金支持，CP由ANRS资助的博士奖学金支持。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 数据共享声明本文报道的测序数据已存入Genbank(网址:KT258720-KT258730，MK139243-MK139299，MK163929-MK163942和MK231253-MK231264)和EGA (European Genome-phenome Archive)数据库(RNA-seq数据库:EGAS00001002879、EGAS00001001284和EGAS00001003310)。所有补充数据和序列可在http://zucmanlab.com/wp-content/uploads/2019/05/Zucman-CaptureVirusProbes.xlsx。