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背景-Antisecretory因子(AF)是最近确定的调控蛋白,抑制肠道液体分泌引起霍乱毒素。
的目标是——测试房颤的影响:(一个)引起的炎症和分泌过多毒素艰难梭状芽胞杆菌;和(b)形态变化和分泌过多引起的冈田酸(蓝贻贝毒素)在大鼠肠道粘膜。
方法观察形态学变化和流体积累在肠道循环挑战1μg毒素或3μg冈田酸之前或之后注射0.1μg重组AF (rAF)。
结果——细胞毒性和毒素引起的炎症反应与英国皇家空军在治疗后被废除前intraveneously或通过毒素或毒素后一小时。肠毒素引起的流体响应和冈田酸被英国皇家空军减少55 - 80%。然而,杯状细胞特征增加提示的绒毛在冈田酸治疗粘膜没有被英国皇家空军。
结论结果表明,房颤可能参与防止炎症和抵消肠毒素引起的脱水。这两个可能是介导通过肠神经系统的影响。
- 冈田酸
- 艰难梭状芽胞杆菌毒素
- 腹泻
- 神经肽
- S5a
- 老鼠
来自Altmetric.com的统计
细菌性肠毒素诱导液分泌和肠道炎症。一种致命的肠毒素性病是由毒素引起的艰难梭状芽胞杆菌一种细菌,通常它生活后肠道抗生素治疗。1毒素引起液体分泌、炎症和小肠粘膜损伤的仓鼠,兔子和老鼠2,3和pseudomembranous结肠炎的主要原因可能是男人。1在最初对寡糖受体,4,5毒素似乎穿透粘膜上皮,充当它葡萄糖残基转移酶蛋白ρ引起细胞骨架的重排。6,7最初cytophatic毒素对肠粘膜的影响是其次是炎症反应,可能通过神经对肠道肥大细胞和中性粒细胞介导作用。8,9
腹泻贝类中毒后出现在人食用贝类已污染的海洋浮游植物。冈田酸,病原体是由浮游生物和诱发腹泻、恶心和呕吐,没有任何炎症反应。10,11大鼠快速液体分泌毒素诱发12和伴随的脱落上皮细胞在肠道粘膜炎症或任何明显的上皮屏障的破坏。13冈田酸的细胞的作用是抑制细胞磷酸酶类型1和2,一个行动已经证明在上皮细胞,神经细胞和中性粒细胞。14,15
粘膜屏障防止细菌毒素的作用通过生理和免疫防御机制。之前我们已经表明,antisecretory因子(AF),产生一种蛋白质在脑下垂体和肠道粘膜,改变肠道分泌过多引起的细菌性肠毒素。因此,少量的猪房颤的作用能够抑制多种肠毒素的猪16在大鼠,17,18包括热不稳定肠毒素霍乱弧菌和大肠杆菌的帮助下和毒素a抗体对房颤纯化从猪血我们可以克隆互补DNA(互补)和表达人类房颤大肠杆菌。19不到一个皮摩尔的齐次人类重组AF (rAF)表明抑制霍乱毒素诱导大鼠肠循环液分泌。摘要我们描述英国皇家空军的作用在液体分泌毒素引起的和冈田酸在大鼠小肠。英国皇家空军在毒素诱导细胞毒性的影响和大鼠肠道粘膜的炎症。
方法
重组ANTISECRETORY因素
人类皇家空军是表达大肠杆菌和纯化如前所述。19总之,谷胱甘肽的全长cDNA subcloned进S-transferase(销售税)表达载体pGEX-1λT(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典),和表达融合蛋白的纯化glutathione-Sepharose列(法玛西亚)和裂解与凝血酶洗提纯英国皇家空军的蛋白质。评估了蛋白质的纯度钠十二烷基硫酸盐(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳用考马斯亮蓝染色法。19
肠毒素
C固执的毒素是生产和纯化如前所述20.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和检查的同质性。冈田酸是一种礼物Lars Edebo教授,瑞典哥德堡。
大鼠肠循环测试
研究设计是哥德堡大学的伦理委员会批准。男性Sprague-Dawley老鼠(300±10 g),坐落在一个受控的环境中,实验前禁食20小时但免费的水。肠道分泌与“结扎圈”调查方法如前所述。21在乙醚麻醉下一个循环,大约10厘米长,是结扎在空肠。循环是挑战1.5毫升的磷酸缓冲盐(PBS;0.15 M氯化钠,0.05 M磷酸钠,pH值7.5)在对照组,与测试组3的冈田酸或0.5μgμgC固执的毒素,溶解在同样体积的PBS。两个0.1毫升μg皇家空军(实验组)和PBS(控制)管理通过阴茎背静脉静脉注射。动物们被允许醒来。挑战是五个小时的持续时间为冈田酸毒素A和90分钟,间隔基于早期的动力学研究中发现液体积累引起相应的毒素。在观察期结束后,老鼠被颈椎脱位牺牲,腹部被打开和循环切割出来。净液分泌(毫克/厘米)被减去估计的重量控制回路的循环实验。标本进行组织学检查(见后)被从每个循环。
动物组织
6组大鼠(I-VI)进行了研究,每组至少含有5个动物。老鼠作为控制受到1.5毫升的管腔内的PBS挑战结合静脉(n = 6)或管腔内的(n = 5) PBS注入。组我和V收到2毫升PBS通过静脉注射一些毒素挑战前10 - 20秒进入循环,而第二组和六世被注射了英国皇家空军在同一卷,由同一路线。第三组被注射rAF 60分钟后挑战与毒素,而第四组被注射前皇家空军通过挑战和毒素。
组织学检查
肠道壁进行的组织学调查所有实验组(组I-VI和控制没有毒素)。没有切断结扎纵向循环,长0.5 - -1.0厘米部分是从每个肠道准备的标本。标本被浸泡24小时在4%多聚甲醛固定在PBS稀释,之后,他们沉浸在7.5%蔗糖的解决方案。至少24小时后的孵化蔗糖溶液中,于干冰冷冻标本,和5μm厚低温恒温器部分的准备;至少5 - 10部分来自两个不同的部分的标本,至少10,最高20部分从每个标本。部分被沾过碘酸希夫试剂(PAS)根据常规组织学程序。最后,部分在水和安装在glycerol-gelatine冲洗。
统计分析
学生的t不成对的测试数据是用于数据的统计分析。
结果
定量评估的分泌的结扎空肠的循环
五个小时后的挑战C固执的毒素一分之一的结扎循环,有明显积液循环没有皇家空军(控制),而在英国皇家空军的存在(实验动物)反应显著降低(表1)。静脉注射和管腔内的皇家空军管理产生了类似的抑制反应毒素抑制(约60%);皇家空军前或后一小时毒素管理挑战导致相同大小的抑制(60 - 70%)。冈田酸液体反应的挑战是快速和短暂的,最明显的分泌物已经观察到后90分钟。如表所示1,这种液体反应也明显抑制了皇家空军(55%)。
形态学的结扎的循环
在所有实验组(表结扎循环1)受到形态调查后所面临的挑战。控制回路获得大鼠治疗系统,通过与PBS。图1显示的是不同的和不变的形态控制。严重受损肠道形态在无花果1B,五小时后显示结果的挑战C固执的毒素:50 - 70%的顶端部分的绒毛是完全破坏,肠道内腔充满细胞碎片。的体系结构的基底部分绒毛更完整,隐窝细胞可以看出随着粘膜肌层。注入rAF intraveneously(组2)保存肠道壁的严重破坏毒素(图1C);肠道壁的形态相似的控制。然而,与控制相比,有稍微脱落的上皮细胞和杯状细胞和一些小的顶端损害技巧的绒毛(未见在无花果1C)。黏膜的形态在第二组中,III, IV是相似的(第三和第四组不显示)。毒素引起的细胞毒性和炎症反应从而在整个废除与英国皇家空军给予静脉注射或治疗后通过前或后一小时毒素的挑战。冈田毒素不会导致大鼠小肠炎症但诱发特点再分配的上皮细胞和杯状细胞。13这些变化并没有阻止通过与英国皇家空军的治疗,类似的形态组织V和VI(没有显示)。
:(一)控制形态的结扎空肠的循环与PBS的挑战。的顶端部分绒毛(开放箭头)是明显的有条纹的对肠道流明(L),固有层(lp)是完好无损,隐窝细胞(cr)和粘膜肌层(mm)。黑色箭头指向黑彩色杯状细胞。(B)形态学结扎循环五小时后挑战与C固执的毒素a的上半身绒毛完全解体,和绒毛的这一部分的肠道形态学不能重建。肠道内腔充满细胞碎片。绒毛的基底部分显示了一个更完整的形态,随着隐窝细胞和粘膜肌层。(C)的完整保存和形态学的结扎循环尽管五个小时的挑战与C固执的毒素a系统注入重组antisecretory因素显著抑制毒素a的细胞毒性作用的上半部分绒毛形态完好无损;然而,在肠道内腔可以看到一些摆脱高脚杯和上皮细胞。形态进一步的基底部分绒毛和隐窝和粘膜肌层相同的控制。酒吧是100μm。
讨论
我们之前报道的英国皇家空军的抑制效果霍乱毒素诱导肠道液体分泌。本研究的结果表明,房颤从人类脑下垂体还能抑制肠道液体分泌毒素或冈田酸诱导的大鼠。这三种毒素不同于彼此的生化作用机理。毒素结合受体类似醣脂类B5或X25而霍乱毒素结合受体类似GM1神经节苷脂。22他们的细胞内目标结构和作用机制也不同,毒素和霍乱毒素侵袭性酶输送葡萄糖残基ρ和rac蛋白7和ADP ribosyl组织腺苷酸环化酶,23分别;冈田酸是一种丝氨酸/苏氨酸的特定抑制剂特定蛋白磷酸酶1和2。14应该强调,尽管我们生化作用的详细知识的三个毒素,它仍不清楚这些活动导致液体分泌和腹泻。
英国皇家空军治疗中和毒素的细胞毒性和炎症活动,进一步强调这些形态效应之间的密切关系和诱导分泌过多。3,8废除炎症反应和分泌过多的减少表明,英国皇家空军或肽的导数房颤可能被用作药物对肠道炎症和分泌过多。皇家空军没有抑制冈田酸引起的形态的影响,而它抑制毒素分泌过多引起的。杯状细胞的毒素诱导增加提示的绒毛13因此似乎发生诱导分泌过多的独立。
房颤的体外影响神经细胞表明它调节突触后的信号。24,25大部分的体内影响房颤可能解释为行动施加于神经反射,因为肠道液体分泌和炎症似乎受肠神经系统。因此霍乱毒素诱导液分泌受到抑制等神经肽神经肽Y,生长激素抑制素,和亲神经的药物,如安定药物,镇静剂和麻醉药。每股26到29神经元involvment肠毒素的影响一个最近被Castagliuolo建议等。8亲神经的药物如利多卡因和辣椒素已被证明逆向毒素介导的分泌和炎症。而霍乱毒素诱导分泌过多似乎通过5 -羟色胺,26毒素诱导分泌可能是由P物质和一氧化氮合酶。8,9因此,传入感官信号引发了霍乱毒素,毒素可能是不同的。房颤应采取行动的传出神经运动神经元激发整个黏膜上皮和可能控制流体运输。29日冈田酸研究少于其他毒素。导致humans-diarrhoea在贝类中毒症状,恶心,呕吐,腹痛11建议一个神经性的组件。此外,毒素被证明能抑制蛙坐骨神经的感觉神经轴突的再生。30.
细胞受体对房颤和可能引发的细胞内信号转导细胞相互作用是未知的。然而,AF像序列似乎包含polyubiquitin结合位点31日已被证明会导致致命的腹泻在小牛转染进入肠道粘膜的病毒载体。32泛素及其聚合物热休克蛋白在各种神经诱导33和炎症性肠34疾病。这些蛋白的表达在肠神经细胞可能导致P物质的释放或5 -羟色胺参与enterotoxic腹泻。肠道分泌过多和炎症的反动房颤可能因此造成其在肠神经细胞与polyubiquitin互动。