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背景- - - - - -尽管小肠克罗恩病一直怀疑分枝杆菌引起,分枝杆菌可能参与orofacial肉芽肿病(一些小)和口腔病变节段性回肠炎尚未研究。
的目标是- - - - - -随着生长缓慢副结核分枝杆菌已经涉及到小肠克罗恩病的病因学,这种分枝杆菌物种的潜在参与一些小和口腔病变节段性回肠炎了。
病人- - - - - -尝试发现一些小的有机体和口服克罗恩病组织样本,用聚合酶链反应(PCR)测定在档案福尔马林固定,石蜡嵌入式口腔组织部分来自30个病人,一些小的七与克罗恩病,12正常对照组。
方法- - - - - -PCR检测是基于使用的引物5′地区针对multicopy IS900 DNA的插入元素M类结核基因组。为了达到最大的灵敏度,进行了两轮PCR,扩增子证实通过印迹杂交digoxigenin贴上IS900 DNA探针。
结果- - - - - -没有一个和口腔病变节段性回肠炎的一些小样本阳性米副结核和正常对照组也是负的。
结论- - - - - -这些结果表明,M类结核不得一些小的主要病原学的代理或者口服克罗恩氏病病变,尽管使用石蜡嵌入组织与新鲜组织作为样本来源可能低估了真正流行的有机体。
- 口服克罗恩氏病
- 副结核分枝杆菌
- orofacial肉芽肿病
- 聚合酶链反应
来自Altmetric.com的统计
现在广为人知,慢性肉芽肿透壁的胃肠道炎症被认为是临床实体在1913年新西兰描述一种慢性肠道肠炎。1之后,1932年,克罗恩病描述区域回肠炎有别于肺结核被称为克罗恩氏病。2后来被证实,克罗恩病可能影响胃肠道的任何部分从口腔到肛门。克罗恩病影响到口中的第一份报告是由Dudeney 1969年,描述一个标签的颊粘膜36岁患者已知的克罗恩病。3
证明患者的口腔病变是常见的肠道克罗恩氏病和包括嘴唇肿胀有无裂隙、面部肿胀、全厚度牙龈炎,粘膜标签/鹅卵石,口腔溃疡,棱角分明的唇炎。4 - 6这些口腔病变可能早肠道症状多年。7各种研究无症状患者小肠克罗恩病的患病率呈现与口腔病变,这个范围从0到48%。8,9
Orofacial肉芽肿病Wiesenfeld(一些小)是一个术语等8描述实体在患者口腔病变类似克罗恩病临床和组织学检查,但是没有配套的胃肠道异常。一些小的设计包括肉芽肿疾病患者其他实体如克罗恩氏病、结节病和结核病已经排除。一些患者可能随后开发一些小的肠道克罗恩病的表现,因此recategorised。有人建议,可能很大程度上是由于一些小的IV型超敏反应不同的饮食和环境过敏原。10
Orofacial病变non-caseating granulomata活检患者可能出现和没有肠道克罗恩氏病。嘴的参与肉芽肿性炎症过程拥有令人兴奋的潜力而言,易于访问的活检和对治疗的反应。有鉴于此,考虑到文献支持参与的可能性副结核分枝杆菌在克罗恩病,11 - 14号的可能性M类结核参与一些小的病因学和口腔病变节段性回肠炎的调查。
聚合酶链反应(PCR)是一个高度敏感的和特定的技术已成功地用于检测M类结核DNA在克罗恩病组织。11 - 14号在目前的研究中,使用引物PCR针对multicopy IS900 DNA的插入元素米副结核基因组15进行DNA提取档案石蜡嵌入组织部分来自30个病人,一些小的七克罗恩病的患者,也12正常对照组。这是第一个研究调查的可能存在M类结核DNA和口服克罗恩病一些小的组织。
患者和方法
样本的选择
来自使用的样本收集处理和格拉斯哥举行牙科医院和学校。样本口腔组织石蜡标本,,组织病理学检查,分为一些小或口头克罗恩病的表现的基础上存在non-caseating granulomata类上皮细胞。三十7样本获得其中30例患者和7个来自一些小患者肠道克罗恩氏病。在每种情况下石蜡块显示的最佳示范granulomata被选为研究。十二个额外的正常控制患者的样本。在所有情况下重复样本获得的石蜡块,切两次。
组织处理和DNA提取
对于每一个样本由PCR分析,五10μm部分被削减。切片机的刀片之间彻底清洁切割不同样本的二甲苯,防止样品污染样品。石蜡部分被放置在1.5毫升离心管和DNA提取方法使用专为获得开发的分枝杆菌DNA石蜡部分如前所述。16简单,组织部分在二甲苯deparaffinised, 200年resuspendedμl蛋白酶K(200μg /毫升)/ 50 mM Tris-HCl, pH值8.3,孵化一夜之间在37ºC。样本在干冰冷冻了一分钟,煮8分钟,五分钟,放在冰和旋转两分钟去除不溶性的碎片。对于每一个PCR反应,40μl上层清液的使用。
PCR引物
使用的引物PCR (P90 +和P91 +)针对IS900 DNA的插入元素M类结核如前所述,17和类似于底漆P90 P91在另一项研究中使用11除了每个引物包含一个额外的六、七基地5′末端。引物序列5′棉酚GGGTGTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3′(P90 +;IS900 15-41)和5′核苷酸-GGCGTTGAGGTCGATCGCCCACGTGA颈- 3′(P91 +;IS900核苷酸427 - 401)。使用底漆的预期规模放大产品对P90 + / P91 + 413碱基对(bp)。PCR也用于生成一个内部IS900探针用于随后的印迹杂交。引物的序列用于探测器生成5′cc AGGGACGTCGGGTATGGC-3′(P25;IS900核苷酸53 - 72)和5′-GGTCGGCCTTA CCGGCGTCC-3′(P26;IS900核苷酸281 - 262),229个基点的预期放大产品。
聚合酶链反应
进行了PCR反应总额的100μl,本质上有条件如前所述。11,17每个μl中提取DNA, PCR由90μl PCR反应混合物组成1×PCR缓冲MgCl(氯化钾10毫米,1.5毫米2,1% Triton x - 100), 2.0单位Dynazyme我DNA聚合酶(Flowgen仪器有限公司,利奇菲尔德,英国),0.2毫米的四种deoxynucleotide三磷酸腺苷和引物P90 +和每个6 ng /μl P91 +。引物是与其他组件的反应混合物分离的一层蜡(DynaWax;Flowgen仪器有限公司)。这种热启动PCR方法能提高反应产物的特异性和收益率阻止反应开始,直到蜡融化后热循环的开始。在OmniGene PCR进行了热循环(Hybaid有限公司、特丁顿、英国)。循环条件由最初的变性步骤在94ºC五分钟,其次是40变性的周期在94°C五分钟,引物退火在58ºC两分钟,在72ºC三分钟和扩展,并最终在72ºC扩展步骤10分钟。第二轮PCR是使用相同的条件下,除了5μl第一轮产品是用作模板。
代的内部调查229个基点,PCR成立MgCl如上所述除外21.0毫米的浓度和引物对P25 / P26被用于一个一轮PCR。目标质粒DNA 10 ng pPN14包含克隆的M类结核IS900 DNA插入元素。在94ºC初始变性步骤后五分钟,30变性的周期为一分钟94ºC,引物的退火50ºC一分钟,在72ºC和扩展两分钟进行,紧随其后的是最后一个在72ºC扩展步骤10分钟。使用向导229 bp PCR产物纯化PCR预备净化系统(Promega公司、南安普顿、英国)。
PCR的灵敏度分析
PCR检测的敏感性由飙升从一些小的石蜡部分中提取DNA, PCR阴性M类结核DNA,用连续稀释10倍M类结核DNA在100 pg 1 fg。PCR是如上所述。
PCR质量控制
几个anti-contamination程序在执行时使用PCR。建立的PCR反应、热循环和post-PCR分析反应产物进行了在不同的房间。吸管过滤技巧被使用在所有阶段,除了当添加模板DNA在这种情况下,容积式技巧。积极的和消极的PCR控制包括每批样品分析;积极的控制是1 pg的使用米副结核DNA样本,而是和消极控制包含无菌水分子生物学成绩而不是样品。
为了作为内部控制的成功隔离PCR amplifiable DNA组织部分,放大β-haemoglobin基因的每个样本进行了分析使用嵌套引物PCR(如前所述)。18
琼脂糖凝胶电泳
PCR反应产物分离的电泳20μl整除2%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭(0.5μg /毫升)和视觉效果下紫外线(UV)照明。100个基点DNA梯(法玛西亚生物技术,米尔顿凯恩斯,英国)被用作标记大小。
印迹杂交
扩大产品在2%琼脂糖凝胶电泳如前所述,转移到带正电的尼龙膜(勃林格曼海姆,刘易斯,英国)南部的印迹。简而言之,凝胶被浸泡在准备吸去变性解决方案(0.5 M氢氧化钠/ 1.5 M氯化钠)2×20分钟之后,浸泡在溶液中和(0.5 Tris-HCl, pH值7.4/3.0 M氯化钠)2×20分钟。使用毛细管印迹转移DNA被转移到膜单元(Anachem有限公司、卢顿、英国)20×SSC (3.0 M氯化钠,0.3 M柠檬酸钠,pH值7.0)作为传输缓冲区。转让后,膜冲洗在2×SSC和DNA固定接触最佳剂量的紫外线能量在交联剂(uvc - 508;Anachem有限公司)。
膜在68ºC杂交过夜229 bp内部IS900 PCR产品贴上了digoxigenin (DNA标签和检测设备;勃林格曼海姆)在25 ng / ml标准杂交缓冲(N-laurylsarcosine阻塞试剂5×SSC, 1%, 0.1%, 0.02%钠十二烷基硫酸盐(SDS))。膜在室温下洗在2×SSC / 0.1% SDS 2×5分钟,并在0.1×68ºC SSC / 0.1% SDS 2×20分钟。免疫学检测根据制造商的说明进行使用anti-digoxigenin抗体结合碱性磷酸酶和比色检测4-nitro蓝色四唑氯/ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate颜色衬底。
结果
复制集的所有样本分析表明β-haemoglobin基因PCR积极性,放大显示的165个基点的产品,经过两轮的使用嵌套PCR引物对(数据未显示)。这表明,DNA提取成功对于每个组织样本分析,提取的DNA是足够的纯度和自由的PCR抑制剂,从而使其适用于随后的PCR分析。
PCR的灵敏度分析后两轮放大,10 fgM类结核DNA琼脂糖凝胶电泳检测(无花果1),这相当于两个分枝杆菌基因组。
:PCR产物的琼脂糖凝胶电泳(20μl)获得了PCR的灵敏度分析后两轮40周期放大与M类结核IS900引物P90 +和P91 +。提取tisssue DNA PCR - M的一些小样本就被掺入了连续10倍稀释副结核DNA。通道1 - 6 M类结核DNA在100 pg(巷1),10个pg(巷2),1 pg(巷3),100年fg(巷4),10 fg(5道),1 fg(巷6);莱恩100 bp DNA梯。
M类结核IS900 PCR进行复制的样本集。单轮后40 PCR循环使用M类结核IS900 P90 + / P91 +引物对,所有的样品都是负面的存在M类结核通过琼脂糖凝胶电泳和DNA印迹杂交,只有积极的控制生产产品413个基点(数据没有显示)。为了增加的敏感性试验,使用相同的第二轮PCR条件第一轮,但5μl第一轮产品模板。单个样本给一些小的PCR产物,有点小期待M类结核积极性(图2)。然而,这个产品没有污点南部229年bp IS900杂交探针杂交(无花果2B)。没有其他样本积极通过凝胶电泳和样品之前-琼脂糖凝胶电泳后两轮PCR表明印迹杂交后积极性。对于每个批组织样本分析,M类结核积极的控制一直是积极的和消极的控制总是消极的,通过琼脂糖凝胶电泳和印迹杂交。
:(A) 2%琼脂糖凝胶电泳选择PCR产品(20μl)从组织中获得DNA样本后两轮40周期放大与M类结核IS900引物P90 +和P91 +。莱恩100 bp DNA梯;通道2 - 8,一些小样本;道9 - 11,口服克罗恩病样本;道12 - 14,正常样本;巷15 - PCR控制;积极PCR巷16日控制。单一PCR产品从样品分析,获得比积极的控制规模略小的PCR产物,巷6所示。(B)相应的印迹杂交。的取向膜,通道1和16对应100个基点的DNA梯和PCR阳性控制通道,分别。 The PCR product in lane 6 did not hybridise to the probe.
讨论
本研究的目的是调查分枝杆菌参与一些小的可能性和口服克罗恩病组织样本。M类结核是一个缓慢生长的有机体,已被证明是慢性细菌性肠炎的病原体,19,20.反刍动物的慢性肠炎。由于极端文化试图隔离有机体中遇到的困难,许多调查人员利用PCR技术检测在病变组织。作为M类结核DNA曾被证明在多达72%的患者的肠道组织影响克罗恩病由PCR在几项研究中,11 - 14号似乎谨慎的调查可能存在一些小的分枝杆菌物种和口服克罗恩病组织。我们使用的引物PCR在这项研究中针对相同的5′IS900 DNA的插入元素的区域M类结核正如前面引物。11,17
我们的研究结果表明,在我们的病人M类结核似乎没有与一些小的口腔病变节段性回肠炎。经过两轮的40周期的PCR印迹杂交,所有组织样本被发现是负的。IS900 PCR分析我们使用类似于先前所描述的桑德森等11报道说,他们可以发现只要5 fg的M类结核DNA,相当于一个分枝杆菌基因组。我们已经证明,我们的试验是类似的灵敏度和检测10 fg的能力M类结核DNA。的事实,我们使用PCR分析,可以合理地预期一样敏感通过两轮PCR和印迹杂交,也没有组织样本呈阳性米副结核DNA很明显,至少在这项研究中,所使用的组患者中米副结核DNA是很少发现一些小和口服克罗恩病组织。然而,一个重要的考虑是感染的可能性,一些地区内的组织可能被排除在外时使用石蜡切片进行DNA提取和分析,而不是整个新鲜组织匀浆。嵌入在其他的研究中,当使用石蜡组织切片作为组织DNA来源只有7到13%的样本显示PCR积极性米帕拉-肺结核,13,14形成鲜明对比的积极性46 72%的利率获得当使用新鲜组织进行分析。11 - 13它显然是更难检测低丰度M类结核DNA在石蜡样品比使用新鲜的组织时,使用新鲜组织许可的DNA的提取更大体积的组织,因此增加的概率抽样离散感染的焦点。是最重要的扩展我们的研究通过分析石蜡嵌入式和,在可能的情况下,从患者新鲜组织或口头一些小的克罗恩病病变在几个英国的地理位置,以调查是否有改变生物的分布在不同的患者群体。
潜在的参与M类结核在克罗恩氏病是一个有争议的问题。虽然一些研究已经证明了的M类结核DNA在克罗恩病组织中,11 - 14号PCR的消极M类结核DNA在其他的研究报道。研讨会弗兰克和做饭21未能发现M类结核DNA的27克罗恩病组织样本检查使用嵌套PCR引物,而使用荧光PCR方法证明了消极的68克罗恩病组织样本分析。22在进一步研究中,PCR表明分枝杆菌的存在与类似的频率在克罗恩病的患者的肠道组织和正常的控制,尽管没有M类结核在任何样本DNA检测。23PCR的消极M类结核DNA也已获得在结节病的组织样本,24这是一个普遍肉芽肿疾病涉及多个器官和类似于分枝杆菌感染组织学检查。然而,无法排除其他分枝杆菌物种的参与,尤其是在对事实的看法结核分枝杆菌DNA被发现在支气管肺泡灌洗液25和脾脏26结节病的患者在其他研究。其他分枝杆菌物种的潜在参与一些小和口腔病变节段性回肠炎无疑值得调查。
以前使用的标准PCR协议可以进一步细化使用固相杂交捕获技术,最近被开发和应用于PCR检测M类结核和M鸟结核无性系种群。silvaticum。17固相杂交捕获的分枝杆菌DNA组织DNA提取前PCR可以显著地提高灵敏度和消除由于扩增子污染产生假阳性。这种方法应该证明有价值的检测低丰度的目标在组织样本的DNA序列,在试图识别及其应用M类结核DNA在口腔组织可能会进一步澄清任何病原学的角色这个有机体的可能性和一些小的口腔病变节段性回肠炎。
确认
我们感谢克罗恩氏在童年研究协会的财政支持。我们感谢教授约翰·Hermon-Taylor提供质粒pPN14。