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背景——确切的机制幽门螺杆菌感染导致胃粘膜损伤尚不清楚。
的目标是——评估体内是否H幽门提取物可以启动炎症反应在大鼠胃粘膜微循环。
方法提取的H幽门,大肠杆菌或蒸馏水的胃粘膜局部使用犀牛的动物。体内荧光显微镜评估大分子泄漏标记的白蛋白从粘膜血管,白细胞粘附/滚动,血小板活动90分钟。
结果- - - - - -H幽门诱导增加粘附血小板血栓(p < 0.001),分别为5和15分钟后循环血小板栓子。粘附血小板血栓(平均每视野四)仍显著增加在整个实验过程中,但循环栓子在30分钟(最多5个)随时间减少。没有发生白细胞粘附虽然早期瞬态观察。增加了11% (p < 0.02),白蛋白漏发生后仅5分钟。诱导的血小板聚集只是观察H幽门管理。
结论这在活体内研究证明的能力H幽门提取,促进胃粘膜微血管内血小板聚集。招募白细胞没有观察到。研究结果表明,早期的事件联系在一起H幽门感染与也许后续白细胞血小板聚集招聘通过激活血小板。
- 胃粘膜微循环
- 幽门螺杆菌
- 体内荧光显微镜
- 血小板聚集
- 白细胞
来自Altmetric.com的统计
的病理生理学幽门螺杆菌相关胃炎和消化性溃疡,特别是这种非侵入性细菌的机制诱导粘膜炎症,了解甚少。然而,许多体外研究表明,细菌表面蛋白,提取成水通过离心分离和涡方法,是中性粒细胞和单核细胞的趋化现象的。1 - 4体内大鼠肠系膜调查也表明,这些水提取物引起白细胞粘附和微循环的移民。5,6这些观察表明,H幽门新兵炎症细胞通过积极释放或被动地脱落细胞组件,进入粘膜吸收后,作为这些细胞化学引诱物。7
H幽门然而,感染是常见的局部胃,因此肠系膜内白细胞参与的结果可能不会反映在胃粘膜。本研究旨在评估体内提取的胃粘膜微循环的反应H幽门表面蛋白。体内荧光显微镜是用来确定H幽门可以引起白细胞滚动的改变和坚持,血小板活动,贴上白蛋白泄漏胃粘膜毛细血管和post-capillary小静脉(生活),并评估血管直径和血流的变化。改变这些microcirculatory参数特征的急性炎症8和已经改变了在其他模型引起的胃损伤的各种有毒代理人管理包括乙醇和非甾体抗炎药。9,10
材料和方法
的制备H幽门水提取
H幽门隔离,培养从胃窦的活检标本取自六活跃的十二指肠溃疡患者,收获到蒸馏水生产一个包含10个暂停9-10年10生物/毫升。细胞悬液是用五次冰上五秒30秒之间声波降解法,然后离心机在12 000 rpm 15分钟在4°C。最初的上层清液进一步离心机在18 000 rpm 30分钟和颗粒丢弃。最后的上层清液是存储在整除在-20°C到0.5毫升的使用。池的H幽门提取来自六个不同的患者避免应变变化,可能导致冲突的结果。因此,假定是,代表不同的表面使用的抗原制备和分泌组件发现在不同的H幽门菌株。控制提取大肠杆菌也准备使用池提取从六个病人产生一个暂停109-10年10生物/毫升。提取生产的方式类似H幽门。
动物
实验进行禁食成年雄性Wistar鼠(100 - 150 g)犀牛的皮下注射安定(5毫克/毫升)和Hypnorm(枸橼酸芬太尼0.315毫克/毫升和fluanisone 10毫克/毫升)在1:1体积为0.1毫升/ 100克体重。所有试验程序进行按照内政部批准。
外科手术
气管切开术是执行和食管的热敏电阻探针插入并连接到一个温度计(侥幸,华盛顿,美国)。套管是放置在左侧颈动脉,并连接到一个压力传感器和physiograph(美国路易斯维尔Micro-Med)监测平均动脉血压、心率,也为政府提供访问的荧光染料。
剖腹手术后1.0厘米的切口是由电动microcautery中间将器官由腹取出胃前壁的平行于“限制岭”(分离的鳞状细胞排列前胃远端腺胃)。是腺部分后的胃粘膜表面的观察。被小心地避免烧穿血管。
动物被放置在它的左侧到加热垫一个特殊的有机玻璃舞台上保持体温第35 - 37左右°C。玻璃显微镜幻灯片是安装在有机玻璃挂钩和胃慢慢延伸到它在地方举行的缝合。
在前壁切口开放使用microclamps允许可视化后粘膜表面。胃是保暖用保鲜膜覆盖,也一个不透水膜,防止脱水。
体内荧光显微镜
动物、变暖垫和有机玻璃Leitz则显微镜的董事会都被转移到阶段配备epi-illumination荧光光学显微镜的汞弧灯。立方体一个过滤器插入到汞弧灯的光路允许绿灯(530 - 560 nm)和蓝色(450 - 490 nm)为epi-illumination被选中。准备的图像检测,并且采用了冷却耦合装置的相机(CCD、日立)显示在一个高分辨率监视器(索尼pvm - 1443)和记录的视频(索尼slv - 373乌兰巴托)后脱机分析。每个实验之前所有仪器校准。
手术后,30分钟被允许对血压、心率、体温稳定。这些参数被监控每15分钟的其余部分的实验。稳定时期之后要么吖啶红,会发出荧光下绿灯(0.1毫升/ 100克体重)或异硫氰酸荧光素共轭牛血清白蛋白,蓝色灯光下,会发出荧光(FITC-BSA 0.2 ml / 100克体重)通过颈动脉插管注射。吖啶红标签白血球和FITC-BSA允许血液流动形象化。情况下导致微血管通透性增加大分子,FITC-BSA可以观察到泄漏的脉管系统的耀斑出现间质。间质荧光强度成正比的程度FITC-BSA血管渗漏。细节的方法和有效性体内一直在前面描述的技术。11,12
动物随机分为六组,接收H幽门,大肠杆菌或蒸馏水。三个地区的每只动物的胃粘膜被预选的观察。这些领域包括粘膜毛细血管和至少一个PCV确保这两个容器类型可以被评估。粘膜血流量的变化,大分子泄漏,容器直径进行了评估。(在吖啶红准备只有两个区域的粘膜观察由于贫穷分辨率荧光染料与FITC-BSA相比。)
五分钟后测量记录从所有选定区域政府的荧光染料。粘液出现在暴露前胃被一个和局部应用0.5毫升H幽门,大肠杆菌或蒸馏水,保持接触粘膜的90分钟时间实验。用于可视化的过程后黏膜表面允许测试提取外实验只是在暴露地区举行的前壁的边缘。后处理录音了五分钟后,然后每15分钟90分钟。
数据收集和量化
白细胞和血小板的活动
附着和连绵起伏的毛细血管内白细胞的总数和生活在每个视野决定脱机的录像带。血管内皮细胞的白细胞被认为是附着如果保持静止> 30秒。附着和滚动白细胞数量表示为每视野观察在一分钟时间内连续观察。与大分子泄漏实验,记录了在五分钟后处理,然后每15分钟90分钟。
吖啶红标签血小板和白细胞,血小板只能观察,一旦发生聚合。因此循环血小板聚集和粘附血栓观察在一分钟内也可以用数量来表示在同一地区。
大分子泄漏
为了量化FITC-BSA泄漏胃微循环,PCV的区域相邻三个部分和周围的三个独立的毛细血管被选中。计算机图像分析(美国媒体控制论专业形象+)是用来测量意味着间质荧光在实验的每个时间点。
容器直径和血流
测量直径的生活在和毛细血管也使用计算机图像分析和粘膜血管血流评估定性为正常,减少,或缺席。
统计分析
结果检测意义使用Mann-Whitney测试为非参数数据和成对的学生的t测试。p < 0.05的值被认为是具有统计学意义。数据中提出了方法(SEM)。
结果
H幽门提取物诱导血小板聚集在胃粘膜微血管(无花果1)。附着,但non-occlusive血小板血栓内只有粘膜毛细血管内,而不是生活在。显著(p < 0.001)的最大效应发生在当一个15分钟的意思是四个观察聚合物领域的观点。这是实验的持续期间。循环血小板聚集中观察到生活在15分钟后达到统计学意义(p < 0.001),但这种影响是短暂的,恢复正常/控制值在75分钟。既不大肠杆菌也不是蒸馏水血小板活性有明显影响。
:表面的附着和循环血小板聚集后胃粘膜血管暴露在H螺杆菌提取物。结果表示方法(SEM);n = 6。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。
图2显示的效果H幽门白细胞粘附和滚动。没有显著增加白细胞粘附。然而,滚动白血球的数量显著增加(p < 0.001) 5分钟,但这影响减少五分钟后。白细胞的变化活动中,并未观察到控制动物。
:表面的附着和连绵起伏的白细胞数量后胃粘膜血管暴露在H螺杆菌提取物。结果表示方法(SEM);n = 6。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。
增加了11% (p < 0.02)大分子泄漏从观察生活在五分钟后孵化的H幽门提取。值下降之后迅速接近那些见过蒸馏水(无花果3)。大肠杆菌有显著提高(7%;在泄漏40分钟p < 0.05)。蒸馏水没有显著改变大分子泄漏在任何时间点。类似的模式粘膜毛细血管中可观察到的事件。
:H螺杆菌提取物对大分子泄漏的影响标记的白蛋白从肤浅的胃粘膜post-capillary小静脉。结果表示方法(SEM);n = 6。* * p < 0.02, p < 0.05。
没有物质测试产生任何重大变化的粘膜生活在或毛细血管直径在实验过程中保持不变,尽管这项技术允许检测(值变化H幽门:生活在26.3(2.2)μm在五分钟和25.4(3.1)μm 90分钟;毛细血管12.9(1.1)μm五分钟和12.7(0.99)μm在90分钟)。尽管血流评估定性,没有可见的变化似乎诱导。生理参数、心率和血压,保持不变在实验的过程中对所有学习小组。
讨论
体内研究表明大鼠胃粘膜微循环的变化,以应对H幽门蛋白质的提取。最显著的影响是相当数量的循环血小板栓子的感应是独一无二的H幽门。瞬态高分子荧光标记的白蛋白泄漏也观察到。然而,白细胞坚持内皮,经常在体外和组织学研究,观察到的现象是没有显示。
显著增加大分子泄漏管理后立即观察H幽门。然而,研究肠系膜上显示出更大的作用在这个参数增加高达70%后30分钟。6这可能仅仅是由于肠系膜小静脉更大分子的渗透性比胃粘膜小静脉。6也有可能在胃里所谓的“泄漏”是一个人工制品带来的可能的耀斑从测试粘膜上的物质。然而,这似乎不太可能,因为细菌控制,大肠杆菌,诱导“泄漏”在不同的时间点,而蒸馏水,不断出现在粘膜,没有。Kurose等但是表现出显著的线性相关(r= 0.891)之间移民白细胞的数量和肠系膜白蛋白泄漏的程度。6随后单克隆抗体研究防止白细胞移民表明早期增加泄漏(10分钟)并不依赖于白细胞而后来增加(30分钟)白细胞相关的。缺乏白细胞活动或许可以解释为什么没有进一步增加泄漏并没有观察到。可能泄漏早期发现是由于一些机制在当前研究不涉及白细胞,也许肥大细胞介导。
显著增加大分子泄漏也观察到大肠杆菌。这种细菌的内毒素曾被观察到血管渗透性增加。13虽然它是大量的记录大肠杆菌内毒素产生出血胃粘膜病变,14小和瞬时泄漏的意义,作为两个在当前的研究中观察到大肠杆菌和H幽门,目前还不清楚。
粘液屏障的形成后续的局部管理H幽门用可以解释的瞬态性质的大分子泄漏和血小板聚集。这样一个屏障内将进一步抑制促炎的物质H幽门悬浮扩散穿过粘膜进入间质。此外,适应粘膜微循环治疗后可能发生的,或提取本身随着时间的推移可能会失去其趋药性的潜力。
依从性白细胞不是本研究的一个主要特点,这不同于之前的体内研究大鼠肠系膜上执行。5,6虽然立即和显著增加白细胞滚动被观察到,这是短暂的,可能不是生物学上重要的机制H幽门诱导损伤在这个特定的模型。同时,激活白细胞内皮墙通常是通过坚持与随后的外渗到间质。较长时间内的溢出H幽门用可能需要等引起白细胞活动的显著变化。的可能性存在白细胞实际上可能是目前在血小板聚集,虽然体内显微镜技术没有决议进行精确分析。然而,电子显微镜的组织(未发表的数据)表明,聚合纯粹是血小板。这不同于体内观察肠系膜上提取诱发platelet-leucocyte聚集的形成。6
差异这两个组织的反应床可能带来的差异分布的内皮细胞粘附分子的肠系膜和胃粘膜。这种建议似乎是合理的,如果白细胞是一个重要的组成部分H幽门引起骚乱,他们可能会表现出增加的活动。
最重要的是,这项研究表明直接血小板聚集的潜在作用H幽门引起胃粘膜炎症。现在承认自己血小板参与炎症反应作为炎症介质的有力来源和调节其他炎症细胞的活性。15早期的事件H幽门诱导炎症可能是诱导血小板聚集和随后的招募白细胞。事实上,一个重要的角色在炎症性肠病归因于血小板。16很有可能阻塞微血管的血小板血栓可能导致局部粘膜梗塞,因此组织坏死。
确认
巴德汉N氧化钾和本研究支持研究和教育信任;注册慈善328452号。