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  • 42卷，第6期
  • 大多数非溃疡性消化不良患者的胃中同时存在cagA阳性和阴性幽门螺杆菌:与组织学损伤相关

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幽门螺杆菌
cag正面和负面幽门螺杆菌菌株同时存在于大多数非溃疡性消化不良患者的胃中:与组织学损伤相关
免费的
  1. N Figuraag)ydF4y2Ba，
  2. C Vindignib，
  3. 一个Covaccic，
  4. L Presentib，
  5. D Burronic，
  6. R Vernillod，
  7. T Banduccid，
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  10. M Biscontriag)ydF4y2Ba，
  11. 年代Kristodhulluag)ydF4y2Ba，
  12. C Gennariag)ydF4y2Ba，
  13. D Vairae
  1. ag)ydF4y2Ba锡耶纳大学内科研究所，锡耶纳，意大利，b锡耶纳大学病理研究所，c虹膜,锡耶纳,d锡耶纳大学外科诊所研究所，e意大利博洛尼亚大学内科研究所
  1. N Figura博士，锡耶纳大学内科研究所，polilinico Le scott, viale Bracci, I-53100，意大利锡耶纳。

摘要

背景/目的感染与幽门螺杆菌菌株港湾cag基因(cagA+)与消化性溃疡和胃癌的风险增加有关。这项研究的目的是评估是否H幽门不同的分离株cag在非溃疡性消化不良患者中存在一种状态，是否为一个变量cagA状态与组织学胃粘膜损伤和腺细胞增殖有关。

方法-好的分离H幽门对19例非溃疡性消化不良患者的每个胃区域的原代板进行菌落(2 - 25个)检查cagA通过杂化。Western blotting用于检测CagA表达的代表性菌落和患者血清对CagA的抗体反应。免疫组化方法检测胃腺细胞增殖情况。

结果-在检查的747个菌落中，45.3%是cagA +。4例患者的菌落均为阴性cag2例患者的菌落均为A+cag−。13例患者(68%)两者均有cag+,cag发现了蜂群。分离株的CagA表达与其相关cag一个状态。H幽门3例患者存在不同CagA分子质量的菌株。基于所有19例患者的研究结果显示cag黏膜萎缩区(67.9%)A+菌落明显高于正常黏膜(44.7%)和慢性胃炎患者黏膜(44.0%)(p< 0.001)。高水平的细胞增殖与组织学萎缩伴或不伴肠化生相关，但与肠化生不相关cagA由生物在相同的粘膜部位定植。

结论-大多数非溃疡性消化不良的患者两者都感染cag+,cag一个−H幽门殖民地。的cag感染生物的状态可能在萎缩和肠化生的发展中起作用。

  • 胃炎;幽门螺杆菌感染
  • cag一个
  • 粘膜萎缩
  • 细胞增殖

http://dx.doi.org/10.1136/gut.42.6.772

数据来自Altmetric.com

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    幽门螺杆菌是一种螺旋形微生物，定植于人的胃上皮细胞，并诱导局部炎症和局部和全身免疫反应。如果感染持续，胃炎就会变成慢性并持续一生。胃粘膜的慢性炎症状态是胃十二指肠溃疡形成的决定因素，也是增加胃肿瘤(癌和非霍奇金淋巴瘤)风险的重要因素。1 - 3

    H幽门是一种主要病原体，因为它在胃上皮上的存在几乎总是与固体粘膜炎症反应有关。然而，分离株的致病潜力各不相同。如消化性溃疡患者多为细胞毒菌株感染，而浅表性慢性胃炎无溃疡者多为非细胞毒菌株感染。4 - 7几乎所有的细胞毒性菌株都表达一种叫做CagA的高免疫原性蛋白质，8，9最近的研究表明，消化性溃疡、肿瘤前和肿瘤性胃上皮病变患者更容易被CagA阳性(CagA+)菌株感染。卖地CagA+生物增强的致病潜力似乎存在于一种名为cag它含有与毒性有关的基因。14因此感染的细胞毒性或CagA表达H幽门菌株使患者感染最严重的胃十二指肠疾病的风险增加。

    一些研究人员最近描述了伴随的存在cag+,cag一个−H幽门同一病人体内的生物体。15 - 17日表型或基因型不同菌株的混合感染并不罕见。例如，细胞毒性和非细胞毒性H幽门大约三分之一的患者在同一活检样本中同时发现了菌株，11在13个被检测的感染个体中，只有两个在单个患者的不同胃区域(胃窦、体和底)发现了具有相同核型的菌株。18细胞毒性和占有cag一个基因是重要的特征，它可以使这些细菌优先在胃的某些区域定植，在那里它们可以享受选择性的好处。因此，获得更深入的流行病学cag+H幽门菌株，我们调查了:(ag)ydF4y2Ba)病人是否患有H幽门相关的非溃疡性消化不良在他们胃的不同区域，菌株的存在是不同的cag一个基因;（b)是否cagA+菌株优先在特定区域定植;（c)组织学评估的粘膜损伤是否与cagA+菌落分离自同一胃部位;和(d)胃腺细胞增殖水平是否与组织学结果的严重程度和/或与患有cag一种被殖民的基因H幽门生物。

    方法

    研究人群

    该研究是前瞻性设计的。研究对象为19名已知患有非溃疡性消化不良的成年非连续患者H幽门积极的。诊断H幽门采用市售的酶联免疫吸附试验(ELISA) (幽门螺杆菌免疫球蛋白G;迪斯，锡耶纳，意大利)。为避免因感染的临床表现不同而可能产生的偏差，只考虑内镜下无溃疡性和粘膜病变且怀疑为肿瘤的患者。入组患者未服用H2具有潜在活性的拮抗剂或药物H幽门(包括质子泵抑制剂)3个月，家族中有溃疡和癌症阴性史。

    内窥镜检查和H幽门培养与鉴定

    每次内镜检查时，从距离较近的区域取活检标本:从胃窦取4个活检标本进行培养、组织学检查、快速脲酶检测，并在酚紫红染色后进行显微镜检查;从标本中取3个标本进行培养、组织学和快速脲酶检测;2例取眼底(一例仅取体和眼底，因为患者因克罗恩病接受了部分胃切除术)进行培养和组织学检查。钳在活检之间消毒并在自来水下冲洗，并从一个位置更换到另一个位置。活检样本在融化的冰包围的盐水小瓶中运输，并在4小时内将5%马血、0.2%环糊精、10mg /l甲氧苄氨嘧啶、5mg /l万古霉素、5mg /l头孢磺丁和5mg /l双性霉素b接种到哥伦比亚琼脂上，在37°C的微氧环境中孵育7天，从第三天开始每天检查是否存在可疑菌落。疑似殖民地被认定为的殖民地H幽门如果细菌为革兰氏阴性弯曲棒或螺旋形，则氧化酶、过氧化氢酶和脲酶阳性，对头孢菌素敏感，对萘啶酸耐药(30 μg圆盘)。19

    杂交与cag一个探测器

    在每位患者的每个胃部位的原代培养板上分别培养2至25个分离良好的菌落，采用网格法在相同培养基上进行活检培养。在微氧条件下培养4天后，记录传代培养的生长程度。未完全发育的菌落未被考虑作进一步的分析。传代培养然后复制到硝化纤维膜上，变性，并与cag一个调查。20.该探针是通过放大一个非可变区域得到的cag一个跨越核苷酸1751-2048的基因。21引物D008 (5 ' -ATAATGCTAAATTAGACAACTTGAG CGA-3 ')和引物R008 (5 ' -TTA GAATAATCAACAAACATCACGCCAT-3 ')产生298 bp的产物21通过连续40个扩增周期:初始变性，94°C 5分钟(一个周期);变性，94℃下1分钟;引物退火，60℃1分钟;72°C延长1分钟(38次循环);变性，94℃下1分钟;一次退火，60°C 1分钟(一个周期);在72°C下延长5分钟。探针上有放射性标记32P使用由意大利米兰勃林格-曼海因意大利公司提供的随机引物DNA标记试剂盒。杂交在65°C下进行过夜。在2 × SSC(其中1 × SSC为0.15 M NaCl + 0.015 M柠檬酸钠)和0.2%十二烷基硫酸钠中，在65°C下洗涤两次后，在−80°C下将印迹暴露在XAR-5柯达胶片上过夜。H幽门CCUG 17874作为阳性对照cagA，菌株G21为阴性对照。21

    化验的cag一个表达式

    对每个患者的每个胃部位的第一个继代培养菌落的三分之一的细菌生长进行了检测，以确定其表达cag基因印迹技术的基因组产物。将密度约相当于Mac Farland 6不透明度标准的细菌悬液在Laemmli溶液中溶解并在100℃下变性5分钟，22将变性样品5 μl电泳于10%聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶中。22将蛋白质转移到硝化纤维片上，硝化纤维片在含0.1% Triton X (blotto)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用3%脱脂牛奶饱和。用重组CagA蛋白免疫兔获得的抗CagA和抗脲酶多克隆抗体在室温下孵育过夜21和纯化H幽门脲酶，分别以1:2000和1:8000稀释在印迹。在blotto中洗涤两次后，样品与用过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白G抗体在室温下孵育90分钟。用增强化学发光Western blotting检测系统(Amersham)观察反应。菌株CCUG 17874和菌株G21分别作为阳性和阴性对照。为了检测来自同一患者的不同水平CagA迁移的菌株，重复试验，并通过与菌株CCUG 17874和G39的比较来估计CagA分子质量，分别为128和136 kDa。8

    抗caga抗体检测

    的全细胞悬液H幽门菌株CCUG 17874 (CagA+)在Laemmli缓冲液中100℃裂解变性5分钟22然后用10%的聚丙烯酰胺凝胶和十二烷基硫酸钠电泳。将蛋白质转移到硝化纤维片上，用印迹剂饱和。切条，血清样品在1:200的blotto稀释下测定。在室温孵育过夜后，用印迹清洗条带，然后与过氧化物酶偶联的抗人免疫球蛋白G血清在室温下孵育90分钟。洗涤后，通过添加底物(H2O2在0.05 M Tris/HCl缓冲液，pH 6.8的4-氯-1-萘酚溶液中)。作为阳性和阴性对照，我们使用了分别感染CagA+和CagA−的两名患者的血清样本H幽门菌株(每个患者都检查了几个菌落)，并分别带有和不带有CagA抗体。此外，阳性对照血清在CagA分子质量(120-140 kDa)水平上不与任何抗原发生反应。8(数据未显示)。

    组织学

    胃活检标本置于10%缓冲福尔马林中，常规处理。切片用苏木精和伊红染色，并采用改进的吉姆萨法进行检测H幽门。炎症、活性和其他粘膜改变，如腺体萎缩和肠化生，由两位病理学家通过Sidney系统进行半定量评估。

    胃细胞增殖试验

    采用免疫组织化学方法，通过APAAP法评估增殖细胞核抗原(PCNA)的表达来确定胃细胞的增殖。简单地说，4 μm厚的石蜡包埋活检标本切片在PBS (50 mM Tris/HCl, pH 7.6, 0.15 M NaCl)中脱蜡并冲洗。切片用第一单克隆抗pcna抗体(PC10;小鼠IgG2a;Dako，米兰，意大利)1:30稀释。切片在PBS中清洗，并与1:30稀释的生物素化兔抗小鼠血清(Dako)孵育30分钟。切片再次在PBS中冲洗，碱性磷酸酶/抗碱性磷酸酶复合物(APAAP, D651;Dako)， 1:50稀释30分钟。PBS清洗后，将新品红作为显色剂分层于活检标本上，并将混合物孵育25分钟。然后用蒸馏水清洗切片，用苏木精反染色，脱水，并用水性安装介质(Aquatex; Merck, Darmstadt, Germany). Only gastric pits perpendicular to the epithelial surface were analysed. Each gland was scored for PCNA immunoreactivity under a light microscope at × 400 magnification. The PCNA labelling index is defined as the proportion of positively immunostaining nuclei expressed as a percentage of the total nuclei counted. Gastric mucosa glands were divided into upper, middle (isthmus), and lower regions. The PCNA labelling index was also calculated for each region of the gland.

    统计数据

    用χ进行单因素分析2用耶茨的修正测试，费雪的精确测试，还有t独立样本检验和Mann-Whitney秩和检验。以腺颈细胞增殖指数为因变量，协变量为百分比，采用多元回归模型进行多变量分析cag每个活检的A+菌落(作为连续变量)，组织学结果(正常，单纯慢性胃炎，慢性胃炎伴萎缩/肠化生)，胃部位(胃窦，体，底)。P <0.05被认为是显著的。

    结果

    研究人群

    表格1列出所研究的患者，以及其他细节。平均(SD)年龄57.42(16.59)岁，27-87岁。

    查看该表:
    表1

    与研究患者相关的数据、组织学结果、幽门螺杆菌菌落对cagA的占有以及每个患者每个部位腺峡细胞的增殖情况

    文化

    确定殖民的程度H幽门，培养来自胃不同部位的活检标本。共培养56个活检标本，54个标本为阳性H幽门积极的(表1）.H幽门19例患者中有17例从3个胃区(部分胃切除术患者的2个胃区)中分离出生物体。另一位患者的一个胃窦标本和一个眼底标本培养阴性(见表2)1）.

    检测cag杂交产生的基因

    本试验的目的是调查在个体患者的胃中可能同时存在的菌株，这些菌株与拥有的菌株不同cag一个基因，并决定是否cagA+菌有优先定植的区域。表格1给出了cag+,cagA -菌落来自每个病人的每个部位。总共747架H幽门从54个培养阳性活检样本中分离出的菌落进行了检查cagA.总共有339个菌落(45.4%)cagA+: 45.8%的菌落(108 / 236)来自窦部活检标本，51.4%的菌落(141 / 274)来自主体部位，42.2%的菌落(100 / 237)来自基底部位。当进行多重比较校正时，这些百分比无显著差异(χ2Bonferroni校正)。所有菌落来自患者2、5、9和15的活检样本1)cag+;患者14和17的所有菌落(表1)为cag)−。在其余13例(68%)中，cag+,cagA -生物同时出现。本组有2例患者(患者1和10)，其中一个或两个胃部位有菌落cag而来自其他网站的则是cagA+或混合，4例患者(患者4、6、8和19)的菌落来自单一位点cagA+，而其他网站的评分是混合的，cag+,cag−(表1）.数字1显示了两者同时存在的示例cag+,cagA -菌落在同一病人身上。

    Hybridisation with cagA probe of subcultures of different H pylori colonies from primary plates streaked with biopsy samples taken from two gastric areas from the same patient. All 16 colonies from the antrum and 18 of 21 from the corpus are cagA+ (six of 13 colonies from the fundus were cagA+; data not shown). The arrows indicate the cagA− colonies.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    用cagA探针杂交不同幽门螺杆菌菌落的传代培养，这些菌落来自同一病人的两个胃区域的活检样本。来自前庭的16个菌落和来自本体的21个菌落中的18个为cagA+(来自眼底的13个菌落中6个为cagA+;数据未显示)。箭头表示cagA -菌落。

    CagA表达式

    这次测试的目的是看是否占有cag与CagA蛋白表达相对应的基因。培养阳性活检标本54份;共检出54株。CagA的表述与占有一致cag在所有情况下都是基因。所有15cag经测试的A -菌株不能产生这种蛋白质。在三例病例中，从同一患者的一个部位分离的菌株的CagA分子质量与从其他部位分离的菌株的CagA分子质量不同2）.例如，从一个病人身上分离出的三种菌株中，图中的菌株2其中，1车道为CagA阴性，2车道和3车道为阳性，CagA分子质量分别约为135和130 kDa。

    Western blots showing , in three cases (lanes 1–3, 4–6, and 7–9), the simultaneous presence of H pylori strains with different CagA molecular mass in different areas of single patients. The strain in lane 1 was cagA−. The strains in lanes 10 and 11 were two cagA+ H pylori strains of similar CagA molecular mass isolated from two different gastric areas of a patient. The numbers on the right are the molecular masses in kDa of H pylori strains CCUG 17874 and G39.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    Western blot显示，在3个病例(1 - 3,4 - 6,7 - 9)中，在单个患者的不同部位同时存在不同CagA分子质量的幽门螺杆菌菌株。泳道1的应变为cagA−。第10道和第11道的菌株是两株cagA+ H幽门螺杆菌，cagA分子质量相似，分离自同一患者的两个不同胃区。右边的数字是幽门螺旋杆菌菌株CCUG 17874和G39的kDa分子质量。

    抗caga抗体检测

    进行测试是为了看看是否有任何对应的存在之间H幽门殖民地拥有cagA和每个患者的抗caga抗体反应。除1例(95%)外，所有患者均有CagA抗体(数据未显示)。活检标本只有cagA -菌落对CagA呈一周阳性。

    组织学

    表格1给出组织学数据。56例活检标本组织学检查发现12例黏膜正常，35例慢性胃炎无其他病变，9例轻度或中度萎缩，其中7例伴有肠化生，1例发育不良。

    的比例cagA+菌落和组织学结果

    这种相关性是为了看看是否存在一种关系之间存在的菌株，港口cag基因和定殖胃粘膜的组织学损伤程度。的百分比cag培养阳性部位(12个黏膜组织学正常的区域，34个轻度/中度慢性胃炎，8个腺体萎缩(其中6个伴有肠化生)的A+菌株分别为44.7,44.0和67.9 (p = 0.0001，萎缩/肠化生)v胃炎，优势比= 2.69，相对风险= 1.52)2）.所有菌落均分离自8个培养阳性活检样本中的6个，34个无其他病变的慢性胃炎样本中的5个，12个正常粘膜样本中的3个(表2)1)cagA+ (p = 0.039，萎缩v正常的粘膜;P = 0.001，萎缩v单是慢性胃炎;P = 0.347，慢性胃炎v黏膜正常(不显著);费雪精确测试)。

    查看该表:
    表2

    消化不良患者cagA+菌落的患病率与组织学发现的关系

    细胞增殖和组织学结果

    我们的目的是看看细胞增殖的增加是否与组织学损伤有关，是否存在菌落cag一个基因，或者胃的部位。表格3.给出累积的标签索引值。萎缩/肠化生活检标本的总标记指数和峡部标记指数分别为32.67(10.46)和21.67(9.10)(均值(SD))，显著高于单纯慢性胃炎(17.97(7.89)和11.34(6.01)或正常粘膜(表2)3.）.就腺基标记指数而言，未发现显著差异(数据未报道)。慢性胃炎标本与正常黏膜标本的标记指数差异无统计学意义。为排除胃部位本身对细胞增殖有影响的可能性，我们对单纯慢性胃炎(无萎缩)患者的胃窦、体部和眼底活检标本的细胞标记指数进行单因素分析比较，但差异不显著(数据未显示)。

    查看该表:
    表3

    根据组织学结果，培养阳性活检样品的胃腺细胞增殖情况

    的比例cagA+菌落和细胞增殖

    这种相关性是为了验证腺细胞增殖水平是否受菌落数量的影响H幽门生物拥有cagA.从所有人定植的胃部位取活检样本，细胞增殖指数未发现显著差异cagA+或全部cagA−螺旋杆菌- 13.21(9.5)和11.25(6.11)。两者在样本中的标记指数cag+,cagA -殖民地为12.30(6.15)。

    单因素分析得到的结果被多元线性回归模型证实，该模型表明，唯一与高增生性胃腺细胞评分独立相关的变量，即组织学结果，比例cagA+菌落和胃部位——组织学上——即萎缩/肠化生的存在(p<0.001)。

    讨论

    H幽门感染是消化性溃疡和胃肿瘤发展的重要决定因素。这种疾病发生频率的变化可能部分取决于细胞毒素产生和占有的差异cag一个基因H幽门。4，6，9，10，12，13大多数关于这些因素致病潜力的研究都是通过只检查一个菌落或集合菌落来进行的H幽门或者通过确定对空泡毒素或CagA蛋白的局部或全身免疫反应。然而，血清中VacA和CagA的阳性并不能决定胃中细菌种群的组成，单个克隆的特征不能推断所有在同一器官定殖的幽门螺杆菌。有证据表明，细菌表型多样性和基因组宏观或微观多样性可以存在于单个患者的胃中，11，18，23确定不同表达的菌株是否具有抗真菌活性是很重要的cagA可以在同一时间在相同的病人身上进行定植。许多研究人员已经解决了这个问题，但我们认为他们观察到的混合文化的频率可能被低估了，9，15—部分原因是，在某些情况下，在进行测试之前，聚集的菌落已经存储在−70°C。为了避免我们的结果被池中培养效率的差异所扭曲cagA+和cagA -菌株，我们测试cagA在每个病人的主板上有几个分离良好的菌落。我们的研究结果显示，三分之二的患者同时患有这两种疾病cag+,cagA -生物体，与凡·德·恩德得到的生物体是相容的等16一个家庭的成员(七名成员中的四名被庇护cag+,cagA -菌落)，并得到了早期关于基因组多样性的研究的支持H幽门从同一患者的不同胃部位分离出的菌株，一项研究表明，在13名意大利患者中，85%的人被不同核糖型的菌株定殖。18然而，后一项研究也表明cag+,cag来自同一病人的有机体可能是不同的菌株。18很难确定不同的菌株是否与cag一种状态是在一个群体中基本上基因组不同的克隆或变异:两个相伴的基因组不同的菌株可能都具有cag一个基因,15反之亦然，来自同一病人的菌株，在聚合酶链式反应后具有相同的指纹模式，可能在它们的cag一个状态。16

    高流行率cagA在患者中观察到的状态(89.4%v在西方国家进行的其他研究中占60%)6，9也许可以用遗传倾向来解释24和/或特别致命的cagA+菌株在这个区域。直到几年前，托斯卡纳省的居民都是相对隔离的，这可能导致了特别致命的菌株的选择，并有利于它们的传播。的高频率cag我们非溃疡性消化不良患者的A+状态可能与托斯卡纳地区胃癌发病率升高相一致:1990年(最新数据)为57.3/10万/年，25并且与观察到的感染病毒的人患胃癌的风险增加相一致cag+H幽门与感染病毒的人相比cag−菌株,26而且，更普遍的是，生活在有致命病毒的地区的人cag+H幽门菌株。13

    Western blotting结果证实cagA+和nocag所检测的A -菌株产生一种蛋白，该蛋白可与兔血清发生免疫反应，生成CCUG 17874型的重组CagA。这一结果表明cag一个基因几乎总是在我们的分离株中表达它的产物。因此，一个病人只有cag他胃内的A -有机体CagA检测呈阳性，可能表明目前或过去有其他混合感染病例(根据我们的经验，对CagA的全身性抗体反应可维持长达3年H幽门感染已治愈(数据未显示))。

    在三个病人的胃里cag一种混合感染并具有优势的cag在A+菌落中，我们注意到存在表达不同分子质量CagA的菌株(图2)2）.这一发现的意义尚不清楚。CagA分子质量的变化取决于其内部核苷酸重复序列的存在cag一个基因。21由于CagA在多次传代培养后分子质量稳定8(N Figura，个人观察)，来自同一对象的不同分子质量的CagA菌株可以认为是不同的。这一观察结果进一步复杂化的问题之间的基因组变异H幽门从单个病人中分离出来的。

    的高频率cagA+菌落出现在胃萎缩区，而在正常黏膜区cagA+菌落频率与无萎缩的炎症粘膜区域相似。这一发现可能表明cag胃粘膜上的A+菌株只有在cagA+菌落构成了在特定胃区域定居的大多数生物。

    在目前的研究和之前的调查中，-胃粘膜萎缩区峡部和总腺细胞增殖指数明显高于正常黏膜和慢性胃炎无萎缩区。尽管在细胞毒性菌株感染中有很高的增殖分数，30.即主要表达CagA的菌株8我们没有发现细胞增殖的统计学差异cag殖民生物的状态。

    调节胃细胞生长的关键机制还不完全清楚。在文献中，关于细胞毒素的产生和/或作用有相互矛盾的结果cag在体内或体外，分离株在加速胃细胞复制中起作用。30-33CagA或共同表示的因子cagA+生物可能会导致这些情况，如萎缩和化生转化，其特征是加速细胞生长。34，35一旦这些高度增殖的粘膜状态已经建立，PCNA表达的增加可能会独立地持续存在cag答:因此，我们假设该菌株具有致病性岛cag,的cagA是一个组成部分和标记，在疾病的后期可能没有那么强的影响。

    总之，我们发现大多数H幽门非溃疡性消化不良阳性患者均感染cag+,cagA -有机体同时存在。我们相信这个变量cag一种状态可能与感染的临床结果有关。在任何情况下，比较来自不同患者的具有某些基因组毒力决定因素的菌株的流行率，都需要分析从原始板中选择的多个分离株。

    致谢

    我们感谢Laura Bianciardi女士(锡耶纳大学图书馆助理)的帮助，以及Ruth Colapinto女士，Sovicille(锡耶纳)Villa Cetinale的经理，她纠正了我们的英语。

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