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背景/目的——基因启动子的细胞间粘附分子ICAM-1拥有几个转录因子结合位点,包括核因子κB (NF-κB)。NF-κB在ICAM-1基因调控的作用因此检查通过使用不同的蛋白酶体抑制剂在肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激IEC-6鼠肠道上皮细胞。
方法-ICAM-1表达式分析了酶联免疫吸附测定(ELISA),逆转录酶聚合酶链反应和免疫组织化学。稳态水平的细胞质IκB蛋白质免疫印迹进行评估,和核易位NF-κB决心的电泳迁移率改变分析和免疫荧光染色。细胞粘附是化验通过测量荧光标签的绑定MOLT-4细胞。
结果-TNF-α诱导ICAM-1 mRNA和蛋白表达IEC-6细胞,其次是增加MOLT-4淋巴细胞的粘附。阻塞TNF-α诱导IκBα退化与蛋白酶体抑制剂减少TNF-α诱导NF-κB激活和ICAM-1基因诱导和明显减少MOLT-4细胞粘附在不影响6月氨基端激酶(物/ SAPK)活动或新创蛋白质合成。
结论-TNF-α感应ICAM-1表达介导的转录因子NF-κB,可以抑制通过阻断IκBα退化。因此,IκB / NF-κB系统是一种很有前途的药物目标调制的粘附分子的表达和其他炎性肠中的基因。
- 粘附分子
- ICAM-1
- 细胞因子
- 肿瘤坏死因子α
- 肠道炎症
- NF-κB。
来自Altmetric.com的统计
渗透和持久性炎症细胞组织内炎性疾病的标志包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。1招聘和激活这些细胞炎症的焦点是多因素疾病事件涉及循环细胞血管内皮的粘附组织迁移紧随其后。细胞细胞和细胞基质相互作用是至关重要的元素在炎症和免疫反应和依赖于协调各种粘附分子的表达。2细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)积极参与介导白细胞粘附内皮和上皮细胞。2ICAM-1 (CD54)是一种细胞表面糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族的粘附分子2并结合β2整合素受体LFA-1柜台(CD11a / CD18)和MAC-1 (CD11b / CD18)。基底膜ICAM-1蛋白水平检测到几个人类肠道上皮细胞肿瘤(IEC)线;这个分子是由多种促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ。3 - 6最近,ICAM-1表情改变了人类iec已被证明是由细菌或细胞因子刺激,增强6和系统性管理的脂多糖调节小肠ICAM-1三倍,7尽管增强表达的位置不确定。表达式的ICAM-1 iec可能代表一个关键的步骤,它调节固有层淋巴细胞之间的相互作用,中性粒细胞和iec。许多细胞功能包括互动ICAM-1 MAC-1和LFA-1。例如,LFA-1 / ICAM-1通路参与MHC限制性抗原,8细胞增殖抗原和有丝分裂原,引发了9,10和T细胞介导的细胞毒性。11同时,封锁ICAM-1的中和抗体抑制中性粒细胞的粘附肠道上皮细胞层,6,12和在一个小的初步研究在一个单一的机构,ICAM-1反义寡核苷酸治疗被报道有一些好处在类固醇依赖克罗恩氏病,虽然毒性效应必须仔细分析。13因此,重要的是要理解在iec ICAM-1基因表达的调节细胞因子刺激来帮助指导合理开发粘附分子药理调节器的关键。
虽然ICAM-1基因启动子对于许多转录因子结合位点,包括sp 1、C / EBPb / NF-IL-6和核因子κB (NF-κB),突变分析表明,NF-κB结合位点的存在对ICAM-1子活动至关重要。14,15的转录因子NF-κB参与的快速诱导细胞因子和粘附分子与免疫和炎症反应。16,17这个因素是由几个不同的二聚体的Rel家族的成员,其中包括NF-κB1 (p50) NF-κB2 (p52), RelA (p65) RelB,:。17子单元的形成由NF-κB1和RelA是最频繁和活跃的NF-κB形式。18在大多数细胞休息,NF-κB存在于细胞质与抑制分子称为IκBs有关。19NF-κB / IκB复合物是隐藏在细胞质中,从而抑制NF-κB相关的基因表达。适当的刺激,包括白介素(IL) 1和TNF-α,20.,21ubiquinate磷酸化的激酶IκBα丝氨酸残基32、36。22磷酸化IκBα然后选择性地ubiquinated迅速退化通过non-lysosomal ATP依赖26 s蛋白水解复杂组成的700 kDa蛋白酶体。第23 - 25自由NF-κB然后转移到细胞核κB结合位点和诱导基因,包括促炎细胞因子、二类MHC抗原,包括ICAM-1和粘附分子。重要的是,NF-κB控制的表达自己的抑制剂。26激活NF-κB诱发IκBα基因,导致快速的补充IκB蛋白质,与NF-κB再次复合物,从而调节激活过程。26
我们最近发现,NF-κB调节细胞因子诱导引发表达式在本机和改变了iec和封锁IκBα降解抑制引发生产。27此外,我们还证明了基因表达下调促炎的可行性通过adenoviral交付一个NF-κB super-repressor iec。28因此,IκB代表一个潜在的肠道炎症药物治疗的目标。在目前的研究中,我们调查了相关信号通路TNF-αICAM-1基因表达的诱导非转换大鼠肠上皮细胞株IEC-6和调查IκB / NF-κB系统的角色在这个过程中与两个不同的蛋白酶体抑制剂通过抑制IκBα退化:N-acetyl-Leu-Leu-Nle (ALLN)和Z-Leu-Leu-Leu-H (mg - 132)。ALLN是一个块的半胱氨酸蛋白酶抑制剂calpain 1活动,但也能够抑制蛋白酶体复杂的chymotrypsin-like活动相对高剂量使用时(100 - 200毫米)。23,24,29-33肽醛mg - 132是一个比ALLN更强有力的和特定的蛋白酶体抑制剂。22 - 2429-34
方法
细胞培养
大鼠肠道上皮细胞非转换线IEC-6写明ATCC CRL(1592)使用通道3至15,生长在高葡萄糖杜尔贝科的修改鹰中(Gibco,宏伟的岛,纽约,美国有5%的热灭活胎牛血清(Gibco), 2毫米l谷氨酰胺、1 U /毫升胰岛素和抗生素(笔/链锁状球菌/ Fungisone, 1×;Gibco)。细胞培养在水饱和的气氛中95%的空气和5%的有限公司2。对于蛋白质或mRNA分析,3×105或5×105细胞分别被播种到six-well细胞培养板(2毫升/)(合演,剑桥,麻萨诸塞州,美国),增长到50 - 70% confluency播种后(通常1 - 2天)。中被删除和细胞preincubated ALLN(50μg /毫升;勃林格曼海姆,印第安纳波利斯,印第安纳州,美国)或mg - 132(5μg /毫升;肽国际,路易斯维尔,肯塔基州,美国)30分钟,之后他们刺激老鼠重组TNF-α(10 ng / ml;集,购买,美国纽约)。细胞生存能力在暴露于ALLN被台盼蓝染料排除测试和检查被发现超过90%。
代谢标记的细胞
IEC-6细胞在含有150μCi培养基中培养35S]蛋氨酸(1000 Ci /更易;ICN制药、科斯塔梅萨,美国加州)12小时有或没有各种剂量的mg - 132(20 - 40μM)存在与否TNF-α(10 ng / ml)。环己酰亚胺(50μg /毫升)被用作积极控制蛋白质合成的抑制作用。潜伏期结束时,细胞细胞溶解1×Laemmli缓冲区,和20μg蛋白质电泳在钠十二烷基硫酸盐(SDS) / 10%聚丙烯酰胺凝胶。凝胶是沾Coomassie蓝色,然后用水杨酸浸渍和暴露所述。35
RNA提取和放大的逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)
细胞(3×105/在six-well组织培养板;合演)使用ALLN(50μg /毫升)30分钟,然后用10 ng / ml TNF-α刺激为4个小时。采用试剂盒法分离出RNA (Gibco)根据制造商的规格。每个样本的完整性和质量检查与溴化乙锭染色。合成第一链cDNA使用1μg总RNA, 15 U RNA警卫队(法玛西亚,皮斯卡塔韦,新泽西,美国),1×第一链缓冲区(Gibco), 12.5毫米核苷酸(法玛西亚),125 pmol随机六聚物引物(法玛西亚),和125 U Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(Gibco)在最后一卷25μl。反应进行了一个小时在39°C 7分钟紧随其后在93°C,一分钟在24°C,在4°C,然后慢慢冷却20分钟。36PCR是一卷50μl包含5μl逆转录的混合物,1×Taq缓冲区(应用生物系统公司,培育城市,加利福尼亚,美国),每个引物0.4μM, 200μM核苷酸,和2.5 U热aquaticus保利merase(应用生物系统公司)。PCR是在9600年优秀的周期计(应用生物系统公司)为25至35周期监控的线性放大。ICAM-1的寡核苷酸引物是:(5′)5′-GATGCTGACCCTGGAGAGCA-3′, 3′5′-AGCACTTGCGGTCCACGATG-3′。肌动蛋白寡核苷酸引物是:(5′)5′-ACCACAGCTGACAGGGAAATCG 3′, 3′5′-AGAGGTCTTTACGCAT GTCAACG-3′)。放大产品的长度分别为409和280个基点。PCR温度是94°C用于45秒,30秒55°C, 72°C 90秒之后,延长10分钟在72°C。PCR产品(10μl)在2%的琼脂糖凝胶电泳含有溴化乙锭。负面的照片凝胶用宝丽来665年的电影(宝丽来公司,剑桥,麻萨诸塞州,美国)和扫描使用Silverscanner II PS v2.1a连接到一个电源Mac 8100/80计算机与Adobe Photoshop 2.5.1分析软件。消极的控制由管(一个)没有核酸或(b)RNA。
核提取物
细胞被镀(2×106细胞)在100毫米直径的菜肴(配角)和刺激与TNF-α30分钟(10 ng / ml)。然后他们被细胞溶解和核蛋白质制备如前所述。27
电泳迁移率改变分析(EMSA)
核提取物(2μg)与双链类孵化1 MHCκB网站(GGCTGGGGATTCCCCATCT),由电泳分离,分析了放射自显影法如前所述。27抗体supershift分析、核提取物与1 preincubatedμl RelA抗体针对的c端部分分子(大Gilbertsville,宾夕法尼亚州,美国)或1μl p50抗体针对核本地化信号部分的分子(sc - 144 x;圣克鲁斯生物技术;美国圣克鲁斯,CA)在室温下15分钟前绑定缓冲和调查。阻塞与非降解IκBα由一个adenoviral向量(Ad5IκB)进行描述。28
免疫印迹分析
细胞(3×105/在six-well组织培养板;合演)使用ALLN(50μg /毫升)或车辆30分钟,然后用10 ng / ml TNF-α刺激不同时期。的介质后,细胞细胞溶解1×Laemmli缓冲区,和20μg蛋白质SDS / 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。免疫反应性的IκBα使用增强化学发光检测光(ECL)检测设备(Amersham,阿灵顿高地,伊利诺斯州,美国)如前所述。27
IMMUNOFLUORESCENT检测RelA (p65)
细胞(1×105/ 35毫米直径的菜;合演)与ALLN preincubated(50μg /毫升)或mg - 132(5μg /毫升)30分钟,然后用TNF-α刺激30分钟(10 ng / ml)。然后他们被冰冷的甲醇固定为100%。阻止了使用25%无免疫力山羊血清(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟。兔子anti-RelA抗体(免疫山羊血清稀释1:200在25%)增加了30分钟,之后若丹明异硫氰酸盐共轭山羊anti-rabbit IgG抗体(杰克逊ImmunoResearch西树林,宾夕法尼亚州,美国)稀释1:10 0 25%无免疫力山羊血清添加了30分钟。RelA表达式与荧光显微镜观想。
淋巴细胞结合分析法
IEC-6细胞被播种到24-well盘子。confluency之后达到约70%,改变了媒介和一些井preincubated ALLN(50μg /毫升)或抑肽酶(10μg /毫升;勃林格曼海姆)30分钟前添加TNF-α(10 ng / ml)。孵化一个额外的16个小时后,淋巴细胞绑定决心如前所述。36短暂,MOLT-4细胞(1582年ATTC CRL),人类淋巴细胞细胞系,7-bis荧光标记2——(2-carboxyethyl) 5 - (6 -) carboxyfluorescein acetoxymethyl酯(BCECF-AM)(分子探针,尤金,俄勒冈州,美国)。贴上MOLT-4细胞(106/)培养IEC-6细胞孵育一小时37°C的RPMI没有血清培养基。与RPMI媒介三个洗后,磷酸缓冲盐(PBS)含2%诺乃清洁剂P40添加(500μl /),和混合物转移到试管。样本在485 nm,兴奋和排放测量在530海里。
酶联免疫吸附测定(ELISA) ICAM-1
IEC-6细胞被播种到96 -孔板和confluency增长到70%。中被改变和细胞培养16个小时TNF-α(10μg /毫升),一些与30分钟预孵化ALLN(50μg /毫升)或抑肽酶(10μg /毫升)。后来,执行ICAM-1如前所述的ELISA。36简而言之,和1%多聚甲醛固定细胞,阻止0.25%的明胶。第一个抗体是鼠标anti-rat ICAM-1抗体(Seikagaku美国,罗克维尔市,马里兰州,美国),稀释1:10 0,和二次抗体是一个山羊anti-mouse碱性磷酸酶结合抗体(Santa Cruz),稀释1:200。
免疫组织化学分析ICAM-1表达式
IEC-6细胞生长在玻璃盖玻片six-well盘子。刺激后的一些井TNF-α16小时,细胞被固定为100%冰冷甲醇10分钟。与PBS两个洗后,阻塞了山羊血清稀释为1%在PBS在室温下30分钟。幻灯片孵化了一小时在室温下用鼠标anti-rat ICAM-1抗体稀释1:10 0在老鼠PBS或非特异性免疫球蛋白(稀释至相同的蛋白质浓度鼠标anti-rat ICAM-1抗体在PBS)作为一个消极的控制。随后与生物素化的二次抗体和孵化项目预制亲和素、生物素化的酶复杂进行Vectastain ABC工具包(美国加州向量实验室,伯林盖姆)根据制造商的指示。颜色是由孵化与diaminobenzidine幻灯片5 - 10分钟(DAB)使用fast-DAB标签(西格玛化工有限公司)。根据标准协议与苏木精复染色进行。
完整的细胞提取
细胞被镀(2×106)100毫米菜肴和confluency增长到80%。PBS的细胞被洗,然后种植“血清饥饿”条件下(0.5%胎牛血清)48小时最后处理TNF-α(10 ng / ml)或者TNF-α+ ALLN(50μg /毫升)30分钟。这些细胞被刮用橡胶警察,用冰冷的PBS洗净,然后细胞溶解Dignam C缓冲MgCl(420毫米氯化钠,1.5毫米2,消息灵通的20毫米,pH值7.0,0.2毫米EDTA、25%甘油、0.5毫米二硫苏糖醇)含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(0.5毫米phenylmethanesulphonyl氟化物,0.1毫米p-nitrophenyl磷酸,β-glycerophosphate 0.04毫米,0.05毫米Na3签证官440毫克/毫升bestatin 2毫克/毫升抑肽酶,0.54毫克/毫升亮抑酶肽,0.7毫克/毫升抑肽素A)。溶菌产物在4°C旋转30分钟。细胞膜被颗粒状冷离心在14 000 rpm和丢弃。上层清液分为整除,储存在−80°C。整个细胞中提取的蛋白质浓度测定使用Bio-Rad蛋白质化验(美国加州Bio-Rad实验室、大力神)。
c-Jun n端激酶的测定(物/ SAPK)
物/ SAPK IEC-6细胞活动评估使用体外激酶试验如前所述。37谷胱甘肽重组S-transferase(销售税)-c-Jun蛋白质(氨基酸1 - 79)包含的激活域c-Jun,变异GST-c-Jun爵士63年和爵士73年突变Ala (GST-c-JunAA),或销售税蛋白质被利用为基质。25μg部分完整的细胞提取与5μg孵化基质蛋白与glutathione-Sepharose珠子。广泛的复合物的洗涤后,与[γ-激酶反应进行32P] ATP (4500 Ci /更易;ICN药品)。蛋白质的分离使用SDS /聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)凝胶(12.5%)和视觉效果/使用PhosphorImager量化分析。Coomassie染色被用来证明蛋白质加载。激酶化验进行重复使用完整的细胞提取物两个独立的实验。
结果
我们调查的规定ICAM-1 TNF-αIEC-6刺激细胞的基因表达研究激活IκB / NF-κB系统,这个系统阻塞的后果。我们首先分析了胞质NF-κB抑制剂的浓度,IκBα蛋白质,TNF-α刺激后在不同的时间点。IEC-6细胞被刺激的最佳剂量TNF-α(10 ng / ml)长达60分钟,和稳态浓度IκB蛋白质被西方墨点法测量在不同的时间点。免疫反应性的IκBα迅速消失在10分钟内TNF-α治疗和重新出现的60分钟(图1)。预处理IEC-6细胞的蛋白抑制剂放线菌酮完全阻止IκBα在60分钟的再现,这表明IκB补给是由于新的蛋白质合成(数据没有显示)。IκBα降解TNF-α刺激IEC-6与mg - 132细胞被预处理或ALLN(无花果1),抑制蛋白水解的乳沟IκBα没有干扰磷酸化。27,32,38-42
肿瘤坏死因子α的影响(TNF-α)刺激和选择性蛋白酶体封锁稳态IκBα浓度(A), NF-κB绑定活动(B), RelA (p65)亚细胞本地化(C)。(A)细胞使用mg - 132(5μg /毫升;左面板),ALLN(50μg /毫升;右面板),或中等仅30分钟,然后刺激与TNF-α0到60分钟(10 ng / ml)。总蛋白提取和20μg受到SDS /页面之后,免疫印迹IκBα使用ECL技术方法部分中描述。注意,IκBα标准用作控制包含七个额外的氨基酸(IκB-tag)与内源性上皮IκBα相比。(B)细胞如上所述进行处理或与Ad5IκB病毒感染12小时,然后用TNF-α刺激30分钟(10 ng / ml)。核提取物(5μg)检测κB绑定由电泳迁移率改变分析活动。抗体supershifting由箭头表示。(C)中描述的细胞被视为(A)和RelA本地化使用anti-RelA抗体后想起罗丹明共轭检测抗体。
退化的IκBαTNF-α刺激IEC-6细胞表明NF-κB易位到细胞核。我们确定的存在NF-κB TNF-α核的刺激有或没有mg - 132细胞预处理EMSA和免疫荧光染色。核提取物TNF-α刺激IEC-6细胞表现出强烈的DNA结合活性与核提取物来自如果细胞(无花果1B)。抗体supershifting分析表明,两种p50 / p65异质二聚体和TNF-αp50 / p50为诱导刺激IEC-6细胞(图1B)。核NF-κB活动强烈减少了mg - 132治疗(无花果1B)和在较小程度上ALLN(数据没有显示)。表达NF-κB super-repressor (Ad5IκB),这是抗磷酸化的丝氨酸丙氨酸突变和随后的退化,因为32和36岁的28完全阻塞TNF-α刺激NF-κB核电站绑定活动(图1B)。此外,使用RelA抗体免疫荧光染色显示核染色TNF-α治疗细胞与胞质染色的细胞从未经处理的介质(无花果1C)。核易位RelA大大减弱了mg - 132预处理(无花果1与ALLN C)。类似的结果(数据没有显示)。这些结果表明,TNF-α迅速激活NF-κB IEC-6细胞诱导IκBα退化,并且封锁IκBα退化的几种蛋白酶体抑制剂防止NF-κB活动。
然后我们调查了蛋白酶体抑制剂法案是否通过选择性地抑制IκBα退化或通过干扰更近端TNF-α信号通路。膜受体结合TNF-α信号转导通过多种第二信使包括物/ SAPK通路。43-45激活物/ SAPK导致c-Jun的磷酸化和激活。46,47ALLN测试NF-κB抑制的特异性,我们调查的活动物/ SAPK IEC-6细胞使用GST-c-Jun作为底物如前所述。44,46细胞提取准备从TNF-α刺激IEC-6细胞显示出两到三倍的刺激物/ SAPK活动(无花果2;通道1和3)相比,并没有被ALLN(无花果2;比较车道3和4)。用一只老鼠也获得了类似的调查结果主要肝星状细胞培养系统。48整个细胞提取物孵化与变异的衬底(GST-c-JunAA)或销售税本身没有活动(数据未显示)。这些结果表明,全球ALLN并不抑制TNF-α信号通路,但专门抑制IκB / NF-κB系统。
ALLN不会干扰肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导物/ SAPK活动IEC-6细胞。细胞用ALLN预处理(50μg /毫升)或中等仅30分钟,然后用TNF-α刺激(10 ng / ml) 30分钟。磷酸化谷胱甘肽S-transferase(销售税)-c-Jun蛋白质分离后得到使用SDS /页面使用PhosphorImager凝胶(12.5%)和量化分析。Coomassie染色是用来证实蛋白质加载相等。代表三个独立实验的结果。
ICAM-1基因启动子有潜力为NF-κB结合位点。因此我们检查的影响TNF-α刺激和蛋白酶体封锁ICAM-1 IEC-6细胞中表达。细胞用ALLN预处理或车辆30分钟,然后用TNF-α刺激了4个小时,之后ICAM-1 mRNA表达被rt - pcr进行评估。图中所示3(上半部分),ICAM-1 mRNA强烈TNF-α孵化后监管(比较通道1和2),几乎完全被ALLN治疗(比较通道2和3)。其他的蛋白酶体抑制剂mg - 132也引起了ICAM-1调节基因表达(图3较低的面板)。ICAM-1 mRNA积累的变化不是因为不平等的RNA在装货量以来co-amplified肌动蛋白mRNA(图显示的小变化3一个)。
ICAM-1基因表达的抑制蛋白酶体抑制剂IEC-6细胞以rt - pcr (A)和ELISA (B)技术。(一)细胞使用ALLN(50μg /毫升;上半部分),mg - 132(5μg /毫升;降低面板),或介质仅30分钟,然后刺激与肿瘤坏死因子α(TNF-α)(10 ng / ml)或中仅4个小时。提取总RNA,反转录,放大使用特定ICAM-1或肌动蛋白引物。PCR产品运行在2%琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色。这些结果代表三个不同的实验。(B)细胞被刺激与TNF-α(10 ng / ml)或中等仅16小时的存在与否ALLN(50μg /毫升)或抑肽酶(10μg /毫升)。免疫反应性的蛋白质合成ICAM-1测量方法部分中描述。数据代表的意思(SE)从四个样品。 *p<0.05 compared with control samples. This result is representative of three different experiments.
ICAM-1表达式也在蛋白质水平评估。IEC-6细胞被刺激与TNF-α(10 ng / ml) 16小时的存在与否ALLN(50μg /毫升)和ICAM-1蛋白质含量由ELISA测定。图3B显示TNF-αIEC-6细胞治疗导致ICAM-1蛋白质合成的重要诱导。这个监管ICAM-1蛋白质的生产完全抑制ALLN预处理细胞,符合我们的发现在mRNA水平(无花果3),丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶未能阻止TNF-α刺激ICAM-1蛋白质(图3B)和IκBα退化(数据未显示),演示的特异性ALLN ICAM-1基因表达。我们进一步证实TNF-α刺激ICAM-1 IEC-6细胞蛋白质合成的免疫组织化学分析。TNF-α治疗细胞(图4)显示增加ICAM-1染色相比,如果细胞(图4B)。没有观察到当非特异性免疫反应性小鼠免疫球蛋白(数据未显示)。这些结果表明,TNF-α诱发ICAM-1 mRNA和蛋白水平基因表达,这一过程是由蛋白酶体抑制剂抑制治疗。
肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱发ICAM-1蛋白质systhesis IEC-6细胞的免疫组织化学分析。细胞生长在玻璃盖玻片,然后用TNF-α刺激(10 ng / ml) (B)或仅在培养基培养(A) 16小时。使用anti-ICAM-1 ICAM-1抗体的细胞被染色的方法部分中描述。类似的结果在另外两个实验。
可能存在的蛋白酶体抑制剂调节新的蛋白质合成,因此防止流感下来ICAM-1 NF-κB独立基因诱导的机制。为了验证这一点,IEC-6使用介质或mg - 132细胞与[贴上标签35S]蛋氨酸12小时的存在与否TNF-α(10 ng / ml)。作为一个积极的控制,我们使用了蛋白质合成抑制剂放线菌酮(50μg /毫升)。图中所示5,mg - 132不抑制蛋白质合成的从头IEC-6细胞与细胞中几乎完全抑制放线菌酮处理。此外,没有蛋白质分解的迹象mg - 132治疗后注意到在Coomassie蓝色彩色凝胶(无花果5B)。这些数据表明,mg - 132基本不干扰蛋白质合成机械。由于ICAM-1是配体参与T细胞和中性粒细胞的粘附,我们下一个调查ICAM-1是否监管中发现IEC-6细胞会导致增加绑定的淋巴细胞细胞系(MOLT-4)和ALLN治疗是否会调整这个绑定。图中所示6的绑定MOLT-4细胞TNF-α刺激IEC-6细胞增加三倍相比,如果细胞。预处理与ALLN IEC-6细胞明显抑制这TNF-α诱导MOLT-4 IEC-6细胞粘附。无选择性的丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶未能阻止TNF-α诱导MOLT-4附着力,显示ALLN的特异性。
![Effect of MG-132 on IEC-6 cellular protein synthesis. Cells were starved for 60 minutes in medium without methionine and then labelled for 12 hours with 150 μCi [35S]methionine in the presence or absence of MG-132 or cycloheximide (CHX). Total protein was extracted and 20 μg subjected to SDS/PAGE. (A) Gel exposed to autoradiography or (B) stained with Coomassie blue as described in the Methods section. Similar results were observed in two other independent experiments.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/42/6/779/F5.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
在IEC-6 mg - 132细胞蛋白质合成的影响。细胞被渴望在媒介没有蛋氨酸60分钟,然后贴上与150μCi[12小时35S]蛋氨酸的存在与否mg - 132或放线菌酮(CHX)。总蛋白提取和20μg受到SDS /页面。(一)凝胶暴露于放射自显影法或(B)沾Coomassie蓝方法部分中描述。也观察到类似的结果两个独立的实验。
ALLN块肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导粘附IEC-6 MOLT-4淋巴细胞。添加了荧光标记细胞MOLT-4 TNF-α刺激IEC-6细胞使用ALLN(50μg /毫升),抑肽酶(10μg /毫升),单独或中等。荧光发射强度在细胞溶解产物洗后测量的方法部分中描述。类似的抑制是观察到另外两个独立的实验。
讨论
ICAM-1介导的白细胞粘附内皮和上皮细胞迁移到炎性病灶,可以参与各种疾病炎症的细化和持久性。ICAM-1被调查在许多细胞表达系统包括人类改变了iec、但在iec ICAM-1表达式的规定没有被确定。在这项研究中,我们首次展示ICAM-1基因表达是TNF-α刺激诱导的大鼠非转换IEC-6细胞。此外,我们表明,TNF-α激活NF-κB诱导迅速IκBα退化IEC-6细胞,并提供直接证据NF-κB中扮演着关键角色ICAM-1 TNF-α诱导的基因表达抑制的基础上ICAM-1表达式药理IκBα退化的封锁使用两个独立的蛋白酶体抑制剂。这些结果与协议的蛋白酶体抑制剂阻止ICAM-1培养的内皮细胞的表达。33,34
ICAM-1 mRNA积累强烈IEC-6细胞TNF-α刺激后的监管。这信使rna的积累是翻译成蛋白质,因为我们观察到两个感应ICAM-1合成由ELISA。这种感应是人类HT-29细胞很相似。3,4快速ICAM-1基因调节(4个小时)反对自分泌机制涉及其他细胞因子,特别是il - 6,因为ICAM-1和il - 6 mRNA表达的动力学相似TNF-α刺激IEC-6细胞。49,50确认增强ICAM-1 TNF-α刺激蛋白质合成和功能是由免疫组织化学染色和细胞粘附。IEC-6细胞粘附的淋巴细胞细胞系MOLT-4 TNF-α引起的强烈刺激,细胞粘附功能增加更大程度比ICAM-1蛋白质的感应。这可能表明ICAM-2等其他粘附分子的参与,ICAM-3或血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)中介的上皮细胞免疫细胞粘附后促炎细胞因子。
我们的研究显示,TNF-αIκBα的早期和完全退化刺激IEC-6细胞。这些结果与我们之前的对比观察,大多数人类改造和本地结肠上皮细胞,Caco-2细胞的例外,推迟不完整IκBα退化响应IL-1βTNF-α,尽管NF-κB核易位和抑制引发分泌IκBα退化的封锁。27因此IEC-6 Caco-2细胞有类似IκBα降解反应,比大多数iec更像是造血的细胞。
调制促炎的分子的合成是一个关键的战略下调节炎症过程中发现的各种疾病,如炎症性肠病(IBD)。许多细胞因子和粘附分子的合成是由NF-κB控制在转录水平。14,16,17我们的策略是抑制NF-κB活动,从而减少proinflammatoy基因表达通过阻断IκBα退化。这种方法在概念上优于阻塞个人炎症介质,因为它针对的是一个关键的转录监管机构的多种促炎基因,因此中断下游炎症级联。为了实现这一目标,我们集中我们的注意力集中在蛋白酶体复杂,参与IκBα退化。第23 - 25ALLN和mg - 132对蛋白酶体活性产生强烈的抑制作用,从而抑制NF-κB活动,尽管mg - 132是一个更具体的比ALLN蛋白酶体抑制剂,抑制了在剂量低至10μM。23,24,29-32重要的是,蛋白酶体抑制剂都不会干扰上游信号导致IκBα磷酸化。38,39我们表明,短的预孵化(30分钟)和两个与不同的特异性蛋白酶体抑制剂可以阻止TNF-α诱导IκBαIEC-6细胞几乎完全退化。的快速抑制IκBα退化(10分钟)表明ALLN和mg - 132法案参与IκB预先存在的蛋白酶降解,可能chymotrypsin-like活动。IκB退化封锁的后果减少NF-κB激活,EMSA和免疫荧光观察到,和几乎完全抑制ICAM-1 mRNA表达,蛋白质合成和淋巴细胞绑定活动。当ICAM-1表达式被ALLN MOLT-4 IEC-6细胞粘附是几乎完全废除。
粘附分子的表达活性IBD患者被报道。51潜在的iec生产ICAM-1可能影响肠道炎症的发生。例如,交互的iec白细胞可以调节iec的激活状态。52,53此外,一个ICAM-1反义寡核苷酸是有效预防和逆转结肠炎动物模型。54ICAM-1人类IBD的相关性的初步报告显示的功效ICAM-1反义寡核苷酸治疗少量的类固醇依赖或耐火克罗恩病的患者。13初步研究显示激活的NF-κB活跃的克罗恩病,溃疡性结肠炎,炎症控制与不活跃的炎症性肠病和正常对照组相比。55,56我们以前显示的封锁IκBα退化强烈抑制细胞因子诱导引发由iec分泌,27从而消除白细胞迁移的关键趋化信号。57这些体外保护作用的初步报告符合急剧衰减的实验肉芽肿性结肠炎体内蛋白酶体封锁。58因此广泛阻塞的粘附分子的表达和促炎基因与蛋白酶体抑制剂可以非常有效的治疗效果。
有力的抑制p65展示出了反式激活因子EMSA和间接免疫荧光法。有趣的是,RelA (p65)是主要NF-κB亚基调停ICAM-1诱导内皮细胞的基因转录。15因此我们相信,几乎完全抑制核RelA易位和RelA DNA结合活动可能解释的总封锁ICAM-1基因表达。支持这个概念的戏剧性的体内效应p65 (RelA)反义寡核苷酸治疗实验性结肠炎。59
ALLN的特异性和mg - 132 IκB / NF-κB系统评估在几个水平。首先,我们调查的影响ALLN TNF-α早期事件的信号转导级联通过测量物/ SAPK的激活。的磷酸化c-Jun已被证明是一个重要的步骤在激活的转录因子。46,47增加重组GST-c-Jun构造的磷酸化TNF-α刺激IEC-6细胞指示物/ SAPK活动增加。这TNF-α诱导激酶活性不是ALLN抑制的治疗。其次,我们看着丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶的能力,不具备任何anti-proteasome生物活性,阻止ICAM-1基因表达。抑肽酶未能抑制TNF-αICAM-1诱导蛋白质,以ELISA,并没有阻止诱导淋巴细胞粘附IEC-6细胞。第三,一个高度选择性的蛋白酶体抑制剂,mg - 132,有相同的活动。第四,总蛋白质合成并不是被mg - 132。这些结果反对非特异性的抑制作用在TNF-αALLN和mg - 132在IEC-6细胞信号通路。
总之,我们的结果表明,TNF-α调节ICAM-1 IEC-6细胞的基因表达。NF-κB ICAM-1诱导中起着重要作用,如通过抑制ICAM-1当IκB基因表达和功能退化是选择性地阻止。我们相信,抑制促炎的分子通过瞄准IκB / NF-κB系统代表了一个令人兴奋的和有前途的肠道炎症性疾病的治疗方法。
确认
这项工作得到了国家卫生研究院的基金47700年DK, DK 34987年,26774年人工智能,和通用汽车41804年。C H被德意志的资助支持Forschungsgemeinshaft(他2458/1-1)。