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摘要
背景-成纤维细胞生长因子5 (FGF-5)属于一组有丝分裂和血管生成肝素结合生长因子，但其在慢性炎症中的潜在作用尚不清楚。
目标-比较FGF-5在正常胰腺和慢性胰腺炎(CP)患者胰腺中的表达，并表征TAKA-1细胞中FGF-5的表达和分泌，TAKA-1细胞是一种不朽的叙利亚仓鼠胰管细胞系。
方法与结果-Northern印迹显示在正常和CP组织样本中均存在4.0 kb FGF-5 mRNA转录本。密度分析表明，CP组织样本的转录水平比正常组织样本增加了1.44倍(p=0.039)。通过免疫组化和原位杂交，FGF-5在正常胰腺导管和胰岛细胞中有微弱表达。相反，在CP组织样本中，FGF-5在导管、腺泡、胰岛细胞以及导管周围成纤维细胞中大量表达。Northern印迹法检测FGF-5在TAKA-1细胞中也有表达。通过肝素-sepharose沉淀物的免疫印迹，TAKA-1细胞可以向培养基中分泌FGF-5。
结论外分泌和基质来源的FGF-5有可能参与自分泌和旁分泌途径，这可能有助于慢性胰腺炎的病理生物学。
- 慢性胰腺炎
- 成纤维细胞生长因子
- 原位杂交
数据来自Altmetric.com
成纤维细胞生长因子(FGFs)是一组同源肝素结合多肽，参与多种生物过程，包括刺激成纤维细胞增殖和血管生成。1FGF家族目前由14个成员组成:酸性FGF (aFGF或FGF-1)，碱性FGF (bFGF或FGF-2)， FGF-3 (int-2)， FGF-4 (hst/kFGF)， FGF-5, FGF-6，角质细胞生长因子(KGF或FGF-7)，雄激素诱导生长因子(AIGF或FGF-8)，神经胶质激活因子(GAF或FGF-9)， FGF-10，2以及FGF-11 - 14，也称为FGF同源因子1-4。3.，4基于NIH 3T3成纤维细胞与人类肿瘤DNA的转染研究，FGF-5基因最初被发现是一种具有转化潜力的人类致癌基因。5FGF-5编码一个糖基化的267氨基酸蛋白，该蛋白含有疏水n端序列，允许其从其起源细胞分泌。6它在许多人类恶性肿瘤中过度表达，包括肝癌和膀胱癌、子宫内膜癌和胰腺癌。6 - 8
虽然已知FGF-5在炎症细胞中表达，8FGF-5在慢性炎症中的潜在作用尚不清楚。因此，在本研究中，我们描述了FGF-5在慢性胰腺炎(CP)中的表达，这是一种胰腺炎症性疾病，最终可能导致外分泌和内分泌功能障碍。9伴随胰管肿大、假导管增生、实质损失和腺泡细胞变性，功能性实质显著被纤维化取代，并伴有成纤维细胞增殖和炎症细胞浸润。10我们现在报道FGF-5在CP中的表达增加，在结缔组织中的导管、腺泡、胰岛细胞和成纤维细胞中。此外，它由TAKA-1细胞表达和分泌，TAKA-1细胞是一种永生的仓鼠胰管细胞系。
方法
患者和组织样本
正常人体胰腺组织样本(来自4名男性和2名女性;中位年龄24.5岁，22-44岁)通过捐赠计划获得。慢性胰腺炎组织样本来自1名女性和8名男性(中位年龄50岁，范围33-60岁)接受胰腺手术的患者。11胰腺腺癌组织样本来自10名女性和6名男性患者(中位年龄64岁，范围44-77岁)，他们正在接受最近描述的胰腺癌手术。8在手术切除时，样本要么立即冷冻在液氮中，并在−80°C保存，直到RNA提取，要么在Bouin溶液中固定18-20小时，然后包埋在石蜡中进行组织学分析。涉及人体组织的研究得到了德国乌尔姆大学伦理委员会和美国加州大学欧文分校人体受试者委员会的批准。
细胞培养
TAKA-1永生叙利亚仓鼠胰管细胞是美国内布拉斯加州奥马哈市内布拉斯加州大学Parviz Pour博士的礼物，在Dulbecco改良Eagle 's /F12培养基中培养，37°C，加5% CO的湿空气2．培养基含青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，胎牛血清5%。
Northern blot分析
如前所述，进行北方印迹。12提取总RNA，对大小进行分离，电转移到尼龙膜上，并在高严格条件下与306 bp的人FGF-5 cDNA片段进行杂交。8以190 bp小鼠7S cDNA为加载对照。12cdna被标记为[α-]32P] dtp (3000 Ci/mmol)。扫描得到的自放射片，并计算每个样品的RNA水平的光学密度之比(FGF-5:7S)。8
免疫组织化学
如前所述进行免疫组化。8简单地说，4 μm石蜡包埋组织切片采用链霉霉素过氧化物酶技术(Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.， Gaithersburg, Maryland, USA)免疫染色。在脱蜡和阻断内源性过氧化物酶活性后，切片在23℃下与10%正常兔血清孵育15分钟，然后用高度特异性的山羊多克隆抗人FGF-5抗体(1/100在含1% BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA)在4°C中放置16小时。8用生物素化兔抗山羊IgG二抗和链霉亲和素过氧化物酶复合物(Kirkegaard & Perry)检测结合抗体，以四盐酸二氨基联苯(DAB)为底物。用于胰岛素染色豚鼠多克隆抗猪胰岛素抗体(1/1000 in含1% BSA的PBS;Dako公司，Carpinteria, California, USA)，与人胰岛素交叉反应，与10%正常山羊血清孵育后使用生物素化山羊抗豚鼠IgG二抗(Kirkegaard & Perry)。切片用梅耶尔苏木素反染。省略一抗或用未免疫的山羊血清代替一抗进行孵育，均未产生任何免疫反应。
原位杂交
将组织切片置于3-氨基丙基甲氧基硅烷涂层载玻片上，脱蜡，在23℃用0.2 N HCl孵育20分钟，在37℃用20 μg/ml蛋白酶K孵育15分钟。8然后将切片在含4%多聚甲醛的PBS中固定5分钟，并在PBS中用甘氨酸(2 mg/ml)淬灭两次。然后在50% (vol/vol)甲酰胺/2×生理盐水柠檬酸钠(SSC)中孵育1小时。混合缓冲液含有0.6 M NaCl、1mm EDTA、10mm Tris-HCl (pH 7.5)、0.25%十二烷基硫酸钠(SDS)、200 μg/ml酵母tRNA、1× Denhart 's溶液、10%右旋糖酐硫酸盐、40%甲酰胺和50 ng/ml地高辛标记的FGF-5核探针。将100 μl混合缓冲液涂于每一段，然后在42°C湿润室中孵育16小时。免疫学检测采用Genius 3非放射性核酸检测试剂盒(Boehringer, Mannheim, Germany)。然后用50%甲酰胺/2× SSC在50℃下洗涤30分钟，2× SSC在50℃下洗涤20分钟，0.2× SSC在50℃下洗涤20分钟，0.1× SSC在50℃下洗涤30分钟。用缓冲1溶液(100 mM Tris-HCl和150 mM NaCl, pH 7.5)简单清洗切片，并在缓冲1溶液中用1% (wt/vol)的阻断试剂在23°C下孵育60分钟。用缓冲液1短暂洗涤后，切片在23°C下用含有0.2% Tween 20的碱性磷酸酶偶联多克隆绵羊抗地高辛苷Fab片段1/2000稀释后孵育30分钟。然后用含有0.2% Tween 20的缓冲液1在23°C下清洗切片两次15分钟，并用缓冲液3 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl平衡2(pH值9.5)浸泡两分钟。然后将切片与含硝基蓝四氮唑和X磷酸盐的彩色溶液在暗箱中孵育2至3小时。用Tris-EDTA (TE)缓冲液停止反应后，将切片安装在水性安装介质中。
fgf-5蛋白的纯化及免疫印迹
如前所述进行FGF-5蛋白纯化。7，8TAKA-1细胞在T75烧瓶中含5% FBS至90%融合度的完全培养基中生长。用Hank’s缓冲盐水冲洗2次后，在含抑肽蛋白50 μg/ml、白细胞素10 μg/ml、蛋白酶抑制素A 10 μg/ml、苯甲脒10 μg/ml的10 ml无血清培养基中培养48 h。从5个烧瓶中收集条件好的无血清培养基(50 ml)，将pH调至7.4，加入50 μl的肝素sepharose浆液，4℃孵育过夜。含抑制剂的无血清培养基(50 ml)作为阴性对照，含抑制剂和500 ng重组FGF-5 (Sigma Chemical Co.， St Louis, Missouri,USA)的无血清培养基(50 ml)作为阳性对照。用0.45 M NaCl/20 mM Tris-HCl (pH 7.4)清洗床层三次，进行12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫染色用高特异性FGF-5抗体western blotting。8
统计数据
数据用中值和范围表示。Mann-Whitney秩和检验(双侧)用于研究中位mRNA表达水平的差异。p值小于0.05为显著性水平。
结果
FGF-5 mRNA在正常胰腺和慢性胰腺炎中的表达
从6个正常和9个CP组织样本中分离出的总RNA的Northern印迹显示存在报道的4.0 kb和1.6 kb mRNA转录本。即使在放射自显影照射14天后，6个正常胰腺组织样本中有3个检测到相对低水平的4.0 kb转录本(图2)1)．相反，在9个CP组织样本中的5个中，4.0 kb转录本以相对较高的水平表达。此外，在9个CP样本中，有4个样本的1.6 kb转录本在原始放射自显像仪上很明显1)．在三个CP组织样本中还可见一个较大的条带(约6 kb)，其意义不明。这种mRNA转录本可能代表剪接变异或同源RNA物种，以前也在一些胰腺癌组织样本中观察到。8northern印迹的密度分析表明，与正常胰腺组织样本的相应水平相比，CP中4.0 kb FGF-5转录水平的中位数增加了1.44倍(p=0.039)。
FGF-5 mRNA在正常胰腺和慢性胰腺炎中的表达使用306 bp人FGF-5 cDNA片段进行总RNA (20 μg/lane)的Northern印迹，随机标记[α-]32P] dtp (750,000 cpm/ml;14天曝光)。小鼠7S cDNA探针与人7S交叉反应，作为负载对照(40000 cpm/ml;6小时曝光)。rRNA标记显示在右边。
fgf-5在胰腺组织中的免疫组化
在正常胰腺中，用高度特异性的抗人FGF-5抗体免疫染色显示导管细胞细胞质中存在微弱到中度的FGF-5免疫反应性(图2)2A,C)，血管平滑肌细胞(未显示)，大导管周围的导管周围成纤维细胞(图2C)。胰岛细胞表现出微弱和弥漫性FGF-5免疫反应(图2A，箭头所示)，而腺泡细胞无FGF-5免疫反应性。正如预期的那样，许多胰岛细胞对胰岛素强烈阳性，而导管和腺泡细胞缺乏胰岛素免疫反应性(图2B).在CP组织样本中，在增生性导管细胞的病灶中观察到中度至强的FGF-5免疫反应性(图3.A，由实箭头勾勒)，是这种疾病的特征。中至强的FGF-5免疫反应性在腺泡细胞中也很明显3.A，由开放箭头勾勒)，胰岛细胞(未显示)，以及结缔组织内的成纤维细胞(图3.A，实箭头)。浸润纤维化组织的巨噬细胞FGF-5免疫反应性也呈强阳性(未显示)。
正常胰腺FGF-5的免疫组化。(A)在许多形成小导管的导管细胞(箭头)中存在微弱的FGF-5免疫反应，在较小程度上，在胰岛细胞(箭头)中存在。(B)使用抗猪胰岛素抗体与人胰岛素交叉反应，在连续切片中定位内分泌胰岛(箭头)。形成小导管的导管细胞(实型箭头)缺乏胰岛素免疫反应性。(C)较大导管的导管细胞和周围基质中的成纤维细胞中存在中度FGF-5免疫反应性。(D)无一抗的阴性对照无阳性免疫反应。原始放大倍率:×500 (A,B);×1250 (C, D)。
FGF-5在慢性胰腺炎中的定位和表达。(A)免疫染色显示导管细胞(实箭头)、腺泡细胞(开放箭头)和成纤维细胞(箭头)的细胞质中FGF-5免疫反应性中等至强。(B)一系列切片的原位杂交分析显示导管细胞(实箭头)和成纤维细胞中有轻度至中度的FGF-5 mRNA信号，腺泡细胞(开放箭头)中有中度至强烈的FGF-5 mRNA信号。感觉FGF-5探针(C)未显示任何信号。原始放大倍数:×500。
我们之前报道过FGF-5 mRNA水平在胰腺癌中升高。8与癌细胞区相邻的胰腺实质经常表现出所谓的cp样改变，包括导管细胞增殖、腺泡细胞变性和胶原蛋白、成纤维细胞和基质成分水平的增加。因此，我们研究了这些cp样区域是否表现出FGF-5免疫反应性。在癌旁增殖导管细胞的病灶中观察到FGF-5免疫反应性增加(图2)4A).基质成纤维细胞(图4A)和巨噬细胞(图4A，实箭头)在这些cp样区域也表现出中等至强烈的FGF-5免疫反应性。为了排除炎症细胞中可能丰富的固有过氧化物酶的非特异性染色的可能性，我们也使用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和新紫红素代替过氧化物酶标记的链霉亲和素和DAB系统。两种方法对FGF-5染色结果相似(图2)4B)。
FGF-5在胰腺癌样本中与癌细胞相邻的慢性胰腺炎样区域的定位和表达。(A)免疫染色显示增殖的导管细胞、成纤维细胞和浸润的巨噬细胞(箭头)的细胞质中FGF-5具有中度至强烈的免疫反应性，但在丰富的结缔组织基质中没有。(B)用碱性磷酸酶标记的链菌亲和素和新品红素对连续切片进行免疫染色，也显示增殖的导管细胞、成纤维细胞和浸润的巨噬细胞(箭头)具有中度至强烈的FGF-5免疫反应性。(C)一系列切片的原位杂交分析显示，增殖的导管细胞和成纤维细胞中有中度FGF-5 mRNA信号，巨噬细胞中有强FGF-5 mRNA信号(箭头)。相比之下，感觉FGF-5探针(D)没有显示任何信号。原始放大倍数:×250。
fgf-5在胰腺组织样本中的原位杂交
为了确定FGF-5的合成部位，对一系列切片进行原位杂交。在正常胰腺中，导管细胞和胰岛细胞中只有微弱的FGF-5 mRNA信号(未显示)。在CP组织样本中，导管细胞中存在微弱到中度的FGF-5 mRNA信号3.B，实箭头所示)，胰岛细胞(未显示)，纤维组织中的成纤维细胞(图3.B)。在增殖导管细胞和纤维化组织病灶附近的部分萎缩腺泡细胞中观察到中度至强烈的FGF-5 mRNA信号(图3.B，由开放箭头所示)，也在浸润的巨噬细胞中(未显示)。癌组织样本的cp样区域在腺泡和胰岛细胞、成纤维细胞和浸润性巨噬细胞中显示了类似的FGF-5 mRNA表达模式(图2)4C)。然而，与CP组织样本相比，FGF-5 mRNA信号在导管细胞中更强，在更多的成纤维细胞和巨噬细胞中观察到(图4C,箭头)。原位杂交与FGF-5探针没有产生任何特定的信号在正常胰腺(未显示)，在CP(图3.C)，以及胰腺癌的cp样区域(图4D)。
fgf-5在taka-1胰管细胞中的表达和分泌
FGF-5基因编码一种糖化蛋白，其中包括快速分泌的前导序列。6然而，尚不清楚相对分化良好的外分泌细胞是否能分泌FGF-5。因此，我们接下来试图确定FGF-5是否在TAKA-1永生化叙利亚仓鼠胰管细胞系中表达和分泌。从TAKA-1细胞制备的总RNA的北方印迹显示存在高水平的1.6 kb FGF-5 mRNA转录本和低水平的3.1 kb转录本(图2)5A).来自COLO-357细胞的RNA，已知表达4.0 kb FGF-5转录本，8作为阳性对照。为了显示TAKA-1细胞分泌FGF-5，对TAKA-1细胞无血清条件培养基中的肝素-sepharose沉淀物进行western印迹，显示29,31,31.5和33kda的条带(图5B)，对应于分泌的FGF-5蛋白。7相反，重组FGF-5作为29 kDa蛋白迁移(图5B)。
![Expression of FGF-5 mRNA in the normal human pancreas and in chronic pancreatitis. Northern blotting of total RNA (20 μg/lane) was carried out using a 306 bp human FGF-5 cDNA fragment, randomly labelled with [α-32P]dCTP (750 000 cpm/ml; 14 day exposure). A mouse 7S cDNA probe, cross reactive with human 7S, was used as a loading control (40 000 cpm/ml; six hour exposure). rRNA markers are shown on the right.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/43/1/134/F1.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
TAKA-1叙利亚仓鼠胰管细胞FGF-5 mRNA表达及FGF-5蛋白分泌(A) TAKA-1细胞(lane 1)和COLO-357人胰腺癌细胞(lane 2，阳性对照)的总RNA (20 μg/lane)使用人FGF-5 cDNA探针(750,000 cpm/ml, 4天暴露)进行northern blot分析。以小鼠7S cDNA探针作为加载对照(40000 cpm/ml;8小时曝光)。rRNA标记显示在右边。(B)使用特异性抗人FGF-5抗体(0.8 μg/ml，暴露45分钟)，对TAKA-1细胞的2天条件无血清培养基(lane 1)、无血清培养基(lane2)和含500 ng FGF-5的无血清培养基(lane 3)中的肝素-sepharose沉淀进行Western印迹。分子质量标记显示在右边。
讨论
FGF-5是一种肝素结合糖蛋白，对成纤维细胞和内皮细胞具有有丝分裂活性。6，7最初，人们认为它的表达仅限于发育过程中的某些组织。13随后，它也在成纤维细胞中被检测到，14骨骼肌细胞，15在成年人中也是如此16还有嗜神经组织。13，17然而，最近的研究表明FGF-5在肝癌、膀胱癌和胰腺癌细胞系中表达，6，8，18，19培养的畸胎癌细胞聚集物，20.还有人类胰腺癌。8FGF-5也被证明对人胰腺癌细胞有丝分裂。8总之，这些观察结果表明FGF-5可能参与了某些类型恶性肿瘤的致癌过程。
在本研究中，我们通过免疫染色和原位杂交的一系列切片显示，在CP中，FGF-5蛋白和mRNA存在于胰腺的几种不同类型的细胞中，表明FGF-5是在这种炎症状态下产生和分泌的。免疫染色显示，与正常人胰腺相比，CP组织导管和腺泡细胞中FGF-5蛋白水平升高。此外，通过原位杂交在CP腺泡细胞中观察到中等到强烈的FGF-5 mRNA信号，这表明在这种细胞类型中观察到的免疫反应性是由于FGF-5合成增强。相比之下，在导管细胞中可见微弱到中度的FGF-5 mRNA信号。鉴于在这种细胞类型中观察到的强免疫染色，这些数据表明CP中的导管细胞表现出减弱的FGF-5降解能力或增强的内化相邻腺泡细胞和成纤维细胞释放的FGF-5的能力。有趣的是，胰腺癌CP样区增殖导管细胞的病灶同时显示出强的FGF-5免疫染色信号和强的原位杂交信号，表明这些细胞与CP中的导管细胞相比具有更强的合成FGF-5的能力。观察到分化良好的TAKA-1叙利亚仓鼠胰管细胞系表达并分泌大量FGF-5，加强了这种可能性。
在TAKA-1细胞中检测到四种蛋白质的原因尚不清楚。这种异质性的一种可能是FGF-5部分是由差异糖基化产生的，正如先前在培养成纤维细胞中报道的那样。7或者，也有可能不同的FGF-5物种是由不同的FGF-5 mRNA部分合成的。为了支持这一假设，我们在TAKA-1细胞中观察到两个FGF-5 mRNA转录本。虽然不同分泌的FGF-5蛋白的生物学功能尚未确定，但我们的观察表明FGF-5可以促进CP患者胰腺中的自分泌和旁分泌相互作用。据我们所知，这是第一篇将FGF-5与慢性炎症性疾病的发病机制联系起来的报道。
在CP和CP样癌病变中FGF-5表达增加的分子机制尚不清楚。在这些类型的细胞中，FGF-5的合成可能是由于其他生长因子和细胞因子的过量产生导致异常旁分泌循环的结果。为了支持这一假设，已知FGF-5 mRNA在人成纤维细胞中的表达是由转化生长因子α和表皮生长因子诱导的，14其在CP和胰腺癌中的表达都有所增加。12，21
酸性FGF和碱性FGF在CP中也过表达。这两种生长因子都定位于萎缩性腺泡细胞和假导管化生区域，但不在成纤维细胞中。22此外，与FGF-5相比，酸性FGF和碱性FGF不能有效分泌。1因此，我们的观察提出了酸性和碱性FGF在CP中主要以自分泌方式发挥作用的可能性。相反，在CP中外分泌成分和基质成纤维细胞中FGF-5的相对丰度表明FGF-5在CP中可能参与自分泌和旁分泌调节途径。总之，这些观察表明FGF可能通过多种机制促进CP中的纤维化和炎症活性。提高了旨在废除FGF依赖通路的模式最终可能在这种慢性疾病中发挥治疗作用的可能性。
致谢
这项工作得到了由美国国立卫生研究院授予M Korc的公共卫生服务基金CA-40162的支持。M Kornmann是德国科学研究院1716/1-2博士后奖学金获得者。我们感谢F Gansauge博士(乌尔姆大学)提供的一些组织标本和Parviz Pour博士提供的TAKA-1细胞。