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摘要
背景- na -养分共转运引起细胞旁通透性改变的意义存在争议。以往的研究大多采用体外方法或在手术肠道操作后立即进行体内方法测量肠道通透性，因此可能不适用于正常生理状况。
目标-确定正常生理条件下钠耦合营养转运的激活是否增加肠通透性。
方法-在无约束、未麻醉、长期置管的雄性sd大鼠中，用两种不同的方法测量na -营养素共转运对肠道通透性的影响:测量被动吸收的己糖、甘露醇和l葡萄糖;并测定了甘露醇:尿素的扩散比。
结果- - - - - -l葡萄糖和甘露醇的吸收没有增加d-葡萄糖、丙氨酸、麦芽糖或多肽。甘露醇:尿素的扩散比没有增加d葡萄糖。存在d-葡萄糖在肠腔内维持20分钟没有改变肠通透性。
结论-在正常生理条件下，钠耦合营养转运不会增加肠道通透性。
- 肠道通透性
- 紧密连接
- paracellular吸收
- Na-nutrient协同转运
数据来自Altmetric.com
na -养分共转运引起细胞旁通透性改变的意义是有争议的。1，2尽管一系列研究表明细胞旁通透性增强，经粘膜阻抗降低，紧密连接形态改变，但这些研究是在肠道手术操作后立即在体外或体内进行的。3 - 8我们之前已经证明手术会显著改变肠道功能，9因此，手术操作肠道后立即进行的研究结果可能不适用于正常的生理状况。
在最近的两项研究中，研究人员排除了手术对肠道功能的影响，并表明钠-营养共转运不会增强细胞旁通透性。10，11一项以大鼠模型进行的研究表明，惰性糖灌胃24小时的尿液恢复并没有因存在d葡萄糖。10然而，一些方法上的局限性可能影响了这些发现:(一个)用于输送葡萄糖和惰性糖的高渗溶液可能改变了胃的通透性;（b)惰性探针的24小时尿液恢复可能是一种太不敏感的测量方法，无法检测实验早期发生在近端小肠的渗透性变化d-葡萄糖浓度最高;（c),d-葡萄糖在近端肠被吸收，而惰性探针则进入远端肠，在缺乏钠共输运的情况下，大量惰性探针可能已被吸收，降低了检测葡萄糖诱导的肠通透性变化的能力。
另一项用人体灌注模型进行的研究表明，甘露醇:木糖和木糖:尿素的扩散比在存在的情况下没有增加d葡萄糖。11然而，在正常的生理条件下，肠段的持续灌注和随之而来的管腔扩张并不会发生，并且已被证明会改变绒毛解剖结构和随后的生理反应。12 - 15因此，在解释本研究的结果时，应认识到这一局限性。
为了解决关于na -养分共转运引起细胞旁通透性改变的意义的争议，需要在控制上述方法限制的同时保持生理肠道条件的实验。因此，我们采用长期置管大鼠模型，在正常生理条件下研究肠道功能，研究Na耦合营养转运对肠道通透性的影响，测量Na耦合营养转运对肠道吸收率的影响l-葡萄糖和甘露醇，以及关于甘露醇的扩散比:尿素。
方法
动物
雄性sd大鼠，体重240-400 g，来自查尔斯河育种实验室(Wilmington, Massachusetts, USA)。大鼠被维持在10:14小时的明暗循环下。水和饲料(Agway大鼠鼠仓鼠饲料3000)可随意提供，但在实验前4小时动物禁食时除外。这项研究得到了机构动物护理和使用委员会的批准。
氯胺酮60 mg/kg麻醉，木lazine 5.0 mg/kg肌注麻醉。导管放置在主动脉，门静脉和十二指肠无菌条件下，如前所述。16为了保持导管通畅，每天用0.35 ml 0.9% NaCl(含500单位/ml肝素和2.5 mg/ml氨苄青霉素)冲洗导管。置入导管前和术后4天动物体重分别为295(42)和286(37)克。
化学物质
所有非放射性化学品和试剂均来自Sigma化学公司(美国密苏里州圣路易斯)。放射性同位素从杜邦-新英格兰核研究产品公司(波士顿，马萨诸塞州，美国)获得。
实验设计
在所有实验中，保持以下条件。根据我们之前的发现，手术的影响已经消失，此时动物的体重至少达到术前体重的95%，至少在术后4天测量肠道吸收。9在每次实验前，动物禁食4小时，并通过平衡氯化钠，将十二指肠输液的渗透压标准化为300 mosm。所有十二指肠输液中至少含有50毫米钠，高于K值米活化钠偶联的营养共转运17当在每只动物身上进行多项实验时，实验至少间隔24小时。在配对实验中，输液的顺序是随机分配的。
钠耦合养分转运对植物吸收的影响l-葡萄糖和甘露醇
研究了钠耦合养分转运对土壤吸收速率的影响l在三组不同的动物中研究了-葡萄糖和甘露醇，以测试不同的钠耦合运输激活剂的影响。在第一组(n=9)中，吸收率为100 mMl-葡萄糖单独测量，并在以下每种存在的情况下测量:100 mM甘露醇，100 mMd-葡萄糖，50毫米麦芽糖和50毫米丙氨酸。在第二组(n=6)，吸收率为100 mMl-葡萄糖单独测量，并在以下每种存在的情况下测量:50 mM丙氨酸，50 mM丙酰脯氨酸和50 mM丙酰脯氨酸甘氨酸。在第三组(n=9)中，单独测量100 mM甘露醇的吸收率，并在以下条件下测量:100 mMl-葡萄糖，100毫米d-葡萄糖和50毫米丙氨酸。
在一组不同的动物中，我们测试了长时间暴露在d-葡萄糖对细胞旁渗透性的影响。这些动物作为它们自己的对照组，接受ad葡萄糖或l甘露醇输注开始前10分钟，将葡萄糖溶液注入十二指肠。肠上皮细胞因此暴露于d葡萄糖或l-葡萄糖11-14分钟后开始测量甘露醇吸收率。长时间接触的影响d-葡萄糖使用两种不同体积和浓度的d葡萄糖。对于A组(n=8)， 0.5 ml含有100 mM的溶液d-葡萄糖在开始前10分钟注入含100mm甘露醇和100mm的1ml溶液至十二指肠d葡萄糖。对于B组(n=8)， 100mm为1mld-葡萄糖在100mm甘露醇和200mm甘露醇的1ml溶液开始前10分钟注入十二指肠d葡萄糖。
钠耦合养分转运对甘露醇:尿素和甘露醇:氚化水扩散比的影响
在这些实验中，通过计算两种被动吸收物质(甘露醇和尿素)在浓度为50 mM时的扩散比来测量肠道通透性。6只动物(A组)作为它们自己的对照组，测量甘露醇:尿素在浓度为100 mM时的扩散比d-葡萄糖或100毫米l葡萄糖。
在不同的实验中，我们研究了长时间暴露于d葡萄糖和l-葡萄糖对甘露醇:尿素的扩散比。以动物为对照，我们分别注入不同体积和浓度的两种物质d葡萄糖或l-葡萄糖进入十二指肠前测量甘露醇:尿素扩散比为以下三组动物:B组(n=6)接受0.5 ml的100 mMd-葡萄糖10分钟前甘露醇-尿素溶液;C组(n=5)注射1.0 ml 200 mMd-葡萄糖10分钟前甘露醇-尿素溶液;D组(n=7)注射2 ml 100 mMd-葡萄糖持续输注(0.1 ml/min)，开始于甘露醇-尿素溶液20分钟前。
l -葡萄糖和甘露醇吸收率的测量
的吸收率l-葡萄糖和甘露醇通过前面描述的双重输注方法测量，这是一种经上皮吸收的测量方法。9使用这种方法，物质的吸收率是由它出现在肠道血液中的速率来确定的。
本研究采用双重输注法进行测量l-葡萄糖和甘露醇吸收按以下方式进行。示踪剂量14Cl葡萄糖或14以0.2 ml/min的速度连续注入0.9% NaCl溶液中的甘露醇(0.4 μCi/ml)。同时，注射1.0 ml的l-葡萄糖或甘露醇与示踪量的3.十二指肠输注H同位素(8 μCi/ml)。大约1分钟后，从主动脉导管中取出6个连续的主动脉血样(每个0.25 ml)。的斜率3.H和14通过线性回归分析确定血中C浓度随时间的变化。摄取3.H的确定如下:
方程1摄取3.H除以的比活度3.以确定每种己糖的吸收速率。
扩散比的测量
通过比较不同大小的被动吸收溶质的扩散比来确定肠道渗透性的潜在变化。这些比较是基于限制扩散原理，其中膜渗透性的增加是通过大溶质相对于小溶质的相对扩散的增加来表示的。11，18，19
我们以前描述过使用门静脉-主动脉浓度梯度(PV-A)进行比较l-葡萄糖和3- o -甲基葡萄糖吸收率。16在本研究中，我们使用了类似的方法来描述d-葡萄糖对三种被动吸收溶质的相对渗透性的影响:氚化水(THO，分子量(MW) = 18)、尿素(MW = 60)和甘露醇(MW = 180)。甘露醇:尿素和甘露醇:THO在存在或不存在100 mM时注入十二指肠后，通过每个分子的PV-As测定其扩散比d葡萄糖。
在本研究中，甘露醇:尿素和甘露醇:THO的扩散比的测定方法如下。在0.6分钟内注入1.0 ml含有以下两种扩散探针组合之一的溶液:(一个)尿素50mm，甘露醇50mm，示踪剂用量14C尿素(0.5 μCi/ml)3.H甘露醇(2.0 μCi/ml);或(b) 50毫米甘露醇与示踪剂量14甘露醇(2.3 μCi/ml)和氚化水(1 μCi/ml)。十二指肠输注开始后1 - 2.5分钟，从主动脉和门静脉导管中同时抽取三份连续血样(每份0.25 ml)。在两者均为100 mM时，测定了扩散比d-葡萄糖和100毫米l-葡萄糖，如前所述。
根据探针的PV-A计算扩散比，原理如下:任何物质通过肠道的吸收率(J)等于该物质在进入和流出肠道的血液中的浓度差乘以流经肠道的血液流速:
方程2对于被动吸收物质a和b，物质a:b的扩散比(DR)计算如下:
方程3其中ΔC是从肠腔到血液的浓度梯度。方程(2)代入式(3.)：
方程4如果两个测量的流量相同[PV-A]一个和[PV-A]b正如我们同时测量两者的方法所自动实现的那样，则方程(4)简化为:
方程5按照惯例，扩散比表示为渗透性较弱的分子与渗透性较强的分子之比，因此总是小于1。
在之前的实验中，我们发现1.0 ml十二指肠输液被腔内内容物稀释了15%，9因此，在这项研究中，ΔC的计算使用的知识是，一种物质的腔内浓度是注入浓度的85%。甘露醇通常不存在于血液中，因此ΔC的血液浓度是根据用于计算PV-A的主动脉血浓度计算出来的。尿素通常存在于大鼠的血液中，所以我们根据之前的研究结果计算ΔC，血尿素浓度为6mm。20.，21对于THO， ΔC仅计算THO，而不计算总水浓度。由于每只动物都作为自己的对照组，任何动物间THO和尿素血液浓度的变异性对葡萄糖诱导的扩散比变化的测量几乎没有影响。
我们测定了在64 mM油酸存在下甘露醇:尿素扩散比，以确定甘露醇:尿素扩散比是否是肠通透性的敏感指标。油酸已被证明能急剧增加肠道的通透性，22因此，甘露醇:尿素扩散比在输注油酸后有望增加。在3只大鼠中，我们在输注含有甘露醇和尿素的溶液前20分钟开始连续输注2 ml 64 mM油酸。灌注64 mM油酸前后甘露醇:尿素的扩散比分别为0.11(0.1)和0.33(0.2)，表明甘露醇:尿素的扩散比在我们实验的时间框架内是肠道渗透性增加的敏感指标。
分析方法
血液样本(0.25 ml)加入0.3 ml 1.0 M HClO中4并在Microfuge E (Beckman Instruments, Palo Alto, California, USA)中以17000 rpm的速度离心5分钟。在加入HClO后，在三个时间点对血液样本管进行称重:空管4，并加入血液样本后，以定量HClO引起的样品稀释量4．然后，在5ml闪烁液中计数重复的0.1 ml上清液(EcoLume, ICN, Costa Mesa, California, USA)。放射性在Mark V闪烁计数器(5303型)中测量。闪烁计数器的窗口被调整了，这样所有的3.H在一个通道中。的交叉量14然后用标准计算进入该通道的C。
统计分析
采用重复测量的方差分析来检测Na耦合养分转运对甘露醇和甘露醇绝对吸收率的影响l葡萄糖。这一统计数据控制了大鼠作为不同输液对照组的动物内效应。双尾成对t试验用于比较，以测试的影响d-葡萄糖的平均扩散比。对于所有统计数据，数值均以平均值(SD)表示，alpha误差设置为0.05。
结果
钠耦合养分转运对l -葡萄糖和甘露醇吸收的影响
两种药物的吸收率无显著差异l葡萄糖在100mm甘露醇的存在下，100mmd-葡萄糖，50毫米麦芽糖，50毫米丙氨酸，50毫米丙酰脯氨酸，或50毫米丙酰脯氨酸甘氨酸(图1而且2)．我们还发现，甘露醇的吸收不会因100 mM的存在而改变l-葡萄糖，100毫米d-葡萄糖，或50 mM丙氨酸(图3.)．
钠耦合输运对钠离子吸收速率的影响l葡萄糖。柱状表示平均值(SD);n = 9。
丙氨酸和多肽对产蛋率的影响l葡萄糖的吸收。柱状表示平均值(SD);n = 6。
钠耦合迁移对甘露醇吸收速率的影响。柱状表示平均值(SD);n = 9。
存在d-葡萄糖在肠腔内放置10分钟，并没有增加两组甘露醇的吸收率(0.5 ml的100 mMd-葡萄糖)或B组(1.0 ml 200 mMd-葡萄糖)，与含有甘露醇的溶液吸收率进行比较l葡萄糖(图4)．在这些实验中，与图中所示值相比，甘露醇的平均吸收率较低3.，因为FIG中的实验4，通过预灌注葡萄糖溶液稀释甘露醇浓度。
在测量100mm浓度甘露醇吸收率前10分钟注入腔内葡萄糖的影响。a组，n=8;B组，n=8。柱状表示平均值(SD)。
钠耦合养分转运对甘露醇:尿素和甘露醇:THO扩散比的影响
甘露醇:尿素扩散比无显著性差异d葡萄糖和l-葡萄糖组(p=0.99)， B组(p=0.29)， C组(p=0.18)， D组(p=0.94)，表明肠通透性没有由于d-葡萄糖在肠腔内长达20分钟(图5)．
的影响d-葡萄糖对甘露醇的扩散比(DR):尿素。柱状表示平均值(SD)。
四组的数据被结合起来比较d葡萄糖和l-葡萄糖在平均PV-A甘露醇和尿素。结果显示，在存在d葡萄糖和l-葡萄糖，甘露醇(18.5 nmol/ml vs 17.1 nmol/ml)和尿素(250.5 nmol/ml vs 192.6 nmol/ml)的梯度都更高。这些差异反映了吸水性增加带来的溶剂阻力效应，而且由于甘露醇和尿素都受到同样的影响，扩散比没有变化。
我们发现，甘露醇(nmol)/THO (μmol)的扩散比显著降低d-葡萄糖水平高于对照组(图6, p = 0.002)。这是由于在存在时THO的PV-A梯度的增加d-葡萄糖(1210 μmol/ml)高于对照组(779 μmol/ml) (p=0.047)。因此,d-葡萄糖增加水分的吸收率大于甘露醇的吸收率。
的影响d-葡萄糖对甘露醇扩散比(DR)的影响:THO (n=6)。
讨论
本研究结果表明，在正常生理条件下，钠营养物质共转运的激活不会改变肠道通透性。这一结论是基于以下发现:甘露醇的吸收率和l-葡萄糖没有增加d-葡萄糖、丙氨酸、麦芽糖、丙酰脯氨酸或丙酰脯氨酸;而甘露醇与尿素的扩散比并没有因其存在而增加d-葡萄糖在肠腔内持续20分钟这些发现也不支持先前的假设，即紧密连接的渗透性是由酶诱导的肽和多糖在上皮膜上水解而产生的高浓度Na共转运单体增加的。
我们的发现与其他研究人员的发现之间的不一致可能反映了方法上的差异，因为我们的实验方法控制了以前研究的局限性。在我们的研究中，肠道功能是在正常生理条件下进行的，没有手术的影响。这些动物不受约束，没有压力，体重也在增加。肠道没有以恒定的流速灌注，避免了可能改变肠道功能的持续管腔扩张的发生。相反，等渗十二指肠输注以丸剂输注的方式给予，以便钠耦合转运激活剂和扩散探针同时存在于肠腔中。探针的吸收率和扩散率由血液水平测量，因此运输速率反映了经上皮吸收。此外，与24小时尿液恢复研究相比，测量探针的血液水平可能对肠道渗透性的微小变化更敏感。
虽然我们的长期置管大鼠模型不允许确定肠腔内溶质的确切浓度或灌注肠的长度，但我们通过测量甘露醇:尿素扩散比解决了这一限制。当同时测量两种溶质的扩散并以比率表示时，就排除了诸如动力学、腔内稀释和表面积等变量的影响。18此外，通过膜被动吸收的溶质的扩散比不受水流过膜的方向和速率的影响。18，19
我们的选择l-葡萄糖、甘露醇和尿素作为肠道渗透性的探针与以前的研究人员一致，他们使用这些或更小的探针。3.，10，11，汽车出行l葡萄糖、甘露醇和尿素是惰性的，通过细胞旁通道被动吸收，甘露醇和l-葡萄糖在大小上与氨基酸和其他己糖相似，假设细胞旁吸收对其有重要意义。11，-
我们的研究结果与之前的研究人员一致，他们在没有手术肠道操作影响的情况下测量了体内肠道通透性。10，11使用灌注法，精细等发现,d-葡萄糖既不增加甘露醇的吸收率，也不增加甘露醇:木糖和木糖:尿素的扩散比。11同样,施瓦茨等显示,d-葡萄糖并没有增加总吸收l葡萄糖,l半乳糖,l甘露糖,或者d-甘露醇，这是d细胞旁转运产生的-葡萄糖吸收极少。10此外，我们目前的发现与我们之前的工作是一致的，我们显示没有影响l-葡萄糖(PV-A)梯度的管腔3- o -甲基葡萄糖，ad-葡萄糖类似物，使用相同的运输机制d葡萄糖。16
这项研究的结果不同于以前通过手术控制肠道的体内和体外研究。3 - 8这些差异表明，外科手术及其伴随的后遗症可能影响了这些先前研究的结果。这一推测与该领域的研究一致:(1)手术和麻醉会减少肠道血流量，从而改变营养物质和药物的吸收30 -；(2)对动物的约束导致应激诱导的肠渗透性增加，以甘露醇吸收来衡量33；(3)手术肠道操作导致葡萄糖主动转运减少86%。9
此外，低细胞能量水平继发于缺氧或缺乏代谢底物可能解释了先前的研究结果，这些研究表明，增加肠渗透性继发于钠共转运。用急性灌注模型，尼科尔斯等显示大部分腔内葡萄糖在肠内代谢为乳酸，34而在长期置管的大鼠模型中，Rich-Denson和Kimura表明，几乎所有的腔内葡萄糖都被完整地吸收，没有被肠道代谢成乳酸。35Nicholls的结果等只有当动物被置于低氧环境中时(Fio20.07)，表明在Nicholls的实验中等此时，尽管血氧水平正常，但细胞能量水平可能较低。在低细胞能量水平对上皮功能影响的相关研究中，曼德尔等表明肾上皮细胞能量消耗改变了紧密连接结构，增加了紧密连接的通透性，而不影响上皮膜的完整性。36
同样，我们的研究发现，将肠道暴露在葡萄糖中10 - 20分钟，既没有增加甘露醇吸收率，也没有增加甘露醇:尿素扩散比，这与涉及体外方法和肠道手术的研究人员的研究结果不同。Atisook和同事3.和Pappenheimer6研究发现，Na养分共转运对提高渗透性的作用在10 min时最大。这些发现可能反映了术后肠的情况，其中较高的未搅拌水层延迟了溶质从腔内液体的体相扩散到微绒毛膜，以激活Na共转运体。9，37我们之前的研究表明，当手术的不良影响被消除后，葡萄糖的主动运输会增加9倍。9因此，使用我们的肠功能最大化的模型，任何钠耦合转运对肠道渗透性的影响都应该早于Atisook所描述的10分钟等和Pappenheimer。
两种主要的证据已被用来支持活化钠营养共转运增加细胞旁通透性的理论。首先，钠营养物质共转运增加了粘膜阻抗，增加了侧间隙的扩张和紧密连接形态的改变。3 - 6，8在这些研究中，只有在实验前将肠道剥夺葡萄糖15分钟，才能引起肠道通透性的增加，这导致了Pappenheimer和Atisook等假设肠组织储存的葡萄糖必须完全耗尽之前，紧密连接的通透性可以增加d葡萄糖。3.，6，8这些研究人员提出，在体内模型中，尽管没有腔内葡萄糖，但从血浆中持续供应3-5 mM葡萄糖足以激活Na共转运，从而增加通透性。3.，38为了生存，动物必须保持恒定的血浆葡萄糖浓度，防止肠道储存的葡萄糖完全耗尽，因此这些研究的发现不能应用于正常的生理条件。
支持钠离子耦合营养物质转运增加细胞旁通透性这一理论的另一个证据是，在正常情况下，动物摄取和吸收葡萄糖的量超过了整个肠道的表观转运能力。24，27这些推测是基于对最大运输速率(J马克斯)从体外方法获得。尽管这些研究人员已经假设葡萄糖和氨基酸运输的体外测量准确地反映了正常生理条件下的营养吸收率，但我们之前的工作并没有支持这一假设。我们发现，手术肠道操作可使葡萄糖的主动转运降低86%，并使用我们对J马克斯对于葡萄糖，摄取率和肠道运输能力之间不存在差异。9
我们的研究发现，紧结渗透性并没有随着钠耦合营养物质的输送而增加，这与之前的体内研究结果一致，这些研究因实验中液体吸收不足而受到批评。1在实验动物中，我们发现THO在不存在和存在时的PV-As分别为779 μmol和1210 μmold分别为葡萄糖。大鼠门静脉血流量为10-12 ml/min/100 g体重，31因此，对于本研究中的动物，THO的粘膜到浆膜吸收为0.42-0.65 ml/min(式2)．这些数字对应于粘膜到浆膜的THO吸收率相当于1.5-2.3 ml/cm/h，基于我们之前的数据显示，我们的大鼠十二指肠输注1ml可灌注16.8 cm的肠道。9净吸水性不能计算，因为浆膜到粘膜的水流不能确定。这些数据与其他体内研究的吸水率相当。11然而，最重要的事实是，我们的发现反映了在正常生理条件下，在吸水率下钠-营养物质运输的影响。另一方面，如果钠-营养物质共转运引起的肠道通透性改变只能在超生理吸水率下检测到，那么任何通透性变化的生理意义可能都非常小。
综上所述，本研究结果表明，在正常生理条件下，葡萄糖或氨基酸激活na -养分共转运并没有显著增加肠道通透性。在最近的一篇论文中，特纳和马达拉1综述了有关na -养分共输引起致密结渗透率变化的研究，并阐述了不同结果的潜在原因。虽然这篇综述没有说明在何种条件下进行了各种研究，但这一因素似乎与不同的结果有着千丝万缕的联系。在正常生理条件下进行的体内研究没有显示出钠-营养物质共转运引起肠道通透性的显著变化，并且显示只有少量葡萄糖和氨基酸的吸收是通过细胞旁转运发生的。10，11，16相比之下，那些表明钠耦合转运导致肠道通透性显著改变的研究是通过非生理的体外或体内方法进行的。体内研究结果显示，肠道运输能力与动物摄取营养物质的能力之间存在明显差异，但研究人员基于体外研究中获得的葡萄糖和氨基酸运输速率进行比较，这一事实损害了这一结果。24，27因此，虽然在极端的实验条件下，钠耦合的营养物质运输可能会增加紧密连接的渗透性，但由于钠-营养物质共运输引起的肠道渗透性改变似乎在生理上并不显著。