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摘要
背景-在溃疡性结肠炎患者结肠活检标本中，一氧化氮(NO)合成和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达增加，但NO产生的细胞来源尚不清楚。
目标目的:研究一氧化氮合酶在人结肠黏膜中的分布，探讨T淋巴细胞源性细胞因子在人结肠上皮细胞中调控一氧化氮合酶表达和活性的能力。
方法用免疫组织化学方法检测了12例溃疡性结肠炎患者和3例感染性结肠炎患者结肠活检样本中-iNOS的表达，并与10例正常对照组进行了比较。在HT-29细胞培养物中检测iNOS的体外表达和活性;用荧光底物检测亚硝酸盐水平，用northern blot检测iNOS mRNA表达，用western blot检测iNOS蛋白表达。
结果在正常对照的非炎症黏膜中未检测到iNOS的表达(10 / 10)。在12例新诊断的溃疡性结肠炎中，有11例在上皮细胞中表达iNOS蛋白，而在固有层中未发现其他阳性细胞。在急性期感染性结肠炎患者的结肠活检样本中发现了类似的iNOS标记，但在完全缓解期患者的样本中重新检查时，未观察到iNOS染色。白介素(IL)-13和IL-4，而不是IL-10，都是由细胞因子(即IL-1α、肿瘤坏死因子α和干扰素γ)的最佳组合诱导的iNOS表达和活性的有效抑制剂。
结论-数据表明，在溃疡性结肠炎中，上皮细胞是iNOS活性的主要来源，IL-13和IL-4可能是肠道炎症中NO生成的内在调节因子。
- 白介素13
- 一氧化氮
- 诱导型一氧化氮合酶
- 结肠上皮细胞
- 溃疡性结肠炎
数据来自Altmetric.com
一氧化氮(NO)由多种细胞类型产生，它是一种重要的分子信使，在心血管、神经和免疫系统中具有许多生理作用。它是由一组酶合成的，一氧化氮合酶(NOS)可以转化氨基酸l精氨酸为l-瓜氨酸和NO。1，2其中两个NOS是连续存在的，被称为本构性。3 - 5这两种异构体需要钙和钙调蛋白，产生少量的NO，并参与稳态过程。6第三种异构体不依赖钙和钙调蛋白，在某些细胞因子、微生物或微生物产物诱导后表达，因此被称为可诱导NOS (iNOS)。7；它负责组织中主要的NO生成。1，8NO在胃肠道的许多部位产生，被认为参与了生理和病理事件。9对炎症性肠病(IBD)患者的研究显示NO合成显著增加10，11和NOS活性12在溃疡性结肠炎(UC)患者的炎症粘膜中与未炎症对照组相比有明显的差异，但粘膜中NO的细胞来源尚不清楚。然而，越来越多的证据表明结肠上皮是NO的来源，并且它受到细胞因子的高度调控。例如，我们最近证明，在人结肠癌细胞系HT-29中，用促炎细胞因子的“鸡尾酒”刺激诱导iNOS mRNA表达和亚硝酸盐生成。13
在本研究中，我们使用一种单特异性iNOS抗体，研究了UC和感染性结肠炎患者黏膜中iNOS的表达，并将结果与正常对照组进行了比较。此外，我们还探讨了T细胞来源的细胞因子在调节上皮细胞iNOS表达和活性中的作用，因为IBD病变中存在特定的淋巴细胞及其细胞因子。14三种T细胞衍生的细胞因子，白细胞介素(IL -13)， IL-4和IL-10，都被认为是抗炎细胞因子。例如，IL-13是激活单核细胞和巨噬细胞的细胞因子和趋化因子表达的有效抑制因子15，16还有内皮细胞。17IL-4也表现出类似的生物活性，而IL-4单独对人T细胞有作用。16IL-10由多种细胞产生，包括活化的人T细胞，它也是活化的单核/巨噬细胞产生的细胞因子和趋化因子的有效抑制因子18，19还有多形核细胞。20.在IBD患者的结肠粘膜中发现了这三种T细胞来源的细胞因子，21 - 24日但到目前为止，对它们的产生与这种疾病的关系的调查还没有定论。25IL-4、IL-10和IL-13在UC和克罗恩病中调节细胞因子的产生26有研究表明，它们产生的变化可能与IBD的发病机制有关。27此外，IL-10缺失小鼠的“慢性小肠结肠炎”表型提示IL-10作为结肠炎症负调节因子的作用。28，29
材料与方法
材料
重组人(rh)IL-1α(特异性5 × 107U/mg)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)(特异性6 × 107U/mg)分别来自葛兰素史克(Greenford, Middx, UK)和拜耳(Slough, Berks, UK)。重组人干扰素γ (rhIFN-γ)(特异性>2.0 × 107U/mg)从英国苏塞克斯郡刘易斯的Boehringer-Mannheim购买。从稳定转染的CHO细胞培养上清中纯化出rhIL-1315并由A Minty博士(Sanofi, Recherche, Labege, France)慷慨提供。特异性1 × 107U/ml)由K W Moore博士(DNAX, Palo Alto, CA, USA)慷慨捐赠。特异性>1 × 107U/mg)购自Genzyme。亚硝酸钠和2,3-二氨基萘分别来自Sigma化学和Lancaster合成有限公司。地高辛化学发光检测试剂盒来自Boehringer-Mannheim公司。5 ' -地高辛标记的iNOS探针是一种鸡尾酒，含有三种反义30-mer寡核苷酸，购自R & D Systems公司(Abingdon, Oxon, UK)。美国新泽西州Rahway默克研究实验室的J R Weinder博士及其同事鉴定并慷慨地提供了一种兔抗一氧化氮合酶亲和纯化免疫球蛋白G指定的NO-53，该免疫球蛋白G针对人类一氧化氮合酶的最后7个c端氨基酸，并且不与构成性一氧化氮合酶亚型发生交叉反应。30.ABC配合物和3,3 ' -二氨基联苯过氧化物酶底物片分别来自Dako和Sigma。
细胞培养
HT-29细胞系购自欧洲动物细胞培养收藏。细胞培养在McCoy’s 5A培养基(Gibco)中，添加10%胎牛血清、青霉素/链霉素(10 U/ml和10 μg/ml)和真菌素(0.5 μg/ml)(完全培养基)，37℃，5% CO气氛中培养2，并每周通过。实验中HT-29细胞按(2-3)× 10接种4/厘米26孔板(英国Nunc)，完全培养基，37°C, 5% CO2直到汇合的。在不含胎牛血清的培养基中，用适当浓度的刺激处理融合细胞培养，按上述方法孵育。
亚硝酸盐荧光法测定
通过测定培养上清液中稳定的最终产物亚硝酸盐来测定HT-29细胞的NO产量。亚硝酸盐用Misko描述的荧光法测定等．31该方法是基于亚硝酸盐与2,3-二氨基萘反应生成荧光产物1-(H) -naphthotriazole。如前所述，使用PTI双波长荧光光谱仪(激发为365 nm，发射为405 nm)测量样品。13灵敏度为10 nM。
Northern blot分析
如前所述，从HT-29细胞中分离总细胞RNA。13，32总RNA通过甲醛/1%琼脂糖凝胶电泳分离，并通过毛细管印迹转移到尼龙膜(boehrlinger - mannheim)过夜。将印迹与地高辛标记的寡核苷酸探针(10 ng/ml)在60°C下杂交过夜。以lumigen PPD (Boehringer-Mannheim)作为化学发光底物，结合碱性磷酸酶偶联的抗地高辛Fab片段检测结合探针。用激光密度法定量特异性iNOS mRNA。通过监测18S和28S RNA来评估每个凝胶通道的等效总RNA载量。
Western blot分析
刺激后在预定时间将HT-29单层刮入含有5 μg/ml羧基肽酶抑制剂的Laemmli SDS还原凝胶样品缓冲液中。33溶解蛋白通过十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳在7%的凝胶上分离，并转移到硝化纤维膜上。将兔抗人iNOS抗体(NO-53) 1:40 000稀释在磷酸盐缓冲盐水/Tris中孵育1小时。采用碱性磷酸酶偶联羊抗兔免疫球蛋白，以BCIP底物(Sigma)为染色质，获得特异性结合。所有的培养和洗涤都在室温下进行，并伴有轻微的摇晃。
病人
结肠活检标本取自在巴斯皇家联合医院确诊的患者。患者组包括活动性结肠炎(n = 12, 9名男性和3名女性，中位年龄42岁，范围24-59岁)，感染性结肠炎(n = 3, 3名男性，中位年龄41岁，范围29-56岁)和对照组(n = 10, 6名男性和4名女性，中位年龄64岁，范围26-84岁)。所有UC患者在结肠镜检查时都是新诊断为中度至重度疾病活动。所有患者在治疗前均接受检查，并从炎症最严重的部位取活检样本。这些标本的常规组织学检查显示溃疡、粘蛋白耗损、腺体变形、隐窝脓肿和固有层炎症细胞浸润。由沙门氏菌病引起的感染性结肠炎患者接受检查，并在治疗前和治疗后患者完全缓解时采集活检标本。以憩室病(n = 2)和大肠腺癌(n = 6)患者和正常人(n = 2)的正常肠粘膜活检样本作为对照。在常规组织学检查中，这些样本有正常数量的杯状细胞，没有显示任何固有层的炎症浸润。
免疫组织化学
利用兔抗人iNOS c端序列的多克隆抗体，以亲和素/生物素方法验证iNOS的存在。用福尔马林固定、石蜡包埋的结肠活检标本被安装在3-氨基丙基三乙氧基硅烷涂层载玻片上。将载玻片与1:1000稀释的兔抗人iNOS抗体NO-53孵育1小时。用苏木精作反染剂。在抗inos抗体工作稀释液中加入150 nM的免疫原性肽，进行阻断实验。
统计分析
采用双向方差分析，然后采用Dunnett检验与对照组进行多重比较，评估统计学意义。三个实验的数据用均值(SEM)表示。每个实验重复三次测定。以P⩽0.05为差异显著的标准。
结果
免疫组织化学
在憩室病和结肠腺癌患者及健康个体的正常非炎症黏膜(10例中10例)中未检测到iNOS的表达(图2)1A)。在12例UC中，有11例上皮细胞表达了可观数量的iNOS，总是在隐窝的浅表部分和黏膜表面，而在固有层中没有发现其他阳性细胞(图2)1在大多数情况下，iNOS特征性地表达于上皮细胞的顶端部分，并与固有层的中性粒细胞浸润密切相关(图2)1C)。在检查的所有感染性结肠炎病例中都看到了类似的结果(图1D).感染性结肠炎患者的结肠活检标本，在疾病的急性期呈iNOS阳性，当患者完全缓解时重新检查时，未表达可检测的iNOS(图1E)。当省略一抗(No -53)时，阴性对照组未见染色，当No -53与免疫原性肽孵育时(如上所述)，染色显著降低(图5)1F)。
所有切片均用抗人诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体(NO-53)染色，使用亲和素/生物素过氧化物酶。(A)肠道正常，未检测到iNOS。原放大倍率× 100。(B)溃疡性结肠炎(UC)，隐窝浅层和表面上皮染色。原放大倍率× 100。(C)另一例UC病例显示类似染色;iNOS标记位于上皮细胞的顶端部分，与固有层的中性粒细胞浸润密切相关(箭头)。原放大倍率× 100。(D)急性感染性结肠炎，隐窝浅层和表面上皮染色。原放大倍率× 100。 (E) Sample from the same patient after recovery, with resolution of iNOS expression. Original magnification × 50. (F) Same section as (D) using primary antibody preabsorbed with immunogenic peptide. Original magnification × 250.
号活动
静息的HT-29细胞被发现产生基础量的亚硝酸盐(图2)，这是由于本构NOS，因为没有检测到iNOS的表达，基础亚硝酸盐的产生不受蛋白质合成抑制剂环己亚胺的影响。没有发现单独添加的细胞因子影响HT-29细胞的亚硝酸盐生成。亚硝酸盐生成显著增加的最低要求是IL-1α/IFN-γ的组合(所有其他对细胞因子都无效)，并且在该组合中添加TNF-α可诱导亚硝酸盐生成的三倍增强(图2)2)．同样，用IL-13、IL-4或IL-10刺激HT-29细胞48小时后，不影响这些细胞的亚硝酸盐生成(图2)2)．在加入最佳细胞因子鸡尾酒(IL-1α/TNF-α/IFN-γ)之前，用不同浓度的IL-13或IL-4 (0.3-30 ng/ml)预处理HT-29细胞1小时，对亚硝酸盐的生成产生了浓度相关的高度显著(p<0.001)抑制(图2)3.而且43 ng/ml时，IL-13或IL-4的抑制率约为50%。最后，我们发现，在0.3-30 ng/ml的浓度范围内，IL-10对HT-29细胞诱导的IL-1α/TNF-α/IFN-γ产生亚硝酸盐没有影响(数据未显示)。
细胞因子处理HT-29细胞后亚硝酸盐的产生。用白介素(IL)-13 (30 ng/ml)、IL-4 (30 ng/ml)、IL-10 (30 ng/ml)、IL-1α (10 ng/ml)/干扰素γ (IFN-γ) (300 U/ml)或IL-1α (10 ng/ml)/IFN-γ (300 U/ml)/肿瘤坏死因子α (TNF-α) (100 ng/ml)处理HT-29细胞融合单层，在37°C孵卵48小时后，使用检测水平为10 nM的荧光底物测定上清液中的亚硝酸盐水平。基本是HT-29细胞在没有添加细胞因子的情况下产生亚硝酸盐的量。结果以三个独立实验的平均值(SEM)表示。
白细胞介素(IL)-1α (10 ng/ml)/干扰素γ (IFN-γ) (300 U/ml)/肿瘤坏死因子(TNF-α) (100 ng/ml)处理HT-29细胞后亚硝酸盐的产生，存在浓度增加的IL-13。IL-13预处理1小时后加入促炎细胞因子，37°C孵育24小时后测定上清液中的亚硝酸盐水平。每个点代表三个独立实验的平均值(SEM)。**p<0.01， ***p<0.001与阳性对照反应(无IL-13)比较。
白细胞介素(IL)-1α (10 ng/ml)/干扰素γ (IFN-γ) (300 U/ml)/肿瘤坏死因子α (TNF-α) (100 ng/ml)处理HT-29细胞后亚硝酸盐的产生，存在浓度增加的IL-4。IL-4预处理1小时后加入促炎细胞因子，37°C孵育24小时后测定上清液中的亚硝酸盐水平。每个点代表三个独立实验的平均值(SEM)。**p<0.01， ***p<0.001与阳性对照反应(无IL-4)比较。
HT-29细胞中iNOS mRNA的表达
在未受刺激的细胞中，或用IL-13、IL-4或IL-10刺激后，未检测到iNOS转录本。为确定IL-13、IL-4和IL-10对细胞因子诱导的iNOS mRNA表达的影响，分别用不同浓度(0.3-30 ng/ml)的IL-13、IL-4或IL-10预处理细胞1小时，然后加入IL-1α (10 ng/ml)/IFN-γ (300 U/ml)/TNF-α (100 ng/ml)， 12小时后检测iNOS mRNA表达。低浓度(0.3-3 ng/ml)的IL-13和IL-4均对IL-1α/IFN-γ/TNF-α诱导的iNOS mRNA表达无显著影响，而高浓度(> - 10 ng/ml)的IL-13和IL-4均显著抑制HT-29细胞iNOS mRNA表达(图2)5而且6分别)。我们之前已经证明，诱导iNOS mRNA的最低要求是IL-1α和IFN-γ，而在这一组合中添加TNF-α会导致亚硝酸盐产生的上调，而不会进一步增加iNOS mRNA。13这些数据表明，低浓度(0.3-3 ng/ml)的IL-13和IL-4下调TNF-α对IL-1α/IFN-γ诱导的HT-29细胞亚硝酸盐生成的转录后作用，而高浓度的IL-13和IL-4 (>10 ng/ml)还会抑制促炎细胞因子诱导的iNOS mRNA的转录。最后，IL-10预处理对HT-29细胞中IL-1α/IFN-γ/TNF-α诱导的iNOS mRNA无影响7)．
白细胞介素(IL)-1α (10 ng/ml)/干扰素γ (IFN-γ) (300 U/ml)/肿瘤坏死因子α (TNF-α) (100 ng/ml)处理HT-29细胞后诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的表达。IL-13预处理1小时后加入促炎细胞因子，在37℃下孵育12小时。上图为北面印迹，中图为印迹密度分析图，下图为溴化乙锭染色的18S和28S条带，显示通道负载相等。这是三个实验中的一个代表。
白细胞介素(IL)-1α (10 ng/ml)/干扰素γ (IFN-γ) (300 U/ml)/肿瘤坏死因子(TNF-α) (100 ng/ml)处理HT-29细胞后诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的表达。IL-4预处理1小时后加入促炎细胞因子，在37℃下孵育12小时。上图为北面印迹，中图为印迹密度分析图，下图为溴化乙锭染色的18S和28S条带，显示通道负载相等。这是三个实验中的一个代表。
白细胞介素(IL)-1α (10 ng/ml)/干扰素γ (IFN-γ) (300 U/ml)/肿瘤坏死因子α (TNF-α) (100 ng/ml)处理HT-29细胞后诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的表达。IL-10预处理1小时后加入促炎细胞因子，在37℃下孵育12小时。上图为北面印迹，中图为印迹密度分析图，下图为溴化乙锭染色的18S和28S条带，显示通道负载相等。这是三个实验中的一个代表。
iNOS蛋白表达
用适当的刺激处理HT-29细胞24小时，western blot检测iNOS蛋白表达。未受刺激的细胞不表达iNOS蛋白。iNOS蛋白表达的最低要求是IL-1α/IFN-γ的组合，而iNOS蛋白的表达通过添加TNF-α到这种组合中大大增强(数据未显示)，同时亚硝酸盐的生成增加了三倍(图2)2)．为了确定IL-13对细胞因子诱导的iNOS蛋白表达的影响，在用IL-1α/IFN-γ/TNF-α的最佳细胞因子鸡尾酒刺激HT-29细胞前，用不同浓度的IL-13 (0.3-30 ng/ml)预处理1小时。研究发现IL-13对IL-1α/IFN-γ/TNF-α诱导的iNOS蛋白表达产生浓度依赖性抑制(图8)，类似于抑制IL-1α/IFN-γ/TNF-α诱导的亚硝酸盐生成(图3.)．
白细胞介素(IL)-1α (10 ng/ml)/干扰素γ (IFN-γ) (300 U/ml)/肿瘤坏死因子α (TNF-α) (100 ng/ml)刺激HT-29细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达。用IL-13预处理HT-29细胞1小时，然后加入促炎细胞因子。37°C孵育24小时后刮取HT-29单分子膜，提取总蛋白。采用抗人iNOS抗体western blot检测iNOS蛋白表达。这是三个实验中的一个代表。
讨论
我们通过免疫组化方法发现了活动性UC和感染性结肠炎患者炎症结肠粘膜上皮细胞中iNOS蛋白的表达。在缓解期感染性结肠炎患者、未累及的结肠腺癌患者、憩室疾病患者或健康个体的活检样本中，均未检测到iNOS蛋白表达。iNOS在隐窝顶部上皮顶端表面表达较强，隐窝深层上皮细胞表达较低，在固有层和与上皮细胞密切相关的炎性白细胞中未检测到。这些结果有力地表明，结肠上皮细胞是UC患者黏膜中NO产生和iNOS活性增加的主要来源，10 - 12这种NO生成与炎症过程密切相关，并可能有助于炎症过程。我们对新诊断的UC和感染性结肠炎患者的活检样本的结果扩展并补充了Singer的一项平行研究等，30.其中，对长期顽固性UC患者切除的结肠进行了检查，并在隐窝的顶端区域显示了类似的重iNOS染色，与固有层和上皮的强烈中性粒细胞浸润区域密切相关。此外，在表达iNOS的病例中，Singer等30.我们注意到，硝基酪氨酸是过氧亚硝酸盐作用于含酪氨酸蛋白质的稳定产物，也定位于炎症区域的结肠上皮细胞，在表面上皮和隐窝中。30.这些发现表明，炎症反应的某些成分诱导了结肠上皮细胞中iNOS的表达，这些细胞产生的NO与超氧化物反应产生过氧亚硝酸盐，后者硝化细胞蛋白并形成硝基酪氨酸。氨基水杨酸酯被广泛用于治疗IBD，可以抑制这些亚硝化反应34；这种活性可能解释了它们对肠道炎症的治疗作用。
结肠上皮细胞生成NO的功能作用尚不清楚，也不清楚IBD患者NO生成增加对组织是有益还是有害。虽然NO或随后的反应产物在产生过量时会导致宿主细胞的细胞病理，35一些数据表明NO可以减少上皮损伤。NO可以清除氧自由基，减少它们的有害影响，36抑制NO合成促进HCl、乙醇和脂多糖诱导的损伤，37-39这表明NO可能对肠道有保护作用。此外，上皮细胞iNOS的表达可能为细菌入侵提供了氧化屏障。40另一方面，结肠中诱导iNOS增强NO释放可能直接导致多种机制引起的粘膜损伤，包括抑制DNA合成、抑制线粒体功能和细胞内铁释放。41，42NO与氧代谢物自由相互作用产生亚硝化产物，致癌亚硝胺的形成可能与UC结直肠癌发生率增高有关。43在活动性IBD患者的直肠透析中显示出高水平的亚硝胺。44我们发现未受刺激的HT-29结肠上皮细胞产生了基础量的构成性NO，而细胞因子刺激诱导了大量的NO，这是iNOS表达的结果。本构NOS在结肠上皮细胞中产生的少量NO可能保持肠道完整性，而iNOS诱导产生的大量NO具有促炎作用，导致组织损伤。
在IBD患者的粘膜中检测到T细胞和T细胞衍生的细胞因子，包括IFN-γ， IL-4, IL-13和IL-10，14，25，45，46有人提出这可能与该病的发病机制有关。27我们以人结肠上皮细胞系HT-29为模型，探讨T细胞源性细胞因子对上皮iNOS表达和活性的调控作用。我们现在已经证明IL-4和IL-13，而不是IL-10，产生了由IL-1α/IFN-γ/TNF-α的细胞因子鸡尾酒诱导的结肠上皮细胞亚硝酸盐生成和iNOS蛋白和mRNA表达的浓度依赖性抑制。在这些细胞因子的低浓度下观察到的IL-13和IL-4的抑制作用取决于TNF-α的存在，TNF-α作为iNOS表达和活性的转录后刺激因子。然而，在较高浓度下，IL-4和IL-13是iNOS mRNA诱导的有效抑制剂，这完全独立于TNF-α的存在。IL-13已被证明可以抑制动物体内活化巨噬细胞产生NO。47，4801等49已经证明，IL-13抑制了人系膜细胞中促炎细胞因子和脂多糖鸡尾酒刺激后iNOS的表达。IL-10可抑制小鼠激活巨噬细胞产生NO。50，51相反，我们发现IL-10对促炎细胞因子诱导的结肠上皮细胞iNOS的表达和活性没有影响。与IL-13不同，IL-10对HT-29细胞产生IL-8没有影响。52越来越多的证据表明，IL-10由于其抑制单核/巨噬细胞活化的能力，可能是IBD的有效治疗方法。53，54然而，本文的结果表明IL-13可能是一种更合适的T淋巴细胞来源的细胞因子，因为它能够抑制上皮细胞iNOS的表达以及抑制单核/巨噬细胞激活的能力。15，16，55，56
在活动性结肠炎中，可能存在诱导iNOS活性的细胞因子的最佳组合。增加根尖上皮细胞IL-4和/或IL-13浓度或调节这些细胞因子对iNOS转录和蛋白表达的抑制作用的信号转导系统的策略可能为IBD的治疗干预提供新的靶点。抑制NO生成是否对肠道炎症有治疗价值有待于对NOS亚型的进一步研究，可能还有待于开发选择性NOS抑制剂，在不改变组成酶对血管张力和细胞完整性的生理控制的情况下抑制iNOS过度产生NO。9
致谢
我们要感谢Carolyn F Male女士，FIMBS，她在巴斯皇家联合医院组织病理学部门的技术援助。这项工作得到了英国阿斯特拉基金会、英国全国结肠炎和克罗恩病协会(NACC)、英国威康信托基金会和希腊消化病学学会的支持。