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文摘gydF4y2Ba
背景gydF4y2Ba克拉霉素是最重要的抗生素之一gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba根除。然而,据报道,5 - 10%的菌株耐药。它已经表明,一个23 s rRNA基因的点突变与克拉霉素耐药性有关。gydF4y2Ba
的目标是gydF4y2Ba——建立聚合酶链反应(PCR)系统放大一段包含突变点的23 s rRNA基因与特定的引物gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba,所以gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染和与克拉霉素抗性相关的突变可以同时进行检查。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba——检测gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba同时感染和突变,特定的引物gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba23 s rRNA基因设计基于序列之间的保护gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba与其他细菌菌株和序列特异性相比。来自57个培养菌株的DNA和39胃液样本被放大seminested 23 s rRNA PCR。在85年评估病人的临床适用性。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba来自57个培养菌株的dna样本都放大。小说分析和脲酶PCR同意在37/39胃液样本没有假阳性。试验没有放大以外的其他细菌的DNAgydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba。八个85个样本的变异治疗之前。在克拉霉素治疗,消灭在2/5(40%)的突变和29/34(85%)没有突变。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba——使用胃液分析是快速(12小时内)和非侵入性(内镜不是必需的),启用快速启动适当的抗生素治疗。gydF4y2Ba
- 幽门螺杆菌gydF4y2Ba
- 根除gydF4y2Ba
- 克拉霉素gydF4y2Ba
- 电阻gydF4y2Ba
- 点突变gydF4y2Ba
来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba
幽门螺杆菌gydF4y2Ba是一种革兰氏阴性细菌驻留在人类胃。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba有机体中发挥着重要作用的发病机制不仅持久胃炎消化性溃疡和胃癌。gydF4y2Ba2 - 5gydF4y2Ba根除gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba可能会降低消化性溃疡和胃癌的风险。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba美国国立卫生研究院的发展共识会议推荐的抗菌药物antisecretory药物(质子泵抑制剂或HgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阻断剂)治疗患者gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染相关的消化性溃疡疾病。这些抗生素包括阿莫西林,克拉霉素,metrodidazole和通过一个星期的三联疗法根除率都在90%以上。gydF4y2Ba7 - 10gydF4y2Ba所有gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba菌株被证明是容易羟氨苄青霉素,但5 - 10%的菌株对克拉霉素,甲硝哒唑10 - 50%。gydF4y2Ba11 - 14号gydF4y2Ba在分析基于克拉霉素的治疗失败,CaylagydF4y2Ba等gydF4y2Ba报道说,根除在3/10(30%)克拉霉素耐药菌株与77/93(83%)相比,克拉霉素敏感菌株。gydF4y2Ba15gydF4y2BaDebets-OssenkoppgydF4y2Ba等gydF4y2Ba报道称,11/15例成功根除由于克拉霉素耐药性。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba这些观察结果表明耐药性的重要性评估之前和之后的治疗。gydF4y2Ba
最近,VersalovicgydF4y2Ba等gydF4y2Ba显示一个腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G)突变在域2143或2144 V的23 s rRNA的基因gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba与克拉霉素耐药性有关。他们还建立了一个聚合酶链reaction-restriction片段长度多态性(PCR-RFLP)测定使用引物守恒的大多数细菌之一。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba然而,这个试验有克拉霉素耐药性的评估需要事先细菌,文化,大约需要5到6天。23 s rRNA基因是守恒的各种细菌和污染会干扰测定。gydF4y2Ba
当前研究的目的是建立一个PCR系统放大一段包含突变点的23 s rRNA基因与特定的引物gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba,所以gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染和与克拉霉素抗性相关的突变可以同时进行检查。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
菌株和增长的媒体gydF4y2Ba
五十个七gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba胃活检标本中分离的菌株预处理日本病人和活检标本培养在哥伦比亚与5%琼脂(卷/期)马血和降低抗生素补充(英国贝辛斯托克Oxoid) 37°C microaerobic条件下5天(Campy-Pak系统;桶,马里兰州Cockeysville)。生物被确定为gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba通过革兰氏染色剂形态、菌落形态、和积极的脲酶、过氧化氢酶和氧化酶的活动。−80°C的隔离是布鲁氏菌汤(卷/卷)为5%胎牛血清(的边后卫)含有16%(卷/期)甘油。此外,31日克拉霉素耐药和27个敏感菌株先前确定的最低抑制浓度(MIC),从冻结的库存和使用。gydF4y2Ba
胃液样本gydF4y2Ba
胃液样本吸气一次性鼻胃管从39患者比较结果的脲酶PCR (URA所言)gydF4y2Ba18gydF4y2Ba19gydF4y2Ba和23 s rRNA PCR。更多的样品从85年28预处理和后处理患者用于临床应用。gydF4y2Ba
dna的制备gydF4y2Ba
培养基是离心5分钟10 000gydF4y2BaggydF4y2Ba和基因组DNAgydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba分离提取使用SepaGene从颗粒(Sanko Junyaku,日本)。从胃液样本,以避免可能的干扰物质在胃液中,gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba首次捕捉到兔子反gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba抗体(Dako / S,丹麦)固定在聚苯乙烯珠。从珠洗脱后,使用SepaGene DNA提取。DNA是储存在−20°C到使用PCR模板。gydF4y2Ba
序列分析23gydF4y2BargydF4y2Barna基因gydF4y2Ba
检查核苷酸保护该地区2143年和2144年在23 s rRNA侧面位置,我们放大七段约330个基点gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba菌株23 sf2(通过使用PCR引物的5′-GTGCGAAATTC——CTTGTCGG-3′,对应gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba23 s rRNA位置,2015 - 2034年)和23 sr (5′-GACCGCCCCAGTCAAACT-3′,位置,2343 - 2326年)。PCR产品被克隆到pCRII用最初的助教克隆工具(表达载体,圣地亚哥,加利福尼亚州)。插入的核苷酸序列是由双脱氧链终止程序。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba
特定的引物gydF4y2Bah幽门gydF4y2Ba和放大gydF4y2Ba
后分析序列中保护七临床孤立gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba菌株和序列特异性gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba与其他细菌在基因库报告相比,我们选择某种意义上底漆,CRF-4 (5′-AGTGGAGGTGAAAATTCC-3′,对应gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba23 s rRNA位置,2105 - 2123年),和两个反义引物,CRR-1 (5′-TAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3′,位置,2239 - 2221年),和CRR-3 (5′-ATTCCCATTAGCAGTGCT-3′,位置,2189 - 2172年)。小说seminested PCR试验因此CRF-4 / CRR-1屈尊于第一和CRF-4 / CRR-3内部PCR引物(23 s rRNA PCR试验)。PCR循环由变性在94°C 30秒,退火在50°C 30秒,并扩展为一分钟72°C: 30个周期进行第一第二PCR扩增和20周期。gydF4y2Ba
保证一个基因的检测胃液样本gydF4y2Ba
胃液的DNA样本也分析了使用引物组gydF4y2Ba尿素gydF4y2Ba前面描述的基因(URA所言PCR)gydF4y2Ba18gydF4y2Ba19gydF4y2Ba的结果与23 s rRNA PCR分析。gydF4y2Ba
特异性引物gydF4y2Ba
特异性的gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba小说的PCR引物,CRF-4 / CRR-1和CRF-4 / CRR-3被测试评估交叉反应和DNA样本提取12以外的细菌物种gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba。这些细菌种类gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba葡萄球菌epidermidisgydF4y2Ba,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba酿脓链球菌gydF4y2Ba,gydF4y2BaStrept缓和的gydF4y2Ba,gydF4y2Ba嗜血杆菌56gydF4y2Ba,gydF4y2Ba空肠弯曲杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba黄曲霉gydF4y2Ba,gydF4y2Ba变形杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba布兰汉氏球菌属复活gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
检测23年代gydF4y2BargydF4y2Barna基因突变与克拉霉素抗性有关gydF4y2Ba
检测在23 s rRNA G突变基因位置2143年和2144年,PCR产品消化5 U MboII和BsaI 37°C和55°C分别了两个小时。PCR产品包含2143 G变异显示两个小产品与MboII消化后,那些包含2144 G变异显示两个小产品与BsaI消化后,和那些不含突变显示未消化的扩增子。gydF4y2Ba
克拉霉素测定麦克风gydF4y2Ba
的敏感性gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba隔离克拉霉素是由琼脂稀释法评估。二十7株没有突变和6株突变进行了测试和麦克风决心。麦克风也决定31株从冻结的股票。gydF4y2Ba
临床应用gydF4y2Ba
23 s rRNA PCR的临床适用性评价共有85名患者接受反gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba治疗。gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染证实治疗之前的文化、显微镜、快速尿素酶试验和URA所言PCR分析。23年代rRNA-PCR发现了基因,有或没有突变,在治疗前所有科目。七十八名患者治疗;表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba总结了方案。抗菌治疗的结果评估完成后8周以上的治疗。胃液样本吸气与内视镜或鼻饲的字符串,和突变位置的2143年和2144年gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba23 s rRNA基因进行评估如前所述。gydF4y2Ba
治疗方案gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
费舍尔的确切概率测试使用。p < 0.05的值被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
序列分析23gydF4y2BargydF4y2Barna基因gydF4y2Ba
2042年到2281年之间的序列分析gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba23 s rRNA七临床分离株基因显示几个职位频繁核苷酸突变而其他人是守恒的。核苷酸是不同的从标准在所有临床分离的两个位置。一个应变(TN-5)相关的阻力2144 G突变(无花果gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
23 s rRNA 7 H螺杆菌菌株基因序列。23 s报告中报告基因序列(加入号码gydF4y2BaU27270gydF4y2Ba)。冒号表示认同。gydF4y2Ba
pcr扩增gydF4y2Ba
使用的引物23 s rRNA PCR鉴定,CRF-4, CRR-1 CRR-3,设计目标区域守恒的gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba但不是共享的其他菌株。使用10 ng的DNA提取文化,所有的DNA样本57gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba隔离了积极的第一步PCR扩增。23 s rRNA PCR的结果同意与胃液样本的PCR试验样品在37/39。重要的是,八负样本的PCR检测呈阴性也23 s rRNA PCR分析。因此,没有明显的假阳性(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。23 s rRNA的特异性PCR试验也证实了没有交叉反应和DNA样本来自12个细菌物种以外gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
比较PCR 23 s rRNA PCR和URA所言使用胃液样本化验gydF4y2Ba
检测突变gydF4y2Ba
23 s rRNA PCR产品孵化和两个限制性内切酶,MboII BsaI。八十五预处理患者进行调查,总的来说,8/85(9%)有一个点突变与克拉霉素抗性有关。只有一个样本与MboII消化,表明2143 A到G突变。7个样本与BsaI消化,表明2144 A到G突变。图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示了典型的例子。6所示的八株克拉霉素耐药的琼脂稀释法。剩下的两个没有测试,因为文化是不可用的。二十九31株已从冻结的股票和先前确定为2144年麦克风有克拉霉素耐药突变,只有一株2143年的突变。其余菌株没有突变在2143年或2144年。27株容易克拉霉素的琼脂稀释法没有突变在2143或2144(无花果gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
G突变的检测。PCR产品从四个菌株与MboII消化(通道1 - 4)和BsaI(通道1′4′)。菌株2有一个G变异在2143(巷2),有一个G突变菌株2144(巷1′),和3和4菌株没有突变在2143年或2144年。gydF4y2Ba
之间的关系在2143/2144 G变异和麦克风。所有与突变菌株在2143/2144被麦克风对克拉霉素耐药。一株耐麦克风但是没有突变。那些没有突变被麦克风容易克拉霉素。gydF4y2Ba
临床应用gydF4y2Ba
的突变gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba23 s rRNA基因被发现在8/85(9%)的样品之前获得治疗。30 9个病人,其中包括三名感染突变株,收到没有克拉霉素治疗方案。根除是实现1/3(33%)突变患者感染和12/36(33%)与野生型感染患者(NS)。治疗后,持续变异感染确诊治疗前两个病人突变株,但所有与野生型感染24例治疗前仍抱有野生类型。三十其他9名患者治疗方案包含克拉霉素;5以前突变株的治疗。根除在2/5(40%)的突变患者感染和在29/34(85%)与野生型感染患者(p < 0.05)。后处理23 s rRNA PCR试验揭示了克拉霉素耐药性突变在3/3(100%)突变患者感染治疗和2/5(40%)野生型患者感染治疗之前。因此,变异株感染的比例增加到5/39(13%)的5/8(63%)在这一组中(表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
结果临床应用gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
我们已经开发出一种可以检测试验gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染高灵敏度,同时评估克拉霉素耐药性。23 s rRNA基因中相当保守的各种细菌物种,PCR扩增的DNA直接从胃中提取活检或胃液样本可能会影响到其他细菌的23 s rRNA基因如果使用非特异性引物。因此,检测23 s rRNA基因的突变与克拉霉素抗性与引物需要共识文化之前提取的DNA和PCR-RFLP;这大约需要10天。相比之下,我们的小说分析不需要文化,可以在12小时内完成评估gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba同时感染和克拉霉素抗性。高灵敏度的测定是由于良好的保护目标之间的引物序列gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba菌株。PCR扩增的seminesting以其高灵敏度也是必不可少的。这部小说23 s rRNA PCR和在PCR同意在37/39胃液样本。重要的是,23 s rRNA PCR导致没有假阳性结果。gydF4y2Ba
克拉霉素的抗gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba据报道,是由于23 s rRNA的点突变Versalovic吗gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba我们证实,这一发现也适用于gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba在日本隔离。我们测试了37克拉霉素耐药菌株和敏感菌株27日由麦克风;0/27 36/37耐药菌株和敏感菌株的变异。这些结果表明,大多数对克拉霉素耐药菌株23 s rRNA基因的突变。然而,一克拉霉素耐药菌株没有突变位置2143年或2144年我们的分析和序列分析(数据没有显示)和阻力的机理还有待研究。gydF4y2Ba
在目前的研究中,36/38(95%)和与克拉霉素抗性相关的突变菌株揭示了2144 G突变位置,和只有2/38(5%),在2143年。最近,石头gydF4y2Ba等gydF4y2Ba显示更高水平的阻力与一个2143 G变异。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba7株检查在这项研究中有麦克风值大于50μg /毫升,和其他耐药菌株的麦克风范围从3 - 32μg /毫升。隔离的麦克风水平相对较低,可能与高发病率的2144 G突变位置在日本。虽然克拉霉素耐药菌株的总体发病率在日本和西方国家,类似突变位置的差异可能影响根除率的克拉霉素治疗。进一步证实了这些观察,临床试验使用这种分析是必要的。gydF4y2Ba
最近有报道称2143 C突变位置也与克拉霉素抗性有关。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba作者还报告说,7%的克拉霉素耐药菌株有这种突变。我们的分析是无法检测到C突变。然而,在37克拉霉素耐药隔离由麦克风,我们没有发现与C突变菌株,并测定的敏感性似乎几乎足够了,至少在日本。在其他国家的临床适用性试验需要调查。建立一个更敏感的检测系统,我们正在开发一个试验来检测所有mutaions与克拉霉素抗性有关。gydF4y2Ba
反gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba克拉霉素治疗,加上羟氨苄青霉素和质子泵抑制剂,是当前标准协议之一。然而,几项研究已经表明gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba基于不成功的克拉霉素治疗后可能成为克拉霉素耐药。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba16gydF4y2Ba事实上,目前的研究证实遗传型的克拉霉素耐药性的出现。它也表明,根除率通过基于克拉霉素方案显著突变体和野生型感染之间的不同。因此,方案不包含克拉霉素与突变病例可能是可取的gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染。变异株感染的流行情况中可能是高初始克拉霉素治疗未能根除实现为基础,和突变的评估将在这种情况下更重要。23 s rRNA聚合酶链式反应的技术,这项技术不需要文化和可以使用胃液样本,在这些情况下可能是有用的。gydF4y2Ba
总之,我们已经建立了一个高度敏感的seminested PCR试验的检测gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染和23 s rRNA突变的评估与克拉霉素抗性有关。通过胃液样本,测定快速(过夜)和微创(不需要执行活检),和病人可使用适当的抗生素治疗,基于知识的抵抗感染的有机体。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
部分在美国胃肠病协会会议在华盛顿特区,1997年5月10到16。gydF4y2Ba