条文本
PDF
文摘
背景产肠毒素的菌株脆弱拟杆菌(ETBF)与牲畜和腹泻疾病的孩子,但他们的角色在成年人类结肠疾病是未知的。
的目标是——调查反应主要成人结肠上皮细胞纯化B fragilis毒素(BFT)。
方法bft是从文化的上层清液高度纯化ETBF产毒素的菌株。原发性结肠上皮细胞,形态变化反应纯化BFT,研究了在机关文化的结肠活检标本15个成人。
结果bft诱导上皮细胞细胞毒性在结肠活检标本12/15科目。的BFT诱导形态变化的特点是上皮细胞舍入,从邻近细胞分离,从基底膜和超然。在严重影响标本,几乎所有的上皮细胞受到影响。有对象之间的异质性的速率BFT诱导上皮细胞发生细胞毒性。此外,在结肠活检标本三个主题,接触BFT没有引起任何显著的上皮细胞形态变化。
结论bft能够诱导细胞毒性在初级成人结肠上皮细胞。这种效果ETBF派生BFT在结肠上皮细胞的体内会导致粘膜炎症和腹泻。异质性的响应主要colonocytes可能反映了host-BFT交互作用的结果。这样的交互体内可能确定结肠疾病的发生在某些人而不是其他人的。
- 脆弱拟杆菌
- 肠毒素
- 上皮细胞
- 细胞凋亡
来自Altmetric.com的统计
脆弱拟杆菌是一种革兰氏阴性杆菌通常居住在人类和动物的结肠内腔。1,2在1980年代,肠毒素的生产菌株B fragilis(ETBF)与年轻的农场动物的粪便。3 - 6产肠毒素的活动显示了这些菌株引起流体的能力积累在羔羊的结扎肠循环。3在后续的研究中,细胞的肠毒素被证明产生舍入人类HT29细胞癌行和基于这一特征,ETBF的体外试验检测了。7号到9号最近的ETBF肠毒素蛋白质纯化,证明是20 kDa metalloprotease活动。10,11当注入肠循环、净化B fragilis毒素(BFT)诱发流体积累和炎症12和对HT29细胞诱导细胞毒性反应。10
在三个研究中,ETBF一直与腹泻相关疾病在孩子一岁。13 - 15尽管ETBF孤立从成年人类粪便样本,16,17其诱发肠道疾病的能力在这些个人是未知的。ETBF一直在粪便样本中发现正常的成年人以及那些有腹泻,可能是细菌可以诱导结肠疾病,通过分泌BFT,在某些人而不是其他人。引起疾病第一宿主细胞BFT必须与在结肠上皮细胞。我们已经调查了上皮细胞反应BFT机关文化的结肠活检标本来自成年人接受结肠镜检查。
材料和方法
净化BFT
BFT从一个高度纯化产毒素的菌株ETBF(11295年国家反恐怖主义中心的)如前所述Van流苏等。10简单地说,B fragilis国家反恐怖主义中心的11295厌氧生长在37°C预还原脑心浸液肉汤16小时。BFT是从文化上层清液净化顺序硫酸铵沉淀,离子交换色谱法对Q-Sepharose(法玛西亚生物技术,布鲁塞尔,比利时),疏水作用色谱法对苯基琼脂糖(σ化学有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国),和高分辨率的离子交换色谱Mono-Q列(法玛西亚生物技术,布鲁塞尔,比利时)。
净化毒素的监测由其细胞毒性效应对HT29细胞(来自欧洲的动物细胞培养,Porton下来,英国)的特点是细胞舍入。7号到9号BFT表达的细胞毒性滴定度的倒数的最高稀释毒素导致超过50%的舍入HT29细胞后四个小时。8,18细胞毒性单元(CU)被定义为最低数量的毒素,引起了积极的响应HT29细胞(50%细胞在四个小时四舍五入)。我们纯化的细胞毒性滴定度(股票)BFT范围从240到40 960立方,蛋白质浓度的1 - 5μg /毫升。BFT被冻结(−20°C)净化后立即在整除,滴定度测试之前和之后的应用程序在器官培养结肠活检标本。
中和细胞毒性的研究了纯化BFT用山羊anti-BFT抗血清(TD威尔金斯博士的礼物,弗吉尼亚理工学院和州立大学的布莱克斯堡,弗吉尼亚州,美国)。19
机关文化研究
结肠活检标本从接受结肠镜检查的患者获得临床适应症(监测息肉、调查神秘的出血和排便习惯的改变)。除了活检标本进行常规检查(这都确认是正常的),附加的样本取自乙状结肠机关文化研究。这些研究的伦理委员会批准女王医疗中心和额外的样品只有获得知情同意后。
机关文化研究进行成对使用独立的活检标本来自同一地区的乙状结肠。机关文化是如前所述,20.除了标本培养缺乏血清(RPMI只)。总之,结肠活检标本被立即RPMI(美国Gibco BRL,马里兰州),在五分钟内删除,在培养皿放置在不锈钢网(猎鹰,正欲,林肯,新泽西,美国)包含prewarmed (37°C) RPMI和BFT(在最终的浓度256 - 2048立方/毫升)或同样体积的控制缓冲区。文化的菜肴被放置在一个密封室,平衡O为95%2/ 5%股份有限公司2,孵化37°C。后不同时间间隔(两个,四个,18小时),活检标本放置在0.9%氯化钠含有10%福尔马林(常规组织学处理)或电子显微镜的固定剂。样本处理电子显微镜如前所述。21
结果
净化BFT
证实了净化BFT钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)分析之后,银染色,显示的存在一个乐队20 kDa的蛋白质。免疫反应性的纯化BFT也证实了免疫印迹分析(没有显示)。取消对HT29细胞的细胞毒性BFT通过预孵化anti-BFT中和抗体(数据未显示)。
机关文化研究
形态改变上皮细胞光和透射电子显微镜研究了结肠活检标本培养的组织部分BFT的存在与否。BFT的影响仅仅是研究当时的上皮完整性保护配对控制标本。在机关文化的研究标本共20个主题,两个被排除在分析因为部分控制标本都不满意。
结肠活检标本的初步研究,接触三个成年受试者未分离的上层清液ETBF(至少需要补充16至32铜/毫升)并没有造成任何上皮细胞形态变化。所有后续的器官使用纯化BFT文化进行了研究。
暴露于纯化BFT(256 - 2048立方/毫升)诱导上皮细胞标本中细胞毒性实验对象(表12/151)。一般来说,序列的变化影响标本的特征是:最初的上皮细胞舍入的病灶部位,从邻近细胞分离,分离从基底膜(无花果1A)。这些早期的变化通常是最初仅限于表面上皮细胞(图1与后续的参与)隐窝上皮细胞经过长时间的文化。严重影响标本的大多数细胞脱离基底膜(无花果1B)。除了空泡形成,大量的分离,分离colonocytes显示细胞发生细胞凋亡的形态学特征(无花果1C,2B, C)。
显微照片的苏木精和伊红染色部分结肠活检标本(主题3表1)暴露于BFT 18个小时两个小时(A)和(B, C)。BFT使用最后一个2048立方/毫升的浓度。配对控制标本(D)是培养RPMI(+控制缓冲)18个小时。有保护上皮完整性控制活检样本。标本暴露于毒素的两个小时有焦点脱离表面上皮细胞(的效果)。18小时后接触BFT表面和隐窝上皮细胞都严重影响:他们是圆形的和大部分已经成为从基底膜分离,相互借鉴。所示(C),有上皮细胞舍入,从基底膜分离、空泡形成。一些细胞显示细胞凋亡的形态学特征(标有箭头的)。
透射电子显微图的控制(A)和BFT暴露(B, C)结肠活检标本培养了四个小时。的显微图BFT暴露活检标本有明显的空泡形成(B)。凋亡上皮细胞也见过(标有箭头的)。酒吧= 1μm。
有对象之间的异质性的速率BFT诱导上皮细胞发生变化。因此在一个主题(没有在表81),没有上皮细胞变化被认为在四个小时但轻度至中度BFT诱导上皮细胞细胞毒性被认为文化18小时后。结肠活检标本这个话题受到的最高浓度BFT(2048立方/毫升)用于本研究。在另一个主题(没有在表11),没有改变被认为文化与BFT后两个小时,但四个小时后观察局灶性上皮细胞毒性。在结肠活检标本三个科目(nos在表13 - 151),接触BFT(最近小时)没有引起任何显著的上皮细胞形态变化。细胞毒性活性BFT结束时再次确认所有器官培养研究,运用文化上层清液HT29细胞。
讨论
尽管ETBF与腹泻相关疾病的儿童,13 - 15导致肠道疾病的成年人是未知的。BFT已经检测到与腹泻粪便样本的成年人,滴定度从80到5120立方。17因此,肠毒素存在于结肠内腔体内的浓度用于这项研究。我们相信ETBF没有引起任何的未分离浮在表面的上皮细胞形态变化,因为只有低浓度BFT(至少需要补充16至32铜)。我们的研究表明,在高浓度的BFT,细胞毒性是主要出现在人类结肠上皮细胞的成年人。的BFT诱导结肠上皮细胞的形态学变化与肠组织中所描述的动物自然感染ETBF22或管腔内的接种后ETBF或纯化BFT。12,第23 - 25这些变化包括焦领域参与的上皮细胞四舍五入,空泡形成,从邻近细胞分离,从基底膜和超然。BFT诱导形态变化在我们的研究中也观察到类似接触后主要人类colonocytes净化艰难梭状芽胞杆菌毒素。20.C固执的是抗生素相关的病原学的代理pseudomembranous结肠炎和疾病是通过分泌毒素介导的。26C固执的毒素也诱导上皮细胞生产的多形核的细胞化学引诱物,白介素8(引发)20.,27这可能发挥重要作用在启动人类结肠炎症。28主要人类结肠上皮细胞的物理分离,从彼此和基底膜,也引发引发生产和释放(由细胞凋亡和后续colonocyte死亡)。20.如图所示在我们目前的研究中,并报告在最近的一次初步沟通,29日BFT同样促进原代人结肠上皮细胞的分离。因此,我们假定BFT能够启动体内结肠炎症colonocytes受伤和诱导引发释放。事实上,注射纯化BFT结扎动物肠道循环可以引起急性炎症。12
体外研究使用汇合的层的派生HT29结肠上皮细胞癌行表明BFT扰乱屏障功能。30.BFT诱导分离和舍入HT29细胞也被报道与增强掩饰的选择通过暴露侧膜肠细菌菌株。18这样的影响BFT体内暴露底层固有层淋巴细胞和巨噬细胞腔的细菌和他们的产品通过毛孔在基底膜,31日与潜在的粘膜炎症的进一步恶化。
感兴趣的是,在我们的机关文化的研究中,有异质性反应BFT来自不同个体的结肠上皮细胞。一方面,没有改变colonocytes活检标本中看到一个个体,尽管接触BFT 18个小时。相比之下,严重的细胞毒性的表面和结肠粘膜隐窝上皮细胞样本许多个体,在四小时的接触BFT。在两个主题,上皮细胞细胞毒性不是最初观察到,但是在之后的时间点发生(4和18小时)。
单独的活检标本的同一地区乙状结肠被用于测试和控制机关文化,在不同时期。有可能因此,我们的结果也反映出异质性在应对BFT活检标本来自同一个人。然而,我们相信,这是极不可能的上皮细胞的细胞毒性反应(BFT)总是在之后的时间点发生的如果一个人被认为在早期的时间点(对象2、3、4、5、6、10、11日和12日在桌子上1)。
原因结肠上皮细胞的异质性个体之间在反应可能包括大量的毒素达到表面的上皮细胞和随后BFT-host细胞相互作用的结果。同样,体内结肠中的host-BFT交互的结果可以确定结肠疾病的发生在某些人而不是其他人的。的浓度BFT到达colonocytes ETBF将取决于其生产和组件表面的黏液层的程度能够抑制上皮细胞表面的渗透。这些组件的宿主防御包括黏液糖蛋白和分泌IgA抗体。32
除了上述毒素诱导形态变化,可能还有其他相似之处ETBF和产毒素的C固执的。高浓度的睡着C固执的毒素的主要人类结肠上皮细胞已被报道。20.此外,很大一部分的住院成人无症状携带者产毒素的C固执的。33,34
进一步的研究应该允许描述的作用ETBF感应的腹泻和结肠疾病的成年人。这些研究包括调查的健康成年人和腹泻粪便样本ETBF和BFT的存在。我们假定在易感个体,由于ETBF腹泻会与BFT诱发炎症。结肠活检标本的组织学检查患者的腹泻,大便中检测到在他们自由BFT样本,应该允许这个假设进行测试。
确认
这项研究是由英国医学研究理事会。设备使用的电子显微图研究由威康信托基金会,我们感谢特雷弗灰色的援助。礼宾部主管在休假从史博士迪Microbiologia帕尔马,意大利和支持的帕尔玛大学和中国北车(合同编号。96.03300.CT04)。