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摘要
背景-虽然瘦素(一种脂肪细胞衍生的激素，调节食物摄入和能量平衡)在注射肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素1后释放，但在慢性炎症中血浆浓度尚未被表征。瘦素可能与厌食症和体重减轻有关，特别是与炎症性肠病的急性期有关。
目标目的探讨不同动物模型肠道炎症时间过程中血浆瘦素浓度的变化。
方法-测定三硝基苯磺酸(TNBS)致大鼠结肠炎、吲哚美辛致回肠炎、脂多糖(LPS)致内源性休克大鼠不同时间点血浆瘦素水平。急性炎症期间还测量了全身TNF-α。
结果- TNBS结肠炎诱导后8小时血浆瘦素浓度增加4倍(p<0.0001)，单独给药后增加2倍(p<0.02)。治疗后第一天的血浆瘦素反应与髓过氧化物酶活性和总损伤评分相关。在吲哚美辛诱导的回肠炎和内源性休克大鼠中也观察到类似的瘦素过表达。TNBS治疗大鼠的血浆浓度在第5天低于对照组，在第14天达到相似的浓度。在tnbs后的头4天观察到厌食和体重减轻。仅在LPS处理的大鼠中检测到全身TNF-α的显著增加。
结论-血浆瘦素浓度升高，与炎症程度相关，并与厌食症有关，在实验性肠道炎症的早期阶段在大鼠中被诱导，但被证明是短暂的;这可能解释了最近关于炎症性肠病患者的浓度结果的差异。
- 瘦素
- 炎症性肠病
- 实验性大鼠肠道炎症
- 肿瘤坏死因子
- 内毒素休克
- 厌食症
来自Altmetric.com的统计数据
瘦素是ob基因的蛋白产物，是一种主要由脂肪细胞分泌的循环激素。它被认为是一种激素反馈信号，通过控制食物摄入、代谢率和体重平衡的下丘脑机制调节脂肪组织质量。1，2从各种非神经元组织，如肺、肾、肝、性腺、脂肪和淋巴结，以及胃、小肠和结肠中克隆瘦素受体cdna，3 - 5说明瘦素也有下丘脑外作用。越来越多的证据表明，瘦素在生殖等许多系统中发挥着各种意想不到但重要的作用6和造血作用。7，8在啮齿动物和人类中，瘦素受体以几种交替剪接的形式产生。这个长亚型与I类细胞因子受体家族的成员具有同源性。3.这与先前的结构预测一致，表明瘦素可以折叠成细胞因子样结构。9
炎症性肠病(IBD)通常以发作期为特征。厌食、静息能量消耗增加和体重减轻是这些疾病的显著特征，特别是在急性期。10 - 12尽管几十年来做出了巨大的努力，但这些严重消耗性疾病的病因仍然是个谜。最近有研究表明，瘦素在急性感染引起的厌食症中起作用。腹腔注射内毒素或促炎细胞因子(肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素1 (IL-1))导致空腹仓鼠脂肪组织中瘦素mRNA表达和循环中瘦素浓度的急性升高13和老鼠。14仓鼠血浆瘦素的增加与食物摄入量的减少有关。迄今为止，另外两项研究表明，人类瘦素血症受IL-1α的控制15和肿瘤坏死因子。16然而，尚不清楚瘦素浓度是否在慢性炎症期间发生改变。简单的动物炎症模型与常见的人类肠道炎症非常相似，这有助于本研究的开展，在本研究中，瘦素和TNF-α在不同的实验炎症的时间过程中被研究。采用三硝基苯磺酸(TNBS)诱导大鼠结肠炎模型，为研究不同炎症阶段血浆瘦素模式提供了可能。在吲哚美辛引起的急性溃疡性回肠炎中也研究了这些浓度的变化。最后，将我们研究结果的特异性与大鼠脂多糖(LPS)内毒素休克诱导后获得的结果进行了比较。
方法
动物与实验设计
实验开始时体重380-390 g的雄性Wistar大鼠从法国Janvier实验室(Le Genest, St Isle, France)获得，然后单独饲养在温度控制的房间(约22°C)，从早上8点开始进行12小时的明暗循环。他们可以免费获得水，并根据下面描述的方案提供标准的啮齿动物饲料。实验前，先对动物进行几天的饮食和饲养条件适应。所有实验均按照INRA(法国)动物护理和使用委员会的规定进行。在治疗前三天和治疗后的所有天内，通过从前一天减去每天的食物箱重量来测量24小时的食物摄入量。在监测食物摄入量期间，每天给大鼠称重。
所有实验均于上午8点开始，并在被剥夺食物11小时但可自由饮水的动物中进行(在黑暗周期开始后1小时，即晚上9点停止进食)。在诱导炎症前，从尾静脉采集空腹血样，并按如下方法测定基础瘦素和TNF-α浓度。此外，在8点时测定了自由喂养大鼠(n=16)的血浆瘦素浓度。三种不同的炎症模型:TNBS诱导的结肠炎、吲哚美辛诱导的急性溃疡性回肠炎和LPS内毒素休克，在肠道炎症的时间过程中从尾静脉采集空腹血样。在肝素包被的聚丙烯管中采集血样，在4°C下3000 rpm离心20分钟，上清清血浆在- 70°C保存至化验。实验结束后，大鼠被麻醉，并在上午9点至11点之间打开腹部。下腔静脉采血，切开肾周脂肪垫和附睾脂肪垫称重。吲哚美辛模型切除胃、小肠、盲肠和结肠，TNBS模型只切除回肠和结肠。纵向切开脏器和组织，用生理盐水冲洗以清除粪便物质，并将脏器和组织放在最上面的板上进行宏观评分。此外，通过髓过氧化物酶(MPO)活性评估肠道炎症的严重程度，MPO是粒细胞浸润的指标。 For this purpose, full thickness tissue samples were removed from macroscopically damaged tissue (inflamed rats) as well as from normal tissue (control rats), snap frozen in liquid nitrogen, and stored at −70°C for MPO assay.
三硝基苯磺酸致结肠炎
这个模型在其他地方有详细的描述。17简单地说，禁食大鼠用戊巴比妥麻醉，第1天单次结肠内给药2,4,6-三硝基苯磺酸(80 mg/kg)溶解在40%乙醇中，诱导结肠炎。将治疗当日新配制的1 ml溶液用套管注入肛门近端8 cm处的结肠，留置1分钟，以确保tnbs -乙醇溶液不会立即被大鼠排出。然后让大鼠保持头朝下的姿势30分钟。
TNBS治疗大鼠分为3组，分别于第2天(n=6)、第6天(n=5)、第15天(n=5)处死。3个对照组在第1天用无菌无热原、等渗0.9%生理盐水1 ml代替TNBS，在第2天(n=6)、第6天(n=6)和第15天(n=6)处死。在治疗后4、8、12和24小时从尾静脉采集空腹血样。同样，在第5天的上午8点和下午5点以及第6天的上午8点抽取样本。最后，在第14天和第15天的相同时间点抽取样本。为了确定单独乙醇处理的效果，第4组大鼠(n=5)在第1天用乙醇(40%乙醇，1 ml)处理，第2天处死。分别于乙醇后4、8、12、24小时抽取空腹血样。
吲哚美辛诱发回肠炎
如前所述，喂养大鼠(n=7)两次皮下注射吲哚美辛(花生四烯酸环氧化酶途径抑制剂)诱导回肠炎。18两次注射(10 mg/kg, 5%新鲜配制的NaHCO)3.37℃)隔24小时给药;第1天第2次注射吲哚美辛。在第2天(第二次注射后24和33小时)和牺牲前第3天(第二次注射后48小时)从尾静脉采集空腹血样。这一程序是根据山田的建议通过的等18动物喂养应观察肠炎，并提供与TNBS诱导结肠炎方案相似的禁食期。
内源性休克的诱导
禁食大鼠(n=6)腹腔注射LPS 1 ml大肠杆菌血清型0127:B8以5 mg/kg的剂量溶解于无菌无热原，等渗0.9%生理盐水中。为了建立LPS内毒素休克后24小时血浆瘦素浓度的动力学，在治疗后4、8、12和24小时采集空腹血液样本。lps后24小时处死大鼠。
评估炎症严重程度
宏观得分
对于TNBS诱导的结肠炎模型，总体炎症指数根据先前描述的量表进行宏观评估。17每个结肠在这个量表上被分配一个分数，从0(正常)到15(严重损伤)，表明溃疡，结肠壁的严重炎症和腹泻。对于吲哚美辛回肠炎模型，使用最近描述的标准分配总炎症评分(0-7)。19
髓过氧化物酶活性测定
采用Krawisz法测定肠道多形核中性粒细胞原代颗粒特异性酶标记物MPO的活性等20.稍加修改。简单地说，肠道组织样本(约50 - 100毫克)在冰上用polytron(13 500转/分，1分钟)在0.5%十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)溶液中均匀化(HTAB, pH 6.0，每50毫克组织1毫升)。得到的匀浆经过三次快速冷冻(- 70°C)和解冻(浸泡在温水中，37°C)循环。然后将样品离心(4000 rpm, 15分钟，4°C)以去除不溶性物质。在加入含有0.167 mg/ml磷酸盐缓冲液(50 mM, pH 6.0) 2.88 ml后，用分光光度法测定含有0.1 ml上清的MPOo-盐酸二苯胺和0.0005%过氧化氢。测定了在470 nm处吸光度变化动力学。用已知MPO单位活性的标准曲线计算样品酶活性。一个单位的MPO活性，定义为在室温下一分钟内能将1 μmol过氧化氢转化为水的酶的数量，以单位每克组织表示。
血浆中瘦素和tnf -α的测定
血浆瘦素浓度采用双抗体放射免疫测定(RIA)试剂盒(Linco Research, St Charles, Missouri)，以大鼠标准为基础，重复测量。简而言之，该RIA涉及大鼠瘦素样本与125结合兔抗瘦素多克隆抗体的大鼠瘦素示踪剂。检测灵敏度极限为0.5 ng/ml;测定内变异小于7%，测定间变异小于9%。
血浆TNF-α浓度由市售酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(大鼠TNF-α超灵敏，Biosource，法国)一式两份测定。TNF-α最低检测剂量小于0.7 pg/ml，测定间和测定内变异系数均小于10%。
化工产品和药品
从Sigma (France)公司获得以下产品:苦基磺酸(2,4,6-三硝基苯磺酸，TNBS)，吲哚美辛，脂多糖(LPS)大肠杆菌血清型0127:B8，十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)，和o邻联茴香胺盐酸盐。
统计分析
使用未配对的Student’s进行统计分析t测试。p值小于0.05被认为是显著的。结果显示为平均值(SEM)。血浆瘦素浓度表示为基线变化，以调整基线差异。计算tnbs后、乙醇后和生理盐水后24小时动力学曲线下零值以上的面积。
结果
食物摄入量和体重的变化
TNBS治疗大鼠和对照大鼠在治疗前24小时的食物摄入量相似(分别为29.2 (0.5)g和27.9 (0.8)g)。与预处理基线相比，结肠内注入生理盐水并没有减少食物摄入，而TNBS诱导的结肠炎在前72小时内与显著抑制的食物摄入相关(p<0.0001)1一个)。
大鼠结肠内给药(箭头)TNBS或生理盐水后13天的每日(24 h)食量(A)和体重(B)。第0天为预处理基线。值是平均值(SEM)。生理盐水与TNBS差异有统计学意义，*p<0.05， ***p<0.001，†p<0.0001。
食物摄入量的变化与体重的变化是平行的1B).大鼠在诱导炎症后24小时内体重下降(p<0.05)，第3天和第4天体重下降幅度最大(p<0.001)。试验结束后，尽管自由采食，它们的体重仍比对照组低10% (p<0.05)。尽管脂肪垫称重可能不准确，并且由于体脂含量的杂合差异可能存在差异，结肠炎导致第6天肾周脂肪含量降低25% (p<0.05)。第15天，肾周脂肪含量和附睾脂肪含量分别比对照组低25% (p<0.05)和29% (p<0.05)。
TNBS诱导的结肠炎和急性溃疡性回肠炎的评估
表格1显示结肠炎的严重程度，并通过测量第2、6和15天的MPO活性进行宏观评估。在结肠炎大鼠中，在第2天和第6天开腹时发现附着在邻近器官上的远端结肠的严重炎症扩张段。在第15天，病变节段的炎症和扩张已经减少，而与邻近器官的粘附仍然存在。
当TNBS大鼠的结肠腔在第2天和第6天打开时，可以注意到严重发炎的红色水肿粘膜，溃疡通常累及整个肠周。深部溃疡随机从注射部位延伸至回肠回盲交界处，周围被增厚的炎症组织包围(第2天死亡的大鼠增厚5-6厘米，第6天死亡的大鼠增厚3-4厘米)。第15天，受影响的结肠增厚，两个充血部位扩张较少，粘膜溃疡愈合。只注射40%乙醇的大鼠，在结肠注射后一天被杀死，显示结肠粘膜广泛(约2厘米)出血性坏死，无溃疡。即使在TNBS治疗后仅24小时检测组织，跨壁MPO活性也比未发炎的对照组增加了约26倍1)。
吲哚美辛在回肠浆膜一侧产生大量可触及的白色结节，在小肠中部出现扩张、粘连和充血区。观察邻近肠袢间粘连，肠系膜及附睾脂肪垫及肠系膜出血。当肠腔纵向打开时，发现吲哚美辛总是产生多个深纵向溃疡，并有许多圆形病变。这些溃疡累及整个肠壁周长及回肠长度，可达15-35厘米。平均炎症指数增加到5.7 (0.3)(p<0.0001)，回肠MPO活性与对照组相比增加了4倍(5.4(0.4)对1.3 (0.5)U/g组织，p<0.0001)。
血浆瘦素浓度
诱导炎症前，自由喂养大鼠(n=16)血浆瘦素浓度为5.01 (0.43)ng/ml，禁食11 h大鼠(n=47)血浆瘦素浓度为1.45 (0.09)ng/ml。禁食35小时后，给予生理盐水的对照组(n=6)瘦素浓度降至0.53 (0.04)ng/ml。数字2显示了TNBS诱导结肠炎时间过程中瘦素浓度的变化。与接受生理盐水的对照组相比，结肠炎诱导后8小时和12小时，这些浓度分别增加了约4倍和3倍(图2)2A)。在乙醇处理的大鼠中，这种增加较低(与接受生理盐水的对照大鼠相比，乙醇处理后8小时约为两倍，p<0.005)，并且在乙醇处理后24小时不存在，而TNBS诱导的结肠炎大鼠则持续存在(图5)2A)。此外，在生理盐水、乙醇和tnbs治疗后的第一天，血浆瘦素曲线下的区域与MPO活性有高度显著的相关性(r=0.84, p<0.0001, n=17;无花果3.)和宏观分数(r=0.95, p<0.0001, n=17)。在吲哚美辛诱导的急性回肠炎中，早期肠道炎症也会增加血浆瘦素浓度4)。注射内毒素增加了这些浓度，在12小时达到峰值，24小时后下降(图2)5)。虽然TNBS处理大鼠的MPO活性在第6天仍然很高(表1)1)，血浆瘦素浓度在第5天与接受生理盐水的对照大鼠相比显著降低(图2)2B)。在第15天，瘦素浓度和MPO活性与接受生理盐水的对照组没有显著差异(图2)2C)。
大鼠结肠内给药TNBS、乙醇或生理盐水后(箭头)血浆瘦素浓度在第1天和第2天(A)、第5天和第6天(B)、第14天和第15天(C)的变化。数值为平均值(SEM)。与生理盐水比较，*p<0.05， **p<0.01， **p<0.001，†p<0.0001。与TNBS有显著差异，χ p<0.05，§p<0.001。
tnbs、乙醇和生理盐水治疗后第一天血浆瘦素浓度变化曲线下面积(AUC)与治疗后24小时测量的MPO活性的相关性。每个点代表1只大鼠的值(n=17)， p<0.0001。
吲哚美辛致回肠炎模型第2天和第3天血浆瘦素浓度的变化。所有大鼠每天皮下注射吲哚美辛(n=7)或生理盐水(n=6)，间隔24小时，第二次注射为第1天。值是平均值(SEM)。*与生理盐水差异显著，p<0.05。
大鼠腹腔注射脂多糖(n=6)或生理盐水(n=6)后第一天血浆瘦素浓度的变化。值是平均值(SEM)。与生理盐水比较，*p<0.05， **p<0.01，†p<0.001。
血浆tnf -α浓度
在诱导炎症前，血浆中检测到低浓度的TNF-α (11.5 (1.5) pg/ml, n=12)或检测不到TNF-α (n=35)。lps后8小时，血浆TNF-α浓度显著升高(59.3 (4.4)pg/ml, n=6, p<0.0001)，而在tnbs后8小时和吲哚美辛诱导的回肠炎模型第2天，血浆TNF-α浓度未见明显升高。
讨论
本研究研究了已建立的肠道炎症实验模型不同阶段的血浆瘦素浓度，特别确定了TNBS诱导的大鼠结肠炎早期的过表达与炎症程度相关，并与厌食有关。在急性吲哚美辛诱导的溃疡性回肠炎和内毒素休克大鼠中也观察到类似的过表达。过表达是短暂的，在TNBS治疗后5天消失，尽管结肠炎评分持续较高。
虽然先前的研究表明，在动物腹腔注射细胞因子或内毒素后，血浆瘦素浓度增加，13，14目前的研究提供了动物炎症模型中这种增加的第一个直接证据。瘦素浓度升高与早期炎症之间的关系应首先讨论。如前所述，17，18，21诱导大鼠肠道炎症导致TNBS诱导结肠炎前5天和吲哚美辛诱导回肠炎第2天宏观评分和MPO活性显著升高。正如其他地方报道的那样，22，23乙醇单独引起的短暂炎症反应比TNBS治疗后的炎症反应不明显。在这些炎症模型中，血浆瘦素在炎症的第一天显著增加。在tnbs后8和12小时，尽管禁食，肠道炎症与血浆瘦素浓度相关，接近自由喂养大鼠的记录。单独使用乙醇也会增加血浆瘦素浓度，但程度低于TNBS。此外，在治疗后第一天，血浆瘦素反应与MPO活性和宏观评分显著相关，表明瘦素释放取决于肠道炎症的程度。乙醇后24小时瘦素过表达消失，而tnbs后尽管禁食35小时，瘦素过表达仍持续24小时，这支持了这一假设。这种过表达并不局限于TNBS诱导的结肠炎，因为在急性吲哚美辛诱导的溃疡性回肠炎和腹腔注射高剂量LPS后，也观察到血浆瘦素浓度升高。先前的报道显示，注射LPS后，仓鼠和小鼠瘦素过表达;13，14虽然没有研究血浆瘦素释放的动力学。在目前的研究中，血浆瘦素仅在早期炎症反应中升高。同样，在接受IL-1α治疗的癌症患者中，血浆瘦素浓度升高，在24小时内与IL-1α剂量相关，尽管持续给予IL-1α治疗，但在治疗第5天恢复到预处理浓度。15同样,Zumbach等，16他研究了反复输注TNF对实体肿瘤患者瘦素的影响，注意到输注后12小时血浆浓度升高，但在24小时内恢复到基线水平。
相反，血浆瘦素浓度在TNBS诱导的结肠炎第5天降低。继发性表达不足可能有几个原因。首先，患有TNBS诱导结肠炎的大鼠体重比对照组轻10%，脂肪组织质量减少，这可能降低了血浆瘦素浓度。其次，由于TNBS大鼠在前四天严重减少了食物摄入量，因此它们的禁食时间比健康大鼠要长。ob基因在进食后表达增强，禁食后表达减少，这一事实可能部分解释了在这些大鼠中观察到的瘦素表达不足。这与在禁食三天的非肥胖者中观察到的血浆瘦素浓度的大幅下降是一致的，尽管有轻微的体重减轻24或者在低热量饮食的肥胖受试者中。25
在肠道炎症早期观察到瘦素过表达可能导致厌食和体重减轻。与先前的观察结果一样，TNBS引起的厌食症伴随着体重的显著下降。21抑制进食和减轻体重并不局限于TNBS诱导的结肠炎，因为先前的研究表明，在吲哚美辛诱导的回肠炎后也有类似的效果18，19或在不同条件下注射LPS。26这些发现表明，厌食症的发展不是特定于用于诱导结肠炎的刺激，厌食症的发生是炎症的结果。此外，TNBS诱导结肠炎第5天瘦素的低表达也可能刺激了能量摄入，从而在体重减轻后重新启动体重增加，作为机体的反馈反应。实际上，在炎症发生的第5天，老鼠的食物摄入量就恢复了，而在第6天，老鼠的体重开始回升。
肠道炎症诱导瘦素分泌的机制尚不清楚。基于格伦菲尔德的研究等13和Sarraf等，14这表明IL-1和TNF-α增加了血浆瘦素浓度，我们很容易假设肠道炎症期间分泌的这些促炎细胞因子可能导致瘦素过度表达。组织和循环细胞因子都可能导致过度表达。Rachmilewitz等，23以及最近的立石等，27一些细胞因子(IL-1α， IL-1β， IL-6, TNF-α)在TNBS治疗大鼠的受损结肠组织中迅速升高。此外，这些促炎细胞因子的急性释放可能是由内毒素诱导的，内毒素在TNBS诱导的结肠炎早期浓度最高。28然而，尽管有明确的证据表明IL-1、IL-6和TNF-α在肠道炎症中同时上调，但个体细胞因子在调节瘦素释放或任何其他体内反应中的潜在作用仍不清楚。Mantzoros等29发现循环瘦素浓度与可溶性TNF-α受体之间存在正相关，该受体已被证实是糖尿病患者和健康受试者中TNF-α系统激活的敏感指标。
本研究试图测定不同肠道炎症模型中循环TNF-α的含量。除内源性休克大鼠外，肠道炎症期间未检测到血浆TNF-α升高。这与Ameho最近的结果是一致的等30.他们也未能检测到TNBS诱导的结肠炎中全身TNF-α的变化。然而，这些结果并不意味着没有产生这种细胞因子。我们未能检测到全身性TNF-α可能是由于其产生率低，半衰期短，从血浆中清除迅速，或其作用方式(自分泌或旁分泌)。许多急性炎症显示局部分泌IL-1和TNF-α，但在体循环中浓度很低。31比如，奈利等28发现TNBS处理大鼠血浆IL-6浓度升高，但TNF浓度无显著升高。然而，这些作者并没有排除TNF作为炎症过程中的主要介质，并表明其作用是短暂的。同样,Tateishi等27在TNBS治疗的大鼠中获得了相同的结果，在疾病早期血浆IL-6浓度升高，而其他细胞因子(IL-1α， IL-1β和TNF-α)在任何时间点都无法在血液中检测到。
细胞因子诱导瘦素分泌的机制尚不清楚，但似乎有两种途径。首先，细胞因子可以直接作用于脂肪细胞，刺激瘦素分泌。在最近的一项研究中，Kirchgessner等32体外和体内证据表明，TNF-α在翻译后调节瘦素的分泌，这表明TNF-α可以直接作用于脂肪细胞，通过分泌样机制调节预先形成的瘦素池的释放。同样,Granowitz33发现用IL-1β、IL-6或TNF-α处理3T3-L1脂肪细胞导致ob mRNA减少，而用抗炎细胞因子TGF-β处理则增加ob mRNA的稳态浓度。不幸的是，这些细胞因子对培养基中瘦素分泌的影响没有被测量。其次，瘦素浓度可通过炎症介质的继发性作用而增加。外周产生的炎症介质和细胞因子激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，导致循环糖皮质激素增加，从而直接刺激ob基因表达和血浆瘦素浓度。34，35
我们的发现与解释人类疾病的相关性可能是重要的。事实上，不同的初步研究报告显示，36不变,37或减少38IBD患者的瘦素浓度。其中一些差异可能反映了分析来自不同体重指数、疾病严重程度、疾病进程阶段或可能改变瘦素表达的治疗方案(如类固醇)等异质性患者群体的结果所固有的困难。34，35
综上所述，本研究结果表明，在实验性肠道炎症期间，血浆瘦素浓度升高与炎症程度相关。有证据表明，瘦素过表达在疾病早期发生，然后消失，这可能部分解释了最近IBD患者血浆瘦素浓度结果的差异。36-38尽管对人类IBD的起始事件知之甚少，但其急性期的炎症反应与急性非特异性损伤模型相似。39我们在动物模型中的发现表明，血浆瘦素浓度在炎症急性期短暂升高，其典型表现为体重减轻、代谢率升高和厌食。
致谢
我们要感谢莱坎努先生对老鼠的帮助。Krempf教授和darmaoun博士对手稿的有益评论得到了认可。