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摘要
背景-高胆固醇饮食的地鼠表现出较长时间的肠道转运，这是胆固醇胆结石形成的致病因素。
目标-研究高胆固醇饮食对迁移肌电复合物(MMC)特征的影响和红霉素的潜在益处。
方法24只动物接受了微量(对照组)或1%(高)胆固醇饮食。四周后，5个双极空肠和回肠末端电极被植入。七天后，在使用红霉素治疗前后，测量清醒、禁食的动物的肌电活动。评估胆道脂质组成。
结果-与对照组相比，喂食高胆固醇饮食的动物表现出更长的MMC周期(70(6)比83(3)分钟;p<0.05)，而MMC迁移速度和以I、II、III相为代表的MMC比例没有变化。口服红霉素显著缩短了对照组和高胆固醇饮食动物的MMC周期，分别缩短了59%和54%，并增加了两种饮食组中MMC III期所占的周期比例。食用高胆固醇食物的12只动物中有9只的胆囊胆汁被胆固醇饱和，并形成了晶体;没有控制。
结论-高胆固醇饮食的动物MMC周期延长。这与胆囊动力下降一起，损害了胆盐的肠肝循环，减少了其肝脏分泌，导致异常胆汁的形成。红霉素启动了MMC更频繁的循环。其在胆固醇结石形成中的治疗价值值得进一步评价。
- 迁移肌电复合体
- 肠道运输
- 胆固醇饱和指数
- 胆石病
- 红霉素
数据来自Altmetric.com
胆固醇胆结石的形成涉及多种肝胆缺损，1 - 6可能还有肠道疾病。7 - 10虽然胆固醇胆结石疾病的分泌缺陷最初表现为肝脏疾病，1 - 4胆囊和肠道并不是无辜的旁观者。3 - 12由于其在胆盐肠肝循环中的积极作用，胆囊排空受损和肠道转运延长不仅有助于“致石”状态，而且使其长期存在。2，4，6 - 8在喂食高胆固醇食物的地松鼠中，这是一种胆固醇胆结石疾病的模型，13，14我们最近的研究表明，肠内转运时间延长以及胆囊瘀血与胆盐肠肝循环缓慢、脱氧胆酸池扩大、胆汁胆固醇饱和度增加以及最终形成胆固醇晶体有关。14这些发现与胆固醇胆结石患者的报告一致。7 - 10
虽然在胆结石患者中，肠内转运时间延长在胆结石形成中的病理意义正在逐渐得到认可7 - 10在实验动物中，14人们对这种运动缺陷背后的机制知之甚少。4，10，14由于迁移肌电复合体(MMC)控制空腹肠运输15，16因此，禁食期间胆盐循环的肠部，17日这是过饱和胆汁形成最频繁的时期，2 - 4，19，20.我们研究了微量(对照)和1%(高)胆固醇饮食的地松鼠MMC的特征。此外，如果在喂食高胆固醇饮食时观察到有缺陷的MMC模式，我们试图测试红霉素，一种促动力剂，21 - 24日可以刺激MMC频率的增加，并逆转该模型的运动障碍。
材料与方法
实验动物
卡尔加里大学动物保护委员会批准了这项研究方案，符合加拿大动物保护委员会的指导方针。理查德森地松鼠(Spermophilus richardsoni)，平均体重300克，在卡尔加里附近被困野外。它们被单独关在温度调节的房间里，昼夜光照周期为12小时/12小时，在至少四周的时间里，它们可以免费获得标准的食物和水。24只动物被随机分为两组(每组12只)，在整个实验期间(5周)，分别喂食含微量胆固醇(0.027%，美国生化公司，俄亥俄州克利夫兰)的对照(犬粮)或含有相同的、按体重添加1%胆固醇的高胆固醇(美国生化公司)饲料。
手术准备
经过4周的饮食和18小时的禁食后，动物在氟烷全身麻醉下进行手术准备(Ayerst实验室，蒙特利尔，加拿大)。在无菌条件下，一个装有电极组件的塑料套管(五对聚四氟乙烯涂层，多股，不锈钢电极)从肩胛骨间出口到前腹壁的皮下隧道，并通过刺入切口进入腹腔。25前三对双极电极以10cm的间隔固定于空肠肌层(浆膜侧)，第一对电极位于Treitz韧带远端2.5 cm处。最后两对连接在回盲瓣近端- 10cm和- 20cm处。最后，在前腹壁肌肉中固定参考电极。25手术后12小时给予动物口服液体，24小时后恢复各自的随意饮食，直到获得空腹肠道肌电活动记录。
试验协议
第一个目标是确定在该动物模型中，长期喂食1%高胆固醇饮食是否与MMC特征的变化相关。在有意识的动物禁食18小时后，在第6周开始时获得微量(n=12)或高胆固醇饮食(n=12)的空腹肠肌电活动记录。在记录期间，动物被关在一个15 × 15 × 20厘米的小笼子里，没有药物或其他约束。连续记录空腹电活动6至8小时，以记录所有动物至少3个完整的MMC周期。在此之后，两种饮食的一组动物进入下一阶段的研究，评估红霉素对MMCs的急性影响。每饲料组随机选择6只动物口服硬脂酸红霉素液体(Abbott Laboratories, Montreal, Canada) 2 mg/kg21 - 24日在MMC第三阶段完成后的10分钟内。然后记录另外两个完整的MMC周期，并将红霉素后MMC的周期与红霉素给药前MMC的周期进行比较。在单独的实验中，每个饮食组中随机选择两只动物接受等量的液体安慰剂，即不含红霉素的载体，以检测与喂食红霉素或载体相关的处理的任何潜在影响。
胆固醇饱和指数和晶体发生率的测定
肌电记录结束时，所有动物均因颈椎脱位而死亡。打开腹部，用无菌针和注射器从胆囊中抽取胆汁。其中一滴立即用偏振光显微镜检查胆固醇晶体，确定为双折射，缺口菱形板14；其余的储存在−70°C，以供以后分析。使用3-α-羟基类固醇脱氢酶法分析胆囊胆汁样本的总胆盐(Worthington生化公司，Freehold，新泽西)，用酶法分析磷脂(Boehringer Mannheim, Mannheim，德国)，用酶诊断试剂盒分析胆固醇(Ames分部，Miles实验室，Slough，英国)。14血清胆固醇浓度同样由Ames胆固醇试剂盒测定。胆固醇饱和指数(CSI)是根据凯里的胆固醇溶解度极限临界表确定的，基于总脂类浓度，并使用计算机程序计算。14，26
消化间肠肌电活动的记录与分析
双极电极连接到生物电放大器(型号8811A;惠普，帕洛阿尔托，加利福尼亚州)，其上下限频率分别为0.05和300 Hz)。25输出信号同时记录在一个八通道图记录器(型号7858A;惠普公司(Hewlett-Packard))和一台八频道调频磁带录音机(型号3968A;惠普(Hewlett-Packard))，以便稍后回放和分析。使用示波器设置峰值处理器窗口，以便只记录振幅高于慢波电位变化的峰值电活动。25
通过目测原始记录分析空肠和回肠末端的肌电活动。地鼠的空腹胃肠电活动以慢波的存在为特征，该慢波具有周期性的周期性特征，具有典型的迁移肌电复合体(MMC)的明确的I、II和III期活动。15，16，25MMC的第三阶段被清楚地确定为每个慢波上的强烈电峰值活动的失败传播带。在此之前有一段不规则的电尖峰活动(第二阶段)，随后是一段无电尖峰活动(第一阶段)。由于第三阶段(密集的肌电尖峰活动时期)是三个阶段中最具特色和可识别的，因此周期被定义为第三阶段活动连续两次爆发结束之间的时间间隔。通过评估MMC各相通过双极电极1-3(空肠近端)和4-5(回肠远端)的时间和方向来确定MMC的传播方向和速度。25
统计数据
数据以均值(SE)表示。两组之间的比较使用配对和未配对的学生t测试。方差分析用于评估饮食、红霉素和组对MMC周期持续时间的贡献。所有的计算都是用计算机程序进行的systat(SYSTAT公司，埃文斯顿，伊利诺伊州)。统计值达到p<0.05的概率被认为是显著的。
结果
高胆固醇饮食对动物特性的影响
所有的动物都能耐受1%的高胆固醇饮食和手术过程。从它们正常的体重增加、闪亮的皮毛和正常的活动来看，它们是健康的。体重无显著差异(微量胆固醇457 (22)g vs高胆固醇498 (32)g;NS)。食用高胆固醇饮食的动物血清胆固醇浓度显著增加(微量胆固醇为5.2 (1.1)mmol/l，高胆固醇为14.8 (3.2)mmol/l;p < 0.05)。通过常规的组织切片光镜检查，与微量胆固醇饮食的动物相比，高胆固醇饮食的动物肝脏或小肠黏膜没有明显的组织学改变。
高胆固醇饮食对消化间肠肌电活动的影响
禁食的地鼠在微量和高胆固醇饮食中都表现出典型的MMC典型的肠道肌电活动循环模式。这包括三个阶段:静止(阶段I)，不规则(阶段II)和强烈的，持续的肌电峰值活动爆发(阶段III)。mmc通过空肠近端迁移到回肠末端。与对照组(微量胆固醇饮食)相比，高胆固醇饮食的地鼠MMC周期显著延长(微量胆固醇饮食为70(6)分钟，而高胆固醇饮食为83(3)分钟(p<0.05)，表明消化间MMC频率降低。MMC的繁殖速度没有显著变化(微量胆固醇饮食为3.5 (0.6)cm/min，高胆固醇饮食为2.8 (0.6)cm/min;NS)。在高胆固醇和微量胆固醇饮食组中，代表每个阶段的MMC周期的比例保持不变(i期微量胆固醇饮食，12.5(4.0)%，高胆固醇饮食，14.1 (1.4)%;ii期-微量胆固醇饮食，80.6(8.8)%，高胆固醇饮食，78.7 (1.3)%;iii期微量胆固醇饮食，7.0 (0.9)% vs高胆固醇饮食，7.1 (0.5)%;所有NS)。
红霉素对消化间期肠肌电活动的影响
口服硬脂酸红霉素(2 mg/kg口服)显著缩短了MMC接下来两个完整循环的周期，在微量和高胆固醇饮食组分别缩短了59%和54%1；p<0.05)，而给予等量液体安慰剂(硬脂酸红霉素载体)对两组的MMC周期均无影响(数据未显示)。添加红霉素对两组繁殖速度均无显著影响(见表2)1)．红霉素显著增加了以III期活性为代表的MMC周期的比例，而降低了以II期活性为代表的MMC周期的比例(微量和高胆固醇饮食组分别增加了四倍和两倍;表格1；p < 0.05)。
红霉素对MMC周期的影响。EMS,红霉素。*与对照组相比p<0.05;与不含红霉素的微量饮食相比，**p<0.05。
采用方差分析来评估饮食、饮食加红霉素和饮食加红霉素加组对MMC周期持续时间的贡献。在红霉素治疗前，饮食对MMC周期有显著(p<0.05)影响(高胆固醇饮食延长)。然而，当评价饮食加红霉素治疗对MMC周期的影响时，只有红霉素治疗对MMC周期有显著影响(p<0.01)。这可以解释为，在红霉素治疗前，高胆固醇饮食组和微量胆固醇饮食组MMC周期显著延长(83(3)分钟和70(6)分钟;p<0.05)，然而，在两个治疗组中，红霉素治疗大大缩短了MMC周期的持续时间，与不受饮食治疗影响的相似值(微量胆固醇组52(7)分钟，而红霉素治疗的高胆固醇组47(6)分钟;p < 0.01)。
高胆固醇饮食对胆固醇饱和指数和胆固醇晶体发生率的影响
1%高胆固醇饮食显著提高了胆囊胆汁中的胆固醇饱和度(微量胆固醇饮食为0.58(0.06)，高胆固醇饮食为1.2 (0.08);p < 0.05)。这主要是由于更高的胆固醇摩尔百分比(微量胆固醇饮食为3.0(0.4)%，而高胆固醇饮食为7.1 (0.5)%;P <0.05)和较低的胆盐摩尔百分比(微量胆固醇饮食为86.2(1.1)%，而高胆固醇饮食为78.1 (0.6)%;p < 0.05)。
从宏观上看，食用微量胆固醇的动物的新鲜胆囊胆汁样本是清晰的，没有可见的沉淀物。在1%高胆固醇饮食的动物中，所有的胆汁样本都是浑浊的，充满了类似沙子的沉淀物。在偏光显微镜下检查(每组n=12)，在微量胆固醇(对照)饮食的任何动物的初始(原生)胆囊胆汁中均未发现胆固醇晶体。相比之下，12只喂食胆固醇的动物中有9只有固体胆固醇晶体，3只有肉眼可见的胆固醇结石。
讨论
目前的研究表明，当地松鼠摄入1%的高胆固醇食物时，这是一种胆固醇结石形成的模型，13，14，27它们的MMC周期显著延长。高胆固醇饮食的动物MMC周期频率的降低与该模型中先前显示的小肠转运延迟有关，14一种导致胆固醇饱和的胆汁形成和胆固醇晶体形成的作用。7 - 10此外，研究结果表明，红霉素显著缩短了MMC的循环周期，并显著增加了两种饮食组中MMC的推进期III期活性所占的循环周期的比例，这一观察结果具有治疗潜力。24
肝脏分泌胆汁与胆固醇过饱和是胆固醇胆结石形成的第一阶段，主要是肝脏代谢紊乱，由饮食和遗传易感性共同驱动。1 - 4这种“异常”的胆汁似乎通过未知的机制破坏了下游器官(胆囊和小肠)的正常运动功能。4，13，14，28随之而来的胆囊淤积和肠内转运时间延长阻碍了胆盐的肠肝循环，从而导致其肝脏分泌减少2，8，14，18 - 20同时也增加了脱氧胆酸盐池的大小。7 - 10，14，29这些相互依赖的事件形成了一个恶性循环，促进了饱和胆固醇的胆汁分泌4随后胆结石的形成，无论是在患有胆固醇胆结石的患者中，7 - 10在实验动物模型中也是如此。14
虽然这个概念并不新鲜，30.直到最近，肠道转运时间延长在胆结石形成中的致病作用在很大程度上被忽视了。10在这些实验中，有几种机制可以作为肠道运输延长的原因。在人类中，膳食中的纤维含量是肠道转运时间的重要决定因素。在这项研究中，微量胆固醇和高胆固醇饮食治疗组的饮食是相同的，包括纤维含量，只在摄入的胆固醇量上有所不同。因此，纤维摄入量的差异并不能解释在胆固醇胆结石形成的地鼠模型中肠道运输时间的延长。另一种可能解释该模型中肠内转运时间延长的潜在机制与胃肠运动的禁食模式有关。在禁食条件下，上胃肠道表现出循环模式的运动活动，即MMC。15，16MMC向外繁殖至回盲交界处。15，16它在十二指肠的循环出现与胆囊的部分排空和胆汁搏动性地输送到十二指肠有关。17日至19日接着是胆汁盐的流产推进到回肠远端主动再吸收部位，19，31导致更多的胆盐回流到肝脏进行切除。17日因此，空腹期间肝脏胆盐分泌的大小是肠肝循环的函数，由胆囊的间歇性排空和小肠的推进活动提供动力，17日至19日所有这些主要是由MMC的周期性决定的。15 - 19目前的研究表明，在禁食期间，与对照组相比，高胆固醇饮食的动物表现出明显的MMC周期延长。这种异常的功能后果是MMC循环次数减少，胆囊部分排空频率降低，在长时间禁食(过夜)期间，腔内胆盐向远端吸收部位的推进频率降低。15 - 20，31，32这些空腹肠道运动的改变可能在一定程度上解释了之前观察到的高胆固醇饮食动物小肠转运的延迟。
虽然没有关于胆结石形成的病理生理学如何改变MMC周期的信息，但可以想象，本研究中MMC周期频率的变化可能是由高胆固醇饮食引起的。14，28，33正常情况下，大约50-60%的膳食胆固醇会被肠道上部吸收34；有些最终到达回肠末端。1%的高胆固醇饮食与只有0.027%胆固醇的对照饮食相比，胆固醇含量增加了40倍。我们推测，整个小肠暴露于异常高浓度的胆固醇中，这是膳食胆固醇和胆道胆固醇过载的结果，超过了近端小肠的吸收能力。14，31，34可以想象，多余的胆固醇会到达并进入小肠的神经元和/或平滑肌膜。4，13，14，28这改变了膜的流动性35并可能因此影响膜调节蛋白的功能，如受体和离子通道4，28，33，35-38控制电兴奋性并影响MMC等事件的周期性。15，16虽然目前的研究结果表明，在地鼠中，腔内游离胆固醇的增加与MMC的改变之间存在相关性，但人类的情况可能有所不同，因为患有胆固醇胆结石的患者在肠腔或血液中不一定有高浓度的胆固醇。3.，4然而，它们确实会向小肠分泌过多的胆道胆固醇。1，2，39
胆固醇胆石症地鼠模型中MMC循环周期延长和肠道转运延迟与胆盐池中脱氧胆酸盐含量增加和总胆盐池疏水性增加相一致。14疏水胆盐如脱氧胆酸盐具有更强的细胞毒性。40-42通过与膜上的磷脂成分形成水溶性复合物，即使浓度远低于临界胶束浓度，43这些疏水胆盐也可能改变神经元膜的结构功能，40-46调节肠神经系统内的循环活动。15，16这可能会导致观察到的MMC周期频率的降低和肠道运输的延长。15，16然而，需要进一步的实验来阐明在这个胆固醇胆石形成模型中延迟肠道转运的真正机制。
红霉素是一种13位大环内酯类化合物，对胆道和胃肠道都有强大的促动力作用，21 - 24日可能是通过与胃动素受体结合并充当其激动剂。22就像调节肽胃动素，11，15，16红霉素诱导III期活性，开始于上胃肠道，并通过小肠迁移。研讨会在本研究中，口服红霉素显著缩短了两种饮食制度下地鼠的MMC周期，并增加了MMC周期中三期所占的比例，三期是MMC的强烈和推进性活动前沿。15，16这些变化的生理后果是加速肠道运输和更快速的胆盐肠肝循环。17日这种加速的肠内转运和更快速的胆盐肠肝循环有可能增加胆盐分泌，改善胆固醇溶解性，并减少晶体发育。加速凌日的机制与MMC的周期频率增加有关。在禁食状态下，部分胆囊排空与MMC周期性发生;十二指肠胆汁分泌高峰出现在十二指肠周期的70%。18十二指肠胆汁酸向远端回肠吸收部位和由此向肝脏的运输是脉动性的，而不是连续的，也由MMC决定。47当MMC III期将腔内胆汁酸池推进到远端小肠吸收部位时，远端再吸收部位的最大吸收发生。胆汁酸在十二指肠III期之前进入十二指肠，由III期活性的活性锋推动到其远端吸收部位。MMC的“管家”作用非常有效，88%输送到十二指肠的胆汁酸由第一个通过MMC的活动前沿推进并被重新吸收。平均而言，mmc频率较高的动物比mmc频率较低的动物将腔内内容物推进得更远。即使单个mmc的传播速度相同，这种情况也会发生。因此，MMC周期频率的改变在一定程度上解释了之前观察到的高胆固醇饮食动物小肠转运的延迟。14然而，真正造成红霉素效应的是循环频率的增加，而不是单个mmc传播速度的增加。
红霉素诱导的肠道和胆囊运动功能的改善可能提供一种潜在的治疗干预措施，可能减轻胆固醇饱和胆汁的临床后果。12，24，48-50事实上，最近在同一动物模型上进行的为期四周的红霉素治疗试验的初步结果支持了这一假设。51
综上所述，我们已经证明，高胆固醇饮食可以显著延长地松鼠的MMC周期。这可能在一定程度上解释了之前在该模型中禁食期间肠内转运流产的延迟，14这与胆囊动力减弱一起损害了胆盐的肠肝循环，并减少了它们的肝脏分泌。2，8，14，17日48-50由此导致的胆盐循环迟缓可能有助于扩大脱氧胆酸盐池4，7 - 10，14并促进胆固醇饱和胆汁的形成。30.最后，红霉素在胆石症组中显著增加MMC周期频率，提示红霉素治疗可能在预防胆固醇胆石形成方面具有潜在的治疗价值。24，48-50一种值得进一步评估的疗法。