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摘要
背景卡哈尔间质细胞(ICCs)表达酪氨酸激酶受体c-kit，这是其发育和肠内自发起搏器活动所必需的。从小鼠模型中，有人提出icc直到出生后才发育，但最近的发现表明c-kit在胚胎期早期表达。ICCs在人类肠道中的时间发展仍然未知。
目的目的:应用免疫组化c-kit技术研究人胎儿小肠内的ICCs。
主题在死后检查16个胎儿和9个新生儿的小肠标本，其中8个是早产儿，出生在胎龄13至41周，无胃肠道疾病。
方法对用福尔马林固定、石蜡包埋的材料进行免疫组化分析。标本暴露于针对c-kit (ICC标记物)和神经元特异性烯醇化酶(一般神经元标记物)的抗体。ABC复合体法用于观察抗体与相应抗原的结合。
结果从妊娠13周开始观察C-kit免疫反应细胞。免疫反应主要集中在肌神经丛。大约在妊娠17-18周时，ICCs沿肌丛形成一层，而在妊娠13-16周时，这一层似乎被破坏。
结论ICCs至少从胎龄13周起在人胎儿小肠中就具有c-kit免疫反应性。从怀孕17-18周到出生，它们在肌神经节周围形成一个连续的层。
- 卡哈尔间质细胞
- c - kit
- 肌间神经丛
- 人类
- 胎儿
- 发展
缩写
- 国际刑事法庭
- 卡哈尔间质细胞
- 自洽场
- 干细胞因子
- MGF
- 肥大细胞生长因子
- 分析了无
- 神经元特异性烯醇化酶
- PBS磷酸盐缓冲盐水
数据来自Altmetric.com
尽管距离卡哈尔的间质细胞(icc)首次引起科学家的兴趣已经过去了一个多世纪，1，2关于这些细胞的许多问题仍然没有答案，特别是关于它们的功能。此外，ICCs的个体发生和发育，特别是在人类胃肠道中，需要进一步的研究，这些问题在本研究中得到了解决。
在人类小肠中，ICCs位于纵向肌层和圆形肌层之间的肌丛水平，圆形肌层最内侧的深层肌丛，以及圆形肌层本身。3 - 5它们被认为是肠道平滑肌层自发起搏器活动的生成器。6 - 9此外，有人认为它们可能参与神经传递。9细胞因子，钢铁因子，10也称为干细胞因子(SCF)11或肥大细胞生长因子12被鉴定为c-kit配体。惠钦格等13显示与肌神经丛相关的icc表达c-kit，这是一种编码细胞表面受体酪氨酸激酶的原癌基因。14白斑(W)位点突变导致kit基因突变的小鼠缺乏与肌丛以及肠起搏器活性相关的ICCs。
综上所述，ICCs似乎在肠道的正常功能中起着关键作用，这些细胞的改变可能与各种肠道疾病有关。例如，在Hirschsprung病中，神经节节段内的ICCs比神经节肠内的要少得多。15，16在婴儿肥厚性幽门狭窄中也观察到与肌丛相关的c-kit免疫反应细胞的缺失或减少。17最近,矶等18报告2例肌病性慢性肠伪梗阻，与肌丛相关的c-kit免疫反应细胞数量减少。
据我们所知，以前没有系统地研究过人类胃肠道中icc的时间发展。因此，本研究的目的是在不同胎龄人类胎儿的小肠中绘制c-kit免疫反应性作为ICC标记。神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组化被用作神经元成分的标记物，这在人类胎儿小肠中已经被很好地定义。19有关ICCs的信息可能有助于我们了解早产儿小肠运动的发展，早产儿在禁食状态下小肠运动表现不成熟，20.，21尽管有报道称早产儿对喂养有适当的反应。22此外，ICC发展的知识可能有助于阐明以ICC缺乏为特征的疾病的病因学和病理生理学。
方法
在16名胎儿和9名新生儿的例行死后检查中，收集了小肠中部的标本用于诊断，其中8人早产。胎龄从13周到41周不等1)．活产婴儿在出生后的第一天到第17天之间死亡。其中7例在妊娠21-27周出生。死后1 - 6天进行尸检。在三个死于子宫内的胎儿中发现了轻度浸渍;严重浸渍的死产不包括在内。此外，显示胃肠道严重病理状况的胎儿和婴儿不包括在内。在苏木精和伊红染色切片的常规组织病理学检查中，所有病例的肠壁形态都是正常的，尽管有几例患者的黏膜出现了自溶性改变。5例在妊娠13、19、19、23和31周时取直肠标本。作为对照组织，3例患者在回盲切除时采集回肠远端标本。 The resections were performed because of colonic cancer, villous adenoma, and perforated appendicitis, and the patients were 63, 75, and 78 years old.
这项研究得到了乌普萨拉大学医学院伦理委员会的批准。
组织准备
标本用10%的福尔马林固定，石蜡包埋。切割5 μm厚的切片，放置在聚硅片上l-赖氨酸包被载玻片，37°C孵育过夜。所有切片在二甲苯中脱蜡并水合。
免疫组织化学
对两种抗体进行微波加热抗原提取。切片在柠檬酸缓冲液(10 mM, pH 6.0)中煮沸(750 W) 5 (NSE)或10 (c-kit)分钟。切片在缓冲液中冷却至室温，然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中冲洗。内源性过氧化物酶活性在2%的过氧化氢蒸馏水中被阻断5分钟，然后切片在PBS中冲洗。然后用正常猪血清(Dako, Glostrup，丹麦;稀释1:5)c-kit或正常山羊血清(Dako;稀释1:5)NSE在PBS中室温浸泡20分钟。与一抗在4℃(C -kit)下孵育过夜，或在室温(NSE)下孵育一小时。表格2提供对初抗的进一步描述。PBS冲洗后，用生物素化的二抗山羊抗小鼠(Dako，产品号E0433;稀释1:200)用于NSE或猪抗兔(Dako，产品编号E0353;稀释1:300)c-kit，室温30分钟。然后切片在Vectastain精英ABC试剂盒(Vector Laboratories, Burlingame, California, USA)中孵育30分钟，并在3,3 ' -二氨基联苯胺四盐酸(Sigma, London, UK)中显影约6分钟。用苏木精复染。最后，将切片脱水，在二甲苯中清除，并安装在Pertex (Histolab, Göteborg，瑞典)。
在省略一抗的阴性对照中，无免疫反应性。对于c-kit，免疫染色也被阻断肽(1.0 μg/ml;# sc - 168 p;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA)使用c-kit抗体(0.01 μg/ml)在室温下孵育2小时，然后按照供应商提供的说明进行特异性免疫组化操作。
用光学显微镜对载玻片进行分析。
结果
分析了无免疫组织化学
NSE免疫组化清晰显示肌神经丛和粘膜下神经丛。在神经细胞体以及肌间隙和粘膜下层的神经纤维中观察到NSE的免疫反应1A).所有病例均建立肌丛。另一方面，在最早的病例中，粘膜下神经丛缺失(妊娠13周，图1B)。在一些早期受试者中，可以识别粘膜下神经节，但很难区分内外神经丛，并且大多数免疫反应细胞都在靠近圆形肌肉层的地方观察到。在老年受试者中，独立的内丛和外丛被建立并清晰可见1A).我们没有观察到任何具有ICCs特有形态特征的NSE免疫反应细胞。
(A)妊娠26周出生，17天死亡的婴儿，NSE免疫组化显示肠肌丛(箭头)和小肠内、外粘膜下丛(箭头)内有免疫反应性神经节细胞。与神经节和圆形肌层相关的神经纤维也被染色。原放大倍率× 66。(B)妊娠13周时小肠NSE免疫组化显示肌丛(箭头)，黏膜下层未见免疫反应性神经节细胞。原放大倍率× 40。(C)从妊娠17-18周开始，ICCs沿小肠肌肠丛形成一个连续的层。用c-kit免疫组化方法在妊娠20周的一例中说明了这一点。原放大倍率× 80。(D) c-kit免疫反应细胞形状拉长，细胞核呈卵圆形，妊娠20周时可见。细胞突似乎没有穿透到神经节。 Original magnification × 200. (E) From 13 to 16 weeks of gestation, the layer of c-kit immunoreactive ICCs associated with the myenteric plexus of the small bowel appears to be disrupted. In the submucosa, isolated round c-kit immunoreactive cells, interpreted as mast cells, are seen (arrows). In this case the submucous plexus had not yet developed at 13 weeks of gestation, as shown in (B). Original magnification × 80. (F) From 17 weeks of gestation, the processes of the ICCs are often seen to penetrate into the circular muscle layer, whereas isolated ICCs in this layer are only rarely observed. Original magnification × 50. Abbreviations: LM, longitudinal muscle layer; CM, circular muscle layer; SM, submucosa.
c - kit免疫组织化学
在孕31周和35周时，除两例外，其余病例均观察到C-kit免疫反应。这些病例的NSE免疫反应正常。阴性结果没有明显的原因，但死后的变化可能是由于这些胎儿被轻度浸渍。两个胎儿都在子宫内死亡，死因在尸检中无法确定。c-kit免疫反应细胞位于肌间隙，c-kit阳性细胞多呈卵形核，细长薄，围绕肌神经节和神经束(图2)1在妊娠年龄大于17-18周的受试者中，通常在肌丛周围观察到连续的C -kit免疫反应细胞层(图2)1C).另一方面，在胎龄13-16周时，这层细胞似乎被破坏，发现了圆形核和短突的免疫反应细胞。此外，在这些病例中，免疫反应性较弱，很少看到免疫阳性细胞(图1E).几乎所有病例均可见粘膜下层圆形免疫反应细胞，与粘膜下神经节无关联;这些被解释为肥大细胞，已知是c-kit免疫反应性的(图1E)。23虽然c-kit阳性细胞经常延伸到平滑肌层(图1F)，分离的免疫阳性细胞很少出现在肌肉层中。活产的新生儿和死在子宫里的胎儿之间没有区别。在直肠标本中，也有类似的发现。然而，在妊娠13周时，在肌丛周围未观察到c-kit免疫反应性2A)。在妊娠19周时，一个病例中c-kit免疫反应细胞很少，而在第二个病例中，由c-kit免疫反应的ICCs勾勒出肌内神经节(图2)2B).后一种模式在妊娠23周和31周也观察到。在成人小肠中，在肌肠节周围发现了大量的ICCs。环状肌层中ICCs的数量比胎儿病例中要多2C)。
(A)妊娠13周时，直肠肌肠丛未见c-kit免疫反应性。原放大倍率× 50。(B)妊娠19周时，直肠肌丛周围可见一层c-kit免疫反应性ICCs。原放大倍率× 50。(C)在成人小肠中，C -kit免疫反应性icc环绕肌肠神经节。环状肌层也经常发现ICCs。原放大倍率× 25。
讨论
ICCs的形态和分布以前很难研究，因为常规光学显微镜的标准染色程序没有揭示这种细胞类型。因此，电子显微镜一直是研究ICCs分布的首选方法，事实上，已经使用这种技术对人类小肠进行了一些超微结构研究。3 - 5在超微结构上，与肌神经丛相关的ICCs呈束状排列，围绕着神经节和神经束，并始终与神经节和神经束密切接触。icc的进程很长，通常没有分支。其特点是，ICC过程包含一个发育良好的光滑内质网和一个由中间细丝组成的致密网。核周细胞质中也含有较多的中间丝，但光滑内质网较少。ICC核的染色质模式与在平滑肌细胞中观察到的相似。然而，与平滑肌细胞相比，ICCs不含肌球蛋白丝。4
它已经在老鼠身上显示出来，24几内亚猪,25人体肠道15与肌丛相关的c-kit免疫反应细胞的形态与ICCs的超微结构描述相关。ICCs嵌于静脉曲张神经末梢和平滑肌细胞之间。两种类型的静脉曲张已确定在神经末梢。第一种可能是胆碱能的，而第二种在深层肌丛ICCs中比在肌丛ICCs中更常见，在形态上类似于抑制性非肾上腺素能非胆碱能神经元中所见的静脉曲张。9这些发现表明ICCs可能在抑制性神经传递中发挥作用，Publicover对此进行了进一步研究等，26Who提出这些细胞可能在犬结肠中增强抑制性一氧化氮信号。在ICCs中，一氧化氮合酶(内皮异构体)的展示表明，这种细胞类型能够合成一氧化氮。27
Maeda等23发现c-kit在肠道起搏器系统的发育中起着重要作用，并提出ICCs参与其中。给新生小鼠注射抗c-kit抗体可导致肠道运动异常。23其他几位研究人员已经提出了支持icc在产生自发起搏器活动中的作用的结果。例如，从圆形肌肉层去除粘膜下层，破坏粘膜下层-圆形肌肉界面，这是一类ICCs的位置，发现可以消除犬结肠圆形肌肉中的慢波。7亚甲蓝灌注联合肠平滑肌制剂照明可导致ICCs选择性损伤和慢波活性丧失。6此外，将ICCs暴露于罗丹明123，这是一种由ICCs和肠神经元吸收的荧光染料，但不被平滑肌细胞吸收，改变了犬结肠环肌制剂的电节律性。28
ICCs的胚胎起源一直存在争议。然而，最近，Lecoin等29探讨了禽肠c-kit阳性细胞的来源。在胚胎第2天将鹌鹑神经嵴移植到鸡胚胎上。实验表明，所有肠内神经元和胶质细胞均来源于鹌鹑，而c-kit免疫反应细胞均来源于鸡。作者得出结论，c-kit阳性的icc具有间充质起源。
在小鼠小肠的超微结构研究中，福松-佩莱格里尼30.报道称，在足月胎儿中未检测到ICCs，但在生命的前两周出现。另一方面，鸟桥等24在胚胎第12天(E12)小鼠小肠检测c-kit免疫反应性。在此阶段，在肠壁外表面浆膜层以下发现c-kit阳性细胞。这些细胞既不能被定性为ICCs，也不能被定性为平滑肌细胞。与肌神经丛相关的ICC网络在E15至E18天之间发育。作者认为，在第E12天c-kit阳性的细胞群分化为平滑肌细胞，失去c-kit免疫反应性，而其他细胞继续表达c-kit免疫反应性，并分化为与肌丛相关的ICCs。c-kit的免疫反应性没有与神经元标记物c-ret共同定位，这表明icc不是神经元来源。与深层肌丛相关的ICCs在出生后发育。ICCs在人类胎儿肠道中的发展尚不清楚，这是本研究的原因。松田等31研究了c-kit在正常成人和胎儿组织中的表达，发现c-kit在成人组织的肠神经丛中有免疫反应性，而在胎儿组织中没有。另一方面，他们在两种组织的大脑中都观察到c-kit免疫反应细胞。Vanderwinden等15提到c-kit免疫反应性icc在妊娠14周出现在人类前肠，在妊娠23周出现在后肠，但没有进一步描述。崛江等32在妊娠18周和20周的人类胎儿食管、小肠和结肠平滑肌层中发现c-kit免疫反应性。
我们观察到在肌神经节周围有卵形核的细长细胞中c-kit的免疫反应性。在我们的研究中看到的c-kit免疫反应细胞的典型定位和形态表明它们是icc。先前已经证明，与肌肠丛相关的icc表达c-kit酪氨酸激酶受体。13普罗塞等33报道了一些与肌神经丛相关的ICCs在大鼠肠道中具有NSE免疫反应。然而，这些发现在我们的研究中并没有得到证实，因为我们没有观察到具有形态学特征或icc定位特征的NSE免疫反应细胞。我们的研究结果表明，ICCs至少早在妊娠13周时就在人类胎儿小肠中表达c-kit，尽管这一阶段ICCs的形态和分布表明它们仍然不成熟。胎龄13 ~ 16周时，肌间隙内可见少量分散的ICCs，个别细胞突起短，细胞核圆形。在直肠标本中，在这个胎龄没有观察到免疫反应。从妊娠17-18周开始，在小肠的肌神经节和神经束周围观察到一层连续的c-kit免疫反应性ICCs，从这个胎龄到足月，我们没有发现进一步的变化。从妊娠19周开始，c-kit免疫反应性icc与直肠肌肠节相关。我们在胎儿病例中未观察到任何c-kit免疫反应细胞，尽管在成人小肠的超微结构研究中已在该部位观察到ICCs。5胎儿深肌丛中缺乏c-kit免疫反应性icc的一种解释可能是这种类型的icc在出生后形成，就像在小鼠小肠中一样。24然而,矶等18在成人深部肌丛中仅发现少量c-kit免疫反应细胞，这可能提示在人小肠中c-kit阳性的主要是与肌丛相关的icc。我们在成人病例中发现圆形肌层有大量c-kit阳性的ICCs，但很难区分单独的深层肌丛。
在小鼠小肠中，已证明电节律性的发生与ICCs的发展相关。E16和E17无自发电活动，而在E19可以记录到慢波，此时ICCs和纵肌层已分化为两个不同的实体。24在小鼠中，慢波频率已被证明与腔内压力的变化相关，这导致推进性蠕动，如放射学方法所示。34McLain35通过羊膜摄影研究了人类胎儿胃肠运动，在妊娠30周之前未显示胃造影剂的排空。然而，从妊娠30周开始，造影剂的传播率随着胎龄的增加而增加。Bisset等20.研究了从怀孕28周到足月的早产儿小肠压力。在妊娠31周之前，发现了低振幅的无序活动模式。在妊娠31 - 34周之间，出现集束相活动，在妊娠34 - 37周之间，观察到延长的相活动向流产方向传播。足月可见明确的空腹运动和运动复合体迁移。然而,Berseth22显示早产儿反应适当的喂养管理输液，通过发展持久的活动。早产儿对喂养的反应与足月婴儿没有差异。与ICC功能相关的慢波频率随着胎龄的增加而增加，从妊娠28周时的每分钟10.5次增加到足月时的每分钟12.5次。20.
研究正常的人类胎儿发育是很困难的。必须考虑收集和使用材料的伦理问题。此外，与动物模型相比，人类材料的巨大变化可能会使解释变得困难。我们的材料包括人工流产或自然流产后尸检获得的标本，以及出生后几周内死亡的活产婴儿的标本。我们遇到了广泛的畸形和疾病，但我们无法区分NSE或c-kit免疫反应性表达的任何异常，这可能与这些疾病有关。然而，在我们的两个病例中，c-kit免疫反应的缺失可能是死后变化或死亡前发生的事件所解释的。以前已经指出，在使用银浸渍的研究中，死亡前的事件，如低氧血症，可能会影响肠神经节的染色特性36或NADPH脱靶酶组织化学。37在使用尸检材料时，自溶的影响总是一个值得关注的问题，但据报道，许多抗原对死后变化具有惊人的抵抗力。38
总之，人胎儿小肠中与肌肠丛相关的ICCs至少从妊娠13周开始表达c-kit酪氨酸激酶受体。从妊娠17-18周开始，c-kit免疫反应的ICCs形成一层围绕肌神经节和神经束的细胞。然而，在13-16周时，这一细胞层出现了破坏，这可能表明ICCs仍处于该阶段的发育阶段。
致谢
这项工作得到了路易莎王储公主儿童医疗护理协会和奥利和埃洛夫·爱立信科学研究基金会的支持。我们也感谢Gunilla tibbings和Frank Bittkowski提供的摄影协助，以及Bengt Sandstedt提供的标本。
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