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背景越来越多的证据表明速激肽在肠道神经免疫相互作用的关键作用。
的目标是确定NK1、NK2 NK3速激肽受体参与牛奶蛋白引起的过敏敏化作用。
方法8组12 Dunkin-Hartley豚鼠(250 - 300克)。四组进行了为期三周的敏感牛奶蛋白质。在此期间,这些动物每天腹腔注射NK1 (SR 140333;0.3毫克/公斤),NK2 (SR 48968;5毫克/公斤),或NK3 (SR 142801;5毫克/公斤)受体拮抗剂或车辆。第五小组有水可用来代替牛奶和被用作non-sensitised控制。其他三组收到了NK受体拮抗剂三周,但没有敏感到牛奶蛋白质。
结果敏感动物接受NK1和NK3受体拮抗剂都较低的IgE和血清免疫球蛋白滴定度,评估被动皮肤过敏反应,并降低特定的血清免疫球蛋白滴定度,决定了酶联免疫吸附测定(ELISA),比车辆对待动物。敏化作用诱导肠道肥大细胞数量的增加,废除了与NK1受体拮抗剂治疗。抗原challenge-induced空肠的分泌过多也被NK1受体拮抗剂治疗。
结论在几内亚猪,NK1和NK3但不是NK2受体参与牛奶的敏化作用。然而,NK1但不是NK3受体拮抗剂废除hypermastocytosis由食物过敏和分泌过多抗原引起的挑战,显示不同的角色NK1和β-lactoglobulin NK3受体在敏化作用的机制。
- NK受体
- 速激肽
- 食物过敏
- β-lactoglobulin敏化作用
- 敏化作用
- 豚鼠
缩写
- SP
- P物质
- NK
- 神经激肽
- 主成分分析
- 被动皮肤过敏反应
- ELISA
- 酶联免疫吸附测定
来自Altmetric.com的统计
立即食物过敏引起的过敏性反应临床表现,如鼻炎、荨麻疹、湿疹、胃肠道症状,如恶心、呕吐、腹痛、腹泻。1这些过敏反应敏感主题的结果抗原暴露导致IgE对肥大细胞生产和依恋。随后暴露于抗原诱导的肥大细胞脱颗粒释放的存储和新形成的介质。2此外,肥大细胞和神经之间的紧密附着在胃肠道粘膜被描述,3和增加证据是新兴的神经介入肥大细胞脱粒和归纳的消化障碍抗原的挑战。例如,肥大细胞脱粒是诱导大鼠卵清蛋白敏感的巴甫洛夫条件反射,4,据报道,神经毒素河豚毒素抑制肠道通透性的增加在敏感大鼠卵清蛋白引起的挑战。5此外,P物质(SP)和降钙素基因相关肽免疫反应性被发现在神经肥大细胞相比,6和运动7或分泌8改变抗原引起的挑战是由辣椒素减少传入神经的破坏或管理一个SP受体拮抗剂。7
速激肽是一群的神经肽,包括SP、神经激肽a (NKA)、神经激肽B (NKB),和两个氨基端扩展形式的NKA神经肽γ和神经肽k . SP NKA, NKB绑定优先NK1, NK2, NK3速激肽受体分别。9SP和NKA辣椒素敏感的传入神经元中描述其他neuromediators如降钙素基因相关蛋白。10,11NK3受体局部肠肌及粘膜下发现了神经元。12,13除了这神经本地化速激肽及其受体,在协议与神经介导的影响抗原的挑战,速激肽被认为是杰出的肽神经免疫连接14特别是参与免疫细胞的控制导致敏化作用和IgE合成蛋白质。例如,SP刺激B和T淋巴细胞的增殖15和免疫球蛋白的合成,或由巨噬细胞调节细胞因子的产生。16此外,SP水平可能描述除了食物过敏,过敏。甚至没有过敏原的挑衅,SP水平增加支气管肺泡和鼻腔灌洗草花粉过敏患者与健康受试者相比,17在鼻腔分泌物,他们反映鼻过敏的临床状态。18
因此,这项工作的目的是确定是否参与阶段,速激肽抗原在食物过敏敏化作用。我们确定的影响的激肽1,NK2 NK3受体IgE和免疫球蛋白的合成,肥大细胞的数量,和分泌反应抗原的挑战,这描述的敏化作用程度在豚鼠牛奶蛋白质。动物采用选择性的激肽1,NK2, NK3受体拮抗剂,SR 140333, SR 48968和SR 142801月19 - 21日分别在三周的敏化作用。
方法
动物和敏化作用
8组12女Dunkin-Hartley豚鼠体重250 - 300 g(哈伦,Gannat,法国)是用于这些实验。牛奶无蛋白固体颗粒的饮食是提供给所有的动物。四组被给予他们敏感牛奶蛋白质只有新鲜的巴氏杀菌喝全脂牛奶代替水三个星期。22这些动物收到另外的100毫克每日填喂法混合乳清蛋白富含β-lactoglobulin(拼箱90;Nutrinov,雷恩,法国)溶解在1毫升蒸馏水和被允许喝水三天前评估的敏化作用。三组接受每日治疗三周的敏化作用,通过腹腔内注射,速激肽受体拮抗剂(赛诺菲矫揉造作的):NK1受体拮抗剂(SR 140333;0.3毫克/公斤),NK2受体拮抗剂(SR 48968;5毫克/公斤),NK3受体拮抗剂(SR 142801;分别为5毫克/公斤)。几项研究中使用的剂量选择已经和前一个在活的有机体内模型:SR 140333在0.3毫克/公斤/天,腹腔内,23SR 48968 5毫克/公斤/天,腹腔内,24和SR 142801 - 10毫克/公斤/天,腹腔内。25在这些剂量,NK拮抗剂特定受体亚型。月19 - 21日第四组每日治疗车辆(0.9%氯化钠/二甲亚砜;1:1;0.5毫升腹腔内)。第五小组喝自来水而不是牛奶和被认为是一个non-sensitised控制。其他三组收到了NK受体拮抗剂但不敏感牛奶蛋白质。
抗体滴定度
血液通过心脏穿刺被撤回所有的动物来确定anti-β-lactoglobulin免疫球蛋白和IgE滴定度被动皮肤过敏反应(PCA)测试。短暂,100μl稀释血清从1:2 1:256是皮内注入剃侧翼天真的几内亚猪。两天后,2.5毫克β-lactoglobulin伊文思蓝染料在0.9%氯化钠溶液(1%)静脉注射在最后一卷0.5毫升。一个小时后,PCA为最高稀释法测定反应产生一个积极的响应(本地皮肤变成蓝色,局部直径> 4毫米)。滴定度表示为日志的最高稀释给蓝色的补丁。
免疫球蛋白抗体β-lactoglobulin也评估血清样本的酶联免疫吸附测定(ELISA)。多井microtitre板涂上100μlβ-lactoglobulin (200 ng /)。稀释血清(1:30一21 870)被添加到每个。孵化后,老鼠anti-guinea猪免疫球蛋白过氧化物酶共轭(北欧免疫学,Tillburg、荷兰)补充道。过氧化物酶活性与diamino-orthophenylene化验了染色0.05 mol / l柠檬酸缓冲(pH值4)含0.1% H2O2。与3 M H反应停止2所以4在492 nm,吸光度测量标(EL 132;美国VT Bio-Tek仪器,Winooski)。积极的滴定度有日志的最后的两倍稀释的吸光度的背景。
肥大细胞数量
四天后心脏穿刺,每组六个动物被颈椎错位和放血。空肠的小块(5毫米),20厘米远的韧带Treitz,固定在Carnoy的解决方案,在甲苯清除,嵌入在石蜡块。横向部分(4μm)沾阿尔新blue-safranin O肠道肥大细胞的识别,在黏膜和黏膜下层。三个部分每动物和三个视图部分是肥大细胞计数检查。的部分是由一个人盲目的方式检查不知道实验小组。
评价抗原诱导空肠的分泌
修改肠道运输水是肠道过敏反应的特征。26评估对抗原的挑战,我们测量一个孤立的净水通量空肠的循环。27,28中线剖腹手术,曝露在执行(氨基甲酸乙酯,2 g / kg腹腔内)豚鼠暴露小肠。5厘米段的远端空肠ileocaecal结(30厘米)被孤立和空心管腔内的灌注。洁肤后的管腔内的内容,循环取代了腹腔,随后关闭,空肠的部分充满了一个铃声缓冲溶液,其中包含1μCi / l51Cr-EDTA non-absorbed稀释水通量的标志。28循环是注入以恒定速率(6毫升/小时)和污水收集15分钟时间(1.5毫升)(ml) 21日超过210分钟。总复苏的调查51Cr-EDTA多样的102%至94之间。平衡时间(90分钟)后,抗原的挑战是由添加β-lactoglobulin(100毫克)铃声的解决方案。抗原是注入30分钟。51Cr活动收集样本测量γ计数器(眼镜蛇II;帕卡德、梅里登、CT、美国)和水通量为每15分钟计算使用以下公式:净水通量(μl /厘米/ h) = (1−(cpm)年代/ cpmx)×(P / L), cpm的地方年代和cpmx是51Cr放射性分别在振铃器解决方案和废水,P是灌注率(μl / h)和L空肠段的长度(厘米)。正值代表净吸收的水,负值表示净分泌。
药物
在这项研究中使用的药物是:SR 48968 (年代)- - -N甲基- [4-acetylamino-4-phenyl piperidin-2 - (3、4) dichlorophenyl)丁基]苯甲酰胺)(saredutant)用作盐酸盐;SR 40333 (年代)1 - {2 - [3 - (3,4-dichlorophenyl) 1 (3-isopropoxyphenylacetyl) piperidin-3-yl]乙基}4-phenyl-1-azoniabicyclo[2.2.2]辛烷氯](氯nolpitantium);SR 142801 (R)- (N)- (1 - {3 - (1-benzoyl-3 - (3 4-dichlorophenyl) piperidin-3-yl)丙基}4-phenylpiperidin-4-yl) -N-methylacetamide) (osanetant)作为盐酸。他们是由赛诺菲安万特矫揉造作的合成和溶解在盐水含有50% (v / v)二甲亚砜。
统计分析
PCA滴定度值、肥大细胞数量和抗原诱导空肠的分泌比较方差分析后,利用学生的未配对t测试或未配对的Mann-Whitney测试值。结果表示为(SEM),和差异被认为是显著p < 0.05。
结果
敏化作用速率
没有检测到主成分分析测试积极回应non-sensitised豚鼠和non-sensitised动物NK受体拮抗剂治疗。在敏感动物处理车辆,PCA滴定度达到1.84 (0.16)。敏感动物对待NK1或NK3受体拮抗剂,滴定度都显著(p < 0.01)降低(分别为0.98(0.18)和0.75 (0.08))。滴定度不明显(p > 0.05)修改(1.98(0.15))在动物对待NK2受体拮抗剂(无花果1)。
抗体β-lactoglobulin(β-LG)评估被动皮肤过敏反应试验豚鼠non-sensitised和敏感控制和敏感治疗三周与NK1 (SR 140333), NK2 (SR 48968)或NK3受体拮抗剂(SR 142801)。*明显不同(p < 0.05)从non-sensitised控制(n = 12);†明显不同(p < 0.05),从敏感控制(n = 12)。
反β-lactoglobulin免疫球蛋白滴定度披露ELISA和表达为吸光度获得1:30稀释血清中没有检测到non-sensitised控制。滴定度为0.71(0.07)在敏感动物处理车辆。显著降低(p < 0.05)在敏感动物对待NK1和NK3受体拮抗剂(分别为0.39(0.05)和0.20(0.03))但不显著(p > 0.05)修改NK2受体拮抗剂治疗(0.59)(0.07)(无花果2)。
三周的治疗效果与NK1, NK2或NK3受体拮抗剂anti-β-lactoglobulin免疫球蛋白抗体滴定度。*明显不同(p < 0.05)从non-sensitised控制(n = 12);†明显不同(p < 0.05),从敏感控制(n = 12)。
空肠的肥大细胞
肥大细胞的数量/毫米2空肠显著(p < 0.05)提高敏感动物(113.3(9.2))相比,non-sensitised动物(78.1(6.2))或non-sensitised动物NK1对待,NK2,或NK3受体拮抗剂(75.4(5.3),82.6(3.5),和73.7(6.1)分别)。NK1受体拮抗剂废除了敏化作用引发的肥大细胞的数量增加(64.2 (6.7))。然而,肥大细胞的数量没有明显(p > 0.05)修改NK2或NK3受体拮抗剂治疗敏感豚鼠(120.7(15.6)和107.8(12.8)分别)(图3)。
空肠段non-sensitised的肥大细胞数量和敏感控制和敏感动物治疗三周与NK1 NK2或NK3受体拮抗剂。*明显不同(p < 0.05)从non-sensitised控制(n = 6);†明显不同(p < 0.05),从敏感控制(n = 6)。
空肠的分泌抗原后的挑战
注入β-lactoglobulin(100毫克)的敏感动物逆转的净水通量的空肠的循环吸收分泌状态。这种变化不会发生在non-sensitised non-sensitised动物和动物对待NK1, NK2或NK3受体拮抗剂。在这些,吸水率是常数在整个研究过程中。基底净水通量敏感动物24(19)μl在前30分钟/厘米/ h抗原的挑战。β-lactoglobulin intrajejunal灌注期间超过30分钟,净分泌的水,达到−55(4)μl /厘米/ h,被观察到。β-lactoglobulin挑战后,净吸水后恢复和价值观注入与基底值没有显著不同。在敏感动物对待NK1受体拮抗剂,抗原的挑战没有诱导分泌过多(49.5(20.5)μl /厘米/ h)。诱导分泌过多的挑战并不显著(p > 0.05)修改NK2或NK3受体拮抗剂治疗(−59.5(16.5)和−46(16.6)分别μl /厘米/ h)(图4)。
intrajejunalβ-lactoglobulin注入对空肠的净水通量non-sensitised (A)和(B)敏感控制在豚鼠和(C) NK1治疗三周,(D) NK2或(E) NK3受体拮抗剂。*明显不同(p < 0.05)从non-sensitised同期控制(n = 6)。
讨论
我们的结果表明,NK1 NK3速激肽受体参与口腔敏化作用的过程在豚鼠β-lactoglobulin。所使用的化合物(SR 140333、SR 48968和SR 142801)被认为是选择性和NK1强有力的对手,NK2, NK3受体月19 - 21日分别时,我们可以假设SP和NKB,但不是NKA,扮演一个角色在这个敏化作用的过程。口服敏化作用的模型我们使用被发现后诱发过敏的消化障碍类似发现肠胃外的敏化作用。29日敏化作用的口服途径模仿什么发生在婴儿牛奶过敏疾病,因此似乎是一个临床相关的模型。但是,与婴儿牛奶过敏,没有观察豚鼠的腹泻,但软粪便与加速结肠运输被描述在这个模型。30.PCA测试是用来评估经典程度的敏化作用,分泌和肠道液体常被用来评估后速发型过敏反应的强度抗原的挑战。31日51Cr-EDTA通常被认为是上皮通透性的一个标志。32,33然而,发现其吸收非常低,即使是在炎症性肠病的患者。34Theodorou等28显示非常低的吸收51Cr-EDTA,大约1 - 2%的服用剂量口服后,在尿液中排出24 h。因此,的数量51灌注Cr-EDTA吸收从5厘米空肠段可能不是重要的。尽管报告的瞬态空肠的渗透率增加挑战执政期间,5,35我们发现的复苏51Cr-EDTA,计算总体积的废水收集在实验期间,从102%到94不等。此外,我们没有发现微量的放射性物质在血液样本的实验(数据没有显示)。几项研究食物过敏,肥大细胞计数的结果是有争议的。在一项研究中,在同一模型豚鼠牛奶过敏,作者没有发现任何修改结肠黏膜下肥大细胞计数的敏化作用。36在其他的研究中,没有明确的相关性肥大细胞计数和食物过敏已被证明。5,37然而,肥大细胞增生在敏感动物在目前的研究中发现也被描述在一个食物过敏的大鼠模型,38和一些研究显示可能的系统性肥大细胞增多症和食物过敏之间的关系。39
血清anti-β-lactoglobulin IgE的滴定度和免疫球蛋白减少与老NK1受体拮抗剂治疗后140333年。我们可以假定SP参与敏化作用过程通过增强免疫球蛋白合成B淋巴细胞。如众所周知的B和T淋巴细胞之间的相互作用为IgE生产是至关重要的,40这样一种假说都同意SP受体B和T淋巴细胞的存在41刺激淋巴细胞增殖的SP。42另一方面,IgE合成已被证明是受细胞因子。例如,interleukin-4, 5、6上调,而interferon-γ和白介素2表达下调,IgE生产。43外源性SP已经发现刺激和6及肿瘤坏死factor-α释放单核细胞。44这种效应发生在低剂量的SP和特定,因为它被一个SP拮抗剂。此外,白细胞介素- 6刺激T淋巴细胞的生长。45SP也一直强调IgE interleukin-4引起的合成。46综上所述,上述数据支持刺激作用SP IgE生产和同意IgE的减少和免疫球蛋白滴定度观察治疗后的敏感动物NK1受体拮抗剂。
NKB中也扮演了重要的角色在β-lactoglobulin抗原敏化作用,IgE和免疫球蛋白g滴定度减少NK3受体拮抗剂治疗。然而,我们无法解释这种效果,正如NK3受体从未报道出现在免疫细胞。直到现在NK3受体在消化道被肠肌及粘膜下神经元在大鼠胃肠道,12胆碱能神经元的豚鼠回肠肌间神经丛,47和内在感觉神经元投射到大鼠回肠粘膜。13
我们已经表明,肥大细胞数量的增加在敏感动物被废除NK1受体拮抗剂治疗。存在的解剖和功能之间的联系amyelinic神经纤维和肥大细胞早已确立3并建议双向营养神经和肥大细胞间发生的相互作用。肥大细胞影响感觉神经元的发展通过神经生长因子的释放。另一方面,破坏新生大鼠SP感觉神经元的辣椒素被发现以减少肠粘膜肥大细胞的数量。48此外,一些细胞因子如interleukin-3 4 9日和-10年和神经生长因子促进肥大细胞增殖,49并且它可以推测,这些细胞因子参与增殖行动SP的肥大细胞。然而,抑制作用的激肽1受体拮抗剂对肥大细胞增殖引起牛奶敏化作用似乎是专门由SP和NK1受体,这种扩散不是NK2和NK3受体拮抗剂治疗后观察。
一个有趣的发现问题的影响差异的激肽1和NK3受体拮抗剂治疗敏感的动物。NK1受体拮抗剂减少IgE和免疫球蛋白g滴定度,废除hypermastocytosis,并封锁了空肠的分泌抗原反应的挑战,而NK3受体拮抗剂也减少IgE和免疫球蛋白滴定度但没有修改hypermastocytosis或过敏性分泌反应。这可能表明,在食物过敏,至少在豚鼠牛奶过敏,肠道hypermastocytosis也许是一种诱发分泌反应抗原的挑战。它也表明,肥大细胞稳定器doxantrazole抑制挑战诱导豚鼠结肠分泌的牛奶敏感。28
另一种解释为敏化作用下降率处理后的激肽1和NK3受体拮抗剂可以减少抗原的吸收。结果在肠道通透性抗原后的基底状态或挑战动物敏感牛奶是有争议的。在一项研究中,50肠道通透性下降了4周后牛奶的敏化作用。相比之下,另一项研究29日显示的是三周后肠道通透性增加牛奶的敏化作用。此外,它最近表明,NKA通过NK2受体的激活肠道通透性增加,51我们没有发现敏化作用速率NK2受体拮抗剂治疗后的变化。因此没有证据作用的激肽1或NK3受体拮抗剂在肠道通透性。
它可以得出结论:NK1和NK3受体拮抗剂治疗以降低敏化作用的速率在豚鼠口服牛奶蛋白通过不同的机制,一个动作在肠道hypermastocytosis和分泌反应抗原挑战被观察到NK1受体拮抗剂而两的激肽1和NK3受体拮抗剂减少IgE和免疫球蛋白g滴定度。
确认
作者感谢科莱特Betoulieres和吕西安Ressayre娴熟的技术援助。这项工作是支持的研究协议INRA /赛诺菲(c - 9764)和联合欧洲胃肠病学周是6日,1997年10月,英国伯明翰。
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- SP
- P物质
- NK
- 神经激肽
- 主成分分析
- 被动皮肤过敏反应
- ELISA
- 酶联免疫吸附测定