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背景结直肠腺瘤没有的遗传流行病学研究前瞻性结肠镜检查患者没有癌症。
的目标是研究基因改变在结直肠腺瘤和关联这些病人的人口统计和腺瘤的特征。
方法等位基因突变和缺失201年腺瘤从60岁患者与人口特征相比,腺瘤特点,和家庭的历史。
结果最常见的变化是K -拉原癌基因突变,出现在腺瘤的35%和65%的患者。患者65岁及以上的K -概率降低拉突变(26%比45%)。p53基因的超表达产品出现在只有6%的腺瘤,但更频繁的绒毛状或tubulovillous腺瘤(19%和3%)。等位基因的染色体18问在场的只有2%的腺瘤和明显不如p53过度频繁。DNA复制错误(r)在腺瘤的7%和15%的病人,包括4名患者的多个腺瘤与遗传即结直肠癌综合征(两个)。只有36%的r正面的腺瘤BAT-26等位基因的改变,没有改变BAT-25,且只有一个(8%)转化生长因子βII型受体的突变基因。r正面的腺瘤更有可能有一个K -拉突变。在多个腺瘤患者,有和谐的p53过度和K - r但不是拉突变。
结论遗传进展在结直肠腺瘤是异构的,涉及因素与病人年龄和r的存在对ras突变的发生,但是不同的个体内的特征p53的发生改变和r。
- K -拉突变
- p53基因
- 18问损失
- 微卫星不稳定
- 复制错误
- TGFβRII
缩写
- APC
- 腺瘤息肉病杆菌
- DCC
- 删除在结肠直肠癌
- FAP
- 家族性腺瘤息肉病
- HNPCC
- 遗传即结直肠癌
- LOH
- 杂合性丢失
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- r
- 复制错误
- TGFβRII
- 转化生长因子β2型受体
来自Altmetric.com的统计
结直肠癌是第二个最常见的癌症死亡原因在美国。从腺瘤息肉多数直肠癌发展,形态学和遗传进程在一个adenoma-adenocarcinoma序列和遗传性结直肠癌描述。1 - 4
零星的分子基因改变和遗传结直肠肿瘤理解和涉及两个不同的途径。1 - 4基因改变目前在大多数结肠直肠癌也存在于腺瘤,包括删除突变或缺失的腺瘤息肉病杆菌(APC)基因5号染色体上q,5 - 7点突变的K -拉原癌基因,8-16损失的删除结直肠癌(DCC)附近的基因和基因在染色体18问,7,17日至19日和p53基因的突变和/或删除染色体17 p。8,9,20生殖系的APC突变导致家族性腺瘤息肉病(FAP)。5,6APC基因的改变和K -拉突变基因事件观察早期adenoma-carcinoma序列,5而损失的染色体18 q和变更的p53迟到事件。K -拉独立的结肠途径致癌途径也可能存在于正确的站在结肠癌癌,可以开发从扁平腺瘤。11,24,25
在第二个途径结直肠肿瘤,DNA复制错误(r;微卫星不稳定性、无处不在的体细胞突变)是由核苷酸错配修复基因突变引起的,包括hMSH2 hMLH1, PMS1 PMS2, GTBP。1 - 4生殖系突变的错配修复基因遗传原因之一即结直肠癌综合征(HNPCC)。r的特点是添加和删除大量的核苷酸重复的核苷酸序列(微卫星)。r积极大肠癌癌通常是正确的支持和低分化二倍体细胞群;这些癌症患者有更好的生存。完全改变的10 (bp) polyadenine束中转化生长因子β2型受体(TGFβRII)基因存在于90%以上的r积极的癌。26,27r和TGFβRII的改造也在结直肠腺瘤。即
虽然这些基因事件一直在零星的广泛的研究大肠癌癌,与相邻或同步癌,腺瘤和家族性结直肠肿瘤患者和前体(FAP和HNPCC),1 - 3,5,6,31日这些事件还没有被调查的前瞻性研究散发性结直肠腺瘤切除在结肠镜检查病人没有癌症。因此,我们评估K -拉点突变、染色体18 q, p53基因产物的过度表达,r表型,201年TGFβRII基因突变零星的结直肠腺瘤的队列和比较结果与人口和腺瘤的特征。
材料和方法
患者人群
这项研究包括内镜活检标本(n = 154)、息肉切除术标本(n = 44),切除标本(n = 3)收集201结直肠腺瘤从60岁患者的前瞻性的内窥镜检查单位的约翰霍普金斯医院。30一个病人(52%)有两个或两个以上的结肠镜检查的标本。临床调查的联合委员会(机构审查委员会)的约翰·霍普金斯大学医学院的审查和批准使用的同意表格和程序在这项研究中,从每个病人和书面知情同意了。
资格标准及排除标准
招聘合格标准的结肠镜检查患者:(1)结直肠腺瘤的历史,症状和/或结直肠肿瘤的迹象,积极的粪便隐血试验,或结直肠肿瘤家族史;(2)年龄18岁或以上;(3)理解研究的能力。病人填写一份详细的问卷调查表包括提出投诉、过去病史、家族史。
排除标准是:拒绝参与,没有结直肠腺瘤在结肠镜检查,无法给予知情同意或完成调查问卷由于缺乏英语语言技能或不满意的心理状态、腺瘤息肉病综合症,或结直肠癌的历史,和不满意的遗传分析腺瘤标本(没有扩增的DNA聚合酶链反应测定)。
家族性癌症的历史
每个病人的结直肠癌家族史的评估。积极的家族史患者被定性为满足标准遗传即结直肠癌(HNPCC)所定义的国际合作组织34至少三个亲戚在连续两代组织学证实的结直肠癌;一级亲属中至少有两个是第三;一个成员被诊断之前50岁;FAP是排除在外。其他类别的分类是遗传性结肠癌(至少连续两代结直肠癌,或者至少与结直肠癌和连续的一代一代腺瘤息肉),家族遗传性结肠癌的风险(两个家庭成员与腺瘤息肉或直肠癌在相同的一代,与腺瘤息肉或两个家庭成员不同的一代又一代),癌症家庭综合症(至少连续两代人患癌症,至少50%的癌症不结直肠),家族癌症家庭综合症的风险(多个non-colorectal癌症一代),和年轻的结肠癌(结肠癌在50岁,应用单独或结合上述类别)。
标本和腺瘤特征
苏木精和伊红染色幻灯片和石蜡嵌入式,福尔马林固定,或Bouin固定(1991年之前)组织的腺瘤块来自约翰霍普金斯医院的外科病理学文件。血液标本收集从每个病人静脉穿刺,处理,冻结。息肉的大小来自内镜笔记(n = 156)或者从病理标本(n = 45)。息肉的网站是取自手术病理申请书colonoscopist表完成。综述了组织病理学幻灯片的胃肠道病理学家(AR)。组织病理学的绒毛状腺瘤的估计部分。如果绒毛状腺瘤被归类为管状组件目前的不到25%的表面上,tubulovillous如果绒毛组件25 - 75%,和绒毛如果绒毛组件包含超过75%的表面。只有三个腺瘤优质发育不良,因此严重发育不良并不是评估任何进一步的在我们的研究中。
DNA制备
腺瘤组织和控制分开基因组DNA提取non-adenomatous结直肠组织(息肉茎或本地其他标本colorectum)通过显微解剖和准备如前所述。35-37腺瘤上皮细胞的DNA代表至少50%肿瘤DNA。我们可以放大DNA聚合酶链反应(PCR)福尔马林固定或Bouin的大部分固定组织。从外周血DNA时使用non-adenomatous组织并不是可用的。
微卫星标记和PCR扩增
5二核苷酸重复微卫星标记染色体的长臂18 (D18S58、D18S61 D18S55, D18S64,和D18S69着丝粒和端粒)被用来确定杂合性丢失(LOH)染色体18 q和r的地位。38基于PCR的二核苷酸重复化验在96孔板进行了35周期;每个周期在95°C进行了30秒,30秒50°C, 70°C一分钟,在一个缓冲区包含83.75毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8.8,20毫米(NH)2所以4,1.8毫米MgCl2,12.5毫米β巯基乙醇,125μg牛血清白蛋白(BSA), 250年μM dATP, dGTP, dTTP, 6.25μM dCTP, 0.05μl (a32P] dCTP (NEN杜邦;3000 Ci /更易),0.6μM PCR引物和0.5单位Taq DNA聚合酶在12μl体积。同等体积的挡车器(95%甲酰胺、20毫米EDTA和0.05%溴酚蓝和二甲苯cynanol)添加放大末,和样品被加载到8%聚丙烯酰胺凝胶含有5.6尿素。r状态或损失的杂合性染色体18问不能确定25腺瘤由于缺乏non-adenomatous组织或冻结的血液样本(n = 8),或缺乏PCR扩增三个或更多标记(n = 17)。
18问染色体杂合性丢失
损失与损失有关的染色体18 q是DCC基因mRNA的表达,17,38DPC4基因,18和JV18基因。19失去一个标志被认为是目前PCR试验时显示缺失或减少强度的50%的一个乐队从肿瘤样本相对于控制non-neoplastic样本。完全或部分丧失每个染色体18问评估,基于标记的模式的损失。
r状态
DNA复制的存在错误(r)决心的PCR扩增5二核苷酸微卫星标记染色体的长臂18(18问)。r正面的腺瘤是由变化的乐队比控制在至少两个微卫星DNA标记(图3)。r状态不能确定25腺瘤19例由于失败的DNA扩增三个或更多标记或缺乏non-neoplastic组织。
在结直肠腺瘤r。不稳定的微卫星标记显示额外的乐队(箭头)。N, non-neoplastic;广告,腺瘤。
统计分析
本研究的主要统计端点的决心在腺瘤基因改变的相关因素。不止一个腺瘤患者多次代表在这个数据集。这些重复的观察来确定是否能够被认为是独立的,χ2拟合优度为每个类型的测试进行了改动。观察变化的频率足够时,边际逻辑回归模型相关的二进制数据被用来评估协会与人口特征和腺瘤的特征。估计得到使用广义估计方程(GEE)方法的梁和Zeger。40当在主题相关性很小,哎呀回归分析的独立工作模型已被证明是足够了。为改变独立的假设被拒绝是因为一个或两个病人和有效的观察改变样本太小啊回归,费舍尔的确切测试执行与和没有这些病人。与K -测试关联的因素拉包括年龄、性别、地点、腺瘤大小、绒毛组件,18问损失,p53过度,和r状态。正式的统计方法为多个比较没有执行,因为这被认为是一个探索性研究生成假设可以在将来的研究中进行测试。
结果
表1总结了人口和腺瘤病人的人口统计特征。表2和图6总结结直肠腺瘤的基因改变。表3比较大小,组织病理学,解剖学的腺瘤。
腺瘤的基因改变女性男性(A)和(B)的病人。
和合多个腺瘤患者的基因改变
40一个患者(68%)有多个腺瘤内提供了一个机会来评估主题相关的基因改变。多个腺瘤患者,K -拉变异存在于腺瘤的36%(65/181),染色体杂合性丢失18问在2% (4/163),p53超表达在6%(11/182),和r在7% (12/163)。p53超表达中没有独立的多个腺瘤(p = 0.001,χ2拟合优度)——也就是说,p53超表达在一个腺瘤的发生的概率显著增加p53超表达腺瘤。这主要是由于一个在三个五个腺瘤患者p53超表达。在病人相关r也显著(p = 0.001,χ2拟合优度)由于两个r变化在两个腺瘤患者。相比之下,没有统计学意义在K -主题相关拉突变(p = 0.55,χ2拟合优度)。两个或两个以上的腺瘤患者的15%(6/41)有K -拉突变腺瘤,17%(7/41)没有K -拉突变,68%(28/41)有K -拉突变在一个或多个但并不是所有的腺瘤。
C -K -拉突变
突变在K -拉是最常见的基因改变,发生在结直肠腺瘤的35%(70/200)代表65%的病人(表吗2)。最经常改变核苷酸位置是第二密码子12日核苷酸和最常见的突变是替代的asparatic酸甘氨酸由于过渡(49%的K - G拉突变;表4)。两个ras突变被发现在7%的腺瘤(15/201),所有涉及密码子12。在53%的腺瘤有两个突变,相同的核苷酸位置显示不同的突变,表明两个腺瘤中积累。
患者65岁及以上有K -的可能性大大降低拉突变腺瘤(26%比45%,p = 0.01,哎呀回归模型;表5),但是没有K -协会拉突变腺瘤性或站点。K -流行的轻微增加拉突变绒毛状或tubulovillous腺瘤与管状腺瘤(43%比33%,p = 0.33,哎呀回归模型;表3),在较大的腺瘤(腺瘤大小0.5厘米或更少的31%和41%在那些超过0.5厘米,p = 0.16,哎呀回归模型;表3),但是差异没有统计学意义。
18问染色体杂合性丢失
杂合性丢失的染色体18问是罕见的,在只有2%的结直肠腺瘤(4/176),和频繁的显著低于p53超表达(6%,13/201,p = 0.05)。
p53过度
p53基因的超表达产品出现在结直肠腺瘤的6% (13/201)。染色是焦点在四个七腺瘤和地区,与p53变更建议积累色素的存在,分散在两个。p53超表达中没有区别男性和女性(腺瘤10/128的男性和3/73的女性,p = 0.4)。相比之下,50 - 75岁的病人,p53超表达是目前只在从雄性腺瘤患者(男性的腺瘤和腺瘤女性的0/39,10/128 p = 0.06,确切概率法;无花果5)。p53过度三腺瘤被认为从左边colorectum两女性超过75岁。有频率的增加p53过度tubulovillous腺瘤与管状腺瘤(19%比3%,p = 0.001,确切概率法;表3)。
r状态
r存在于腺瘤的7%(13/176测试)从8个病人。的13个腺瘤与r表型评价二核苷酸标记,有流动性变化在所有5个标记,一个在四个,两个三个,其余九两个标记(至少40%的二核苷酸标记)。短等位基因不稳定BAT-26存在于36%的r正面的腺瘤(4/11腺瘤与PCR扩增)从三个病人。没有检测到不稳定的BAT-25等位基因在11 r正面的腺瘤。
腺瘤的百分之四十四从三个HNPCC患者(分别为2/2,2/5,0/2)r积极non-HNPCC患者和5%(表2;确切概率法,p = 0.002)。所有四个腺瘤与r表型HNPCC患者流动变化两个微卫星标记和一个在BAT-26转变。另一个病人的五个腺瘤与r有遗传性结肠癌家族史(见定义)材料和方法。相比之下,患者4 r在3/12,2/2,1/11,1/5,1/1腺瘤有消极的家族史。7 8 r正面的腺瘤患者的多个腺瘤(范围2 - 12)。有关系r的腺瘤和r metachronous或同步腺瘤(p = 0.001,χ2拟合优度)。尽管r积极癌症通常正确的支持,41r正面的腺瘤没有在右结肠比左colorectum更常见(9%比6%,p = 0.56,确切概率法)。同样,标记与转变的百分比不高对支持腺瘤(45%比50%,p = 0.81)。HNPCC患者中7 r正面的腺瘤或腺瘤BAT-26等位基因的改变,四是对的支持。
改变在TGFβRII
TGFβRII基因的突变是非常罕见的,在只有一个13 r正面的腺瘤201腺瘤的研究。这个改变是出现在一个r没有HNPCC积极tubulovillous腺瘤患者。
讨论
结直肠肿瘤的分子遗传学,包括腺瘤,已经被广泛的研究,但很少有研究解决前瞻性的临床和病理协会定义的患者群体。因此,我们研究了腺瘤在一群没有癌症患者接受结肠镜检查。设计的局限性在我们的研究中包括多个统计对比和低频率的基因改变腺瘤没有结直肠癌的患者。生成的重要关联在这项研究中应考虑勘探由于较少的基因事件,应该在将来的研究中得到解决。
K -拉突变在我们的研究中35%的腺瘤。K -的报道数据大相径庭拉突变腺瘤文学有很大的差别,从20%降至70%。8-16在K -这些变化拉变异率在结直肠腺瘤可能反映了地理和饮食变化风险研究中公认的致癌剂种群在不同国家或在这些研究使用不同的分析技术。42临床对K -拉突变腺瘤也变量在文学。K -拉据报道突变腺瘤之前的结直肠癌患者中更常见。10,14缺乏K -拉突变对站在患者的结肠癌癌比70年据报道,年轻43但是我们发现K -患病率较低拉旧的而不是突变腺瘤较年轻的患者。我们的结果证实了先前的研究显示低流行率(18%)的K -拉没有同步癌突变腺瘤的病人超过70岁。14相关性的K -拉突变与大小或组织病理学显示冲突的结果在不同的研究中,9,10我们发现没有显著关系。K -患病率较低拉突变发生在扁平腺瘤。11,24
异质性的K -拉突变microdissected地区内腺瘤和多个K -拉突变个体结直肠腺瘤的报道,16,44我们发现两个突变腺瘤的7%。两个突变腺瘤可能代表两个人积累和两个不同的变异或突变的K -两个副本拉。突变的类型可能是重要,因为g c或g t颠换存在与DNA异倍体性结直肠腺瘤,13在公爵和颠换更常见的C大肠癌癌相比,公爵的癌45在复发性大肠癌癌。46相比之下,大多数的突变在我们研究g转换。一个大腺瘤患者(超过1厘米)窝藏K -拉突变预计将有一个更高的风险大metachronous腺瘤,14但我们的研究显示没有K -的意义拉K -突变作为一个预测拉突变同步或metachronous腺瘤患者的多个腺瘤。Non-concordance K -拉突变在多个腺瘤在同一病人对K的发病机理,提出了问题拉改变在结直肠肿瘤。此外,我们的研究结果表明,K -拉突变的腺瘤不太可能是一个可靠的预测单个腺瘤复发的病人。
等位基因的染色体18 q是一个事件在结直肠致癌作用,因为它存在于大肠癌癌的70%,38但在不到20%的阶段我癌17和10%的腺瘤。718号染色体上的损失与DCC, DPC4和JV18基因。17日至19日,38我们的结果表明,18号染色体存在于损失只有2%的零星的腺瘤在结肠镜检查系列。这种低利率可能在这项研究反映了息肉的体积小(97%的息肉大小2厘米或更少)。
p53表达与p53基因突变相关的类型存在于腺瘤的6%,代表频率高于18问损失在我们的研究中。超表达是感兴趣的,因为异常的分布通常是在肿瘤上皮细胞呈现区域,表明与p53 subclone超表达在tumourigenesis晚期出现。在文献报告了类似的结果,改变p53在结直肠腺瘤的5 - 26%,8,9,20在53%的癌的病灶在腺瘤,22,23和70%的癌。20.,21
我们观察到r在7%的代表八个腺瘤患者,标准的基础上至少有两个五二核苷酸的标记等位基因的转变。五的病人有两个或两个以上的腺瘤r的标准,这些患者和两个HNPCC家族的成员。r一直在零星的腺瘤的3%29-32和腺瘤HNPCC家庭的60 - 95%。27,29-31改变在BAT-26等位基因存在于36%的r正面的腺瘤在我们的研究中,这是类似于r的频率50%正面的腺瘤的文献报道。47移码突变在TGFβRII已经观察到腺瘤HNPCC家庭的57%,27但很少在零星的腺瘤,33和后期存在adenoma-carcinoma序列。47我们发现突变TGFβRII基因只在一个r积极腺瘤(8%)和r -腺瘤。27因此我们证实了先前的研究表明变更单核苷酸的标记(BAT-26, TGFβRII等等),这是一个敏感的预测高微卫星不稳定性在结直肠腺癌,不频繁的腺瘤。33,47因此,区分“低”微卫星不稳定和“高”微卫星不稳定48,49在腺瘤是成问题的。
K -的发生拉变异在50%的r从HNPCC患者据报道正面的腺瘤,27我们发现积极腺瘤的概率增加了K - r拉突变。K -的频率拉突变r积极的结直肠肿瘤不是定居,因为据报道,突变发生在一些系列类似于微卫星频率稳定的癌症中,50 - 54但在低频率。31日这是猜测,K -拉可能没有一个主要角色r积极的结直肠肿瘤的进展。55
我们发现一个高比例的r积极腺瘤在左结肠直肠肿瘤以及高频率的K -拉突变r正面的腺瘤。相比之下,r积极直肠癌强烈支持。41因此,一个正确的支持偏好或K -频率较低拉突变没有观察到即使在r从HNPCC家族正面的腺瘤或腺瘤BAT-26变更。r正面的腺瘤的特征之间的差异和癌症仍有待解释。
总之,我们的研究显示结直肠tumourigenesis所涉及的基因改变的复杂性。因素与患者年龄和r K -的发生拉突变,低频率的ras突变在老年患者和更高的频率在r正面的腺瘤与HNPCC患者。相比之下,p53改变个体内的变异较少,有利于比K -不同的病原学的因素拉突变。
确认
我们承认Rahj罗宾逊女士对招募病人在这项研究中,打字手稿的夫人南希民间,艾伦·温斯洛女士的照片。本研究支持部分由克莱顿基金和拨款CA63718 CA62924, CA41108从美国国家癌症研究所,国立卫生研究所。这个刊物的内容是完全的责任作者,不一定代表美国国家癌症研究所的官方观点。
缩写
- APC
- 腺瘤息肉病杆菌
- DCC
- 删除在结肠直肠癌
- FAP
- 家族性腺瘤息肉病
- HNPCC
- 遗传即结直肠癌
- LOH
- 杂合性丢失
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- r
- 复制错误
- TGFβRII
- 转化生长因子β2型受体