条文本
PDF
文摘
背景和目的遗传即结直肠癌(HNPCC),顾名思义,与几个腺瘤,结直肠肿瘤的早期演化是知之甚少。在这项研究中我们的目的是澄清的遗传资料良性息肉与HNPCC科目使用结合分子和免疫组织化学方法。
方法三十腺瘤和17增生性息肉获得24个HNPCC主题的影响。从石蜡包埋组织提取DNA通过显微解剖和分析微卫星不稳定性(MSI)的存在和基因突变在五个已知目标错配修复缺陷(TGFβRII, IGF2R,伯灵顿,hMSH3 hMSH6)。串行部分被免疫组织化学染色hMLH1和hMSH2。
结果24(80%)的30个腺瘤显示MSI。MSI正面的腺瘤,66.7%显示MSI超过40%的标记(高水平的MSI (MSI-H))。两个17增生性息肉透露MSI在一个标记(低水平的MSI (MSI-L))。之间存在显著相关MSI-H和优质异生腺瘤(p = 0.004)。八九腺瘤与突变的编码序列显示优质发育不良和九个都是MSI-H。四个九的大小不等,从2到5毫米。hMSH6突变的存在显著相关,高水平的MSI标记(80%)(p < 0.02)。二十四腺瘤可评价的结果与免疫组织化学。六(17%)微卫星稳定,六7 (86%)MSI-L, 11和11 (100%)MSI-H腺瘤显示hMLH1或hMSH2的损失。
结论大部分腺瘤在主题明确的诊断HNPCC显示MSI (80%)。MSI-L通常是与损失有关的发现表达hMLH1或hMSH2与MSI-L零星的结肠直肠癌的情况。从MSI-L过渡到MSI-H与优质发育异常的发现和编码序列的突变,可以由二次调整器如hMSH3和hMSH6突变。先进的基因改变可能存在的腺瘤大小。
- 腺瘤
- 微卫星不稳定
- 错配修复
- 遗传即结直肠癌
略语
- HNPCC
- 遗传即结直肠癌
- MSI
- 微卫星不稳定
- 海量存储系统(MSS)中
- 微卫星稳定
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- TBS
- 三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐
来自Altmetric.com的统计
结直肠肿瘤的早期演化遗传即结直肠癌(HNPCC)是知之甚少。虽然有时候可能证明剩余腺瘤毗邻HNPCC癌症,1使用突变体细胞微卫星分子时钟披露令人惊讶的是长时间的平行进化的腺瘤和癌。2这表明腺瘤和癌可能不是按顺序相关但来源于一个共同前体病变的微观维度。2这可以解释部分的验证观察间隔癌症在HNPCC患者提出癌症不久负结肠镜检查检查。3然而,虽然腺瘤是罕见的在HNPCC科目数量不成比例的诊断在50岁之前,4他们更有可能大,有绒毛状形态,展示优质发育不良。4这些观察已经推出了“HNPCC咄咄逼人腺瘤”的概念5的快速发展是由遗传不稳定的收购将在DNA错配修复机制的崩溃。6
DNA错配修复缺陷会导致高水平的微卫星不稳定性(MSI-H)在癌症组织。人们普遍同意,p53突变和17 p和18杂合性丢失在MSI-H罕见的癌症,是否HNPCC7或零星的。8,9基因编码序列中重复的大片似乎提供了另一种进化的分子通路MSI-H结肠直肠癌。这些包括TGFβRII、10IGF2R,11伯灵顿,12CDX-2,13E2F-4,14和半胱天冬酶5。15然而,尽管微卫星不稳定性(MSI)可以建立在腺瘤形成的早期阶段,包括微观异常病灶的洞口,2,16,17在高频突变基因没有被发现腺瘤显示MSI。16,18,19TGFβRII被描述为一个非常早期的突变,可能启动事件16而另一些链接TGFβRII突变adenoma-carcinoma过渡的阶段。18伯灵顿突变也被有关adenoma-carcinoma过渡。19遗传不稳定的程度似乎与腺瘤进展的风险。20.有人建议,微卫星突变表型的充分发展取决于招聘“二级”调整器。21其中hMSH3 hMSH6,容易错配修复基因移码突变体细胞的发展由于重复的编码序列。21
本研究的目的是将一系列的腺瘤获得受试者的确诊HNPCC根据微卫星状态(微卫星稳定(MSS) MSI-low (MSI-L)和MSI-H)和评估严重亏损的时机表达hMLH1 hMSH2和招聘的辅助调整器(MSH3和MSH6)。通过关联这些观察示范TGFβRII突变的IGF2R,和伯灵顿,以及古典形态腺瘤进展的风险因素,可以得出一个清晰的分子步骤管理HNPCC癌症的起源。
材料和方法
病人和息肉
17增生性息肉和腺瘤30来自24个HNPCC学科影响石蜡包埋档案样品。所有的家庭符合严格的标准对HNPCC作为HNPCC定义的国际合作组织。22此外,每个家庭至少有两个癌症被要求展示高水平的DNA MSI。影响受试者招募的基础上开发一个MSI-H大肠癌或HNPCC相关癌症不到50岁。22个腺瘤(73.3%)来自10个科目(四个不同的家庭成员)携带hMSH2或hMLH1生殖系突变。24日的主题,10男,14是女性。获得的一些息肉手术切除同步结肠癌和其他人的报告。一至12息肉得到每个主题。串行部分从每个石蜡块,第一个被苏木精和伊红染色组织病理学诊断和显微解剖作为模板。所有患者知情同意了这项研究当地的机构审查委员会批准。没有积累的经验在免疫组织化学hMLH1和hMSH2 83零星的8昆士兰肠癌和46个家族性结肠直肠癌症家庭登记处已知是海量存储系统(MSS)中,MSI-L或MSI-H(未发表的数据)都包括在这项研究。
DNA的制备和分析微卫星不稳定
石蜡包埋的DNA提取microdissected部分档案示例如前所述。23每一对的DNA样品,正常的粘膜和肿瘤,MSI在9个位点进行了分析:MYCL,24D2S123,25D5S346,26D10S197,27D18S58,28BAT25,29日BAT26,29日BAT40,29日和c-mybT22。30.基因座D10S197和D18S58分析只有在息肉分为海量存储系统(MSS)中,MSI-L或边缘MSI-H 7个位点。反应体积的聚合酶链反应(PCR) 10μl包括2μl DNA样本,10 nM的底漆,每个deoxynucleotide 2 nM triphoshate, 1μl PCR缓冲,2.5 U的Taq(勃林格曼海姆,曼海姆,德国),和1μl [33P] dATP。PCR是如前所述。23放大后,PCR电泳分离的产品5%变性聚丙烯酰胺凝胶和呈现放射自显影法(19:1)。在一个或多个微卫星标记肿瘤显示bandshifts称为MSI(图1)。MSI地位是subclassified高(MSI-H)当bandshifts被认为在三个标记(包括至少一个单核苷酸标记)和低(MSI-L)当少不稳定检测。得分的MSI是由两个独立观察员(嗨,司法院)。
四个位点表现出bandshifts样本,包括三个微卫星位点(BAT40, D2S123和c-myb)和hMSH3 poly (A) 8。DNA提取从2毫米管状腺瘤病人携带hMSH2生殖系突变。尽管小腺瘤的大小,所有9个微卫星位点显示不稳定,hMSH6(没有显示)。N,正常;T,肿瘤DNA。
重复序列的突变分析TGFβR-II IGF2R,伯灵顿,hMSH3, hMSH6基因
突变的存在TGFβRII poly(10)的,31日IGF2R poly (G) 8,11伯灵顿的poly (G) 8,12hMSH3 poly (8 A)的基因,32的poly (C) 8 hMSH6基因32聚合酶链反应和随后的聚丙烯酰胺凝胶电泳研究。PCR进行MSI检测。放大后,PCR电泳分离的产品在5%或8%变性聚丙烯酰胺凝胶(19:1)根据产品的大小,和可视化通过放射自显影法。存在bandshifts或额外的乐队被解读为突变(无花果1)。
免疫组织化学
石蜡切片(4μm)固定Superfrost +被指控幻灯片(Menzelglaser,布伦瑞克,德国)和干一夜之间在37°C。脱蜡、水化的部分通过下行分级醇蒸馏水。热抗原检索是由高压灭菌法的部分在0.001 M EDTA (pH值8.0)15分钟。冷却后,部分被转移到三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(TBS), pH值7.4。内源性过氧化物酶活动的孵化就熄了1% H2O2和0.1%的南3在TBS 10分钟。在TBS彻底清洗之后,部分是沉浸在商业脱脂脱脂奶粉4% TBS 15分钟抑制非特异性抗体结合,被转移到一个湿室之前,覆盖着10%正常山羊血清30分钟(无免疫力)。血清提供了过剩的部分然后孵化一夜之间在室温下主要单克隆抗体hMLH1和hMSH2。单克隆抗体G168-15 (anti-hMLH1稀释1:75 TBS)和Ab-2 (anti-hMSH2稀释1:120)获得PharMingen(美国加州圣地亚哥)和癌基因研究产品(美国马萨诸塞州剑桥),分别。
孵化项目后,部分被彻底洗三个TBS五分钟的变化。部分被孵化45分钟以适当的生物素化的二次抗体(酶实验室,旧金山,加利福尼亚,美国),然后streptavidin-horseradish过氧化物酶共轭(酶)15分钟。抗原网站被孵化部分显示0.05% 3、3′-diaminobenzidine与H三羟甲基氨基甲烷盐液2O2作为衬底。在运行自来水轻轻洗涤后,部分被轻轻与苏木精复染色,通过分级醇脱水,二甲苯清除,与DePeX安装。
统计分析
临床病理的变量和基因改变的频率之间的联系被χ评估2确切概率法,或使用Statxact Wilcoxon等级和统计方案。概率(p) < 0.05的值被认为是重要的。
结果
息肉的病理特征从HNPCC科目
网站和47个结直肠息肉的病理特征列于表1。七14测量不到5毫米,腺瘤(50%)6 9测量5 - 9毫米,腺瘤(66.7%)和四个七腺瘤(57.1%)的⩾10毫米优质发育不良。没有腺瘤之间的相关性大小和等级的发育不良(Wilcoxon等级和统计,p = 0.619)。
微卫星不稳定的频率
信息PCR产品获得60%的9个微卫星标记和bandshifts四个位点为MSI-H腺瘤(图所示1)。Bandshifts发生相似的频率在MSI-H腺瘤不管标记类型而二核苷酸标记是MSI-L腺瘤(图更敏感2)。两个17(11.8%)增生性息肉显示MSI在一个标记(D5S346)。没有被列为MSI-H增生性息肉。24(80%)的30腺瘤MSI透露。八24(33.3%)腺瘤分为MSI-L和16 MSI-H 24例(66.7%)。只有一个MSI-L腺瘤显示bandshifts在多个轨迹(三个二核苷酸位点)。Bandshifts被认为在10/63(16%)在MSI-L腺瘤可评价的位点。相比之下,67/93(72%)在MSI-H腺瘤显示bandshifts可评价的位点。十二个突变编码区域被确定在9个腺瘤从六个HNPCC科目。没有确定编码区基因突变在增生性息肉(表2)。
频率的微卫星标记用来区分MSI-H bandshifts和MSI-L腺瘤。所有标记都敏感MSI-H腺瘤而二核苷酸标记(特别是D5S346 D10S197和D18S58)对MSI-L腺瘤是敏感的。
MSI地位和HNPCC息肉的临床病理特征
腺瘤显示优质发育异常显示MSI-H更频繁地比那些低品位发育不良(确切概率法,p = 0.004)。没有明显关联MSI地位和性别、年龄、位置或腺瘤的大小。九14(64.3%)腺瘤大小小于5毫米,4个9(44.4%)5 - 9毫米,和三个7(42.9%)超过9毫米显示MSI-H(表3)。这两种增生性息肉分为MSI-L从近端结肠获得。一个是5毫米和另一个10毫米大小。
重复序列的突变TGFβRII编码区域,IGF2R,伯灵顿,hMSH3, hMSH6
变异重复序列的编码区域被发现在9个30腺瘤。TGFβRII突变被发现,两个突变IGF2R和伯灵顿,三个突变hMSH3,和四个hMSH6突变。两个腺瘤显示在两个基因突变,一个在IGF2R hMSH6第二hMSH3 hMSH6。所有九个腺瘤与突变编码地区MSI-H和8(88.9%)显示高档发育不良。三个只有2或3毫米大小和6的9(66.7%)小于1厘米。
MSI-H腺瘤分为三个等级地位取决于MSI阳性标记标记之间的比例提供信息PCR产品。六个腺瘤显示MSI标记的40 - 59%,三个在60 - 79%,七80%或更多。四的四个病例显示突变hMSH6显示MSI超过80%的微卫星标记(表4)。有显著关联MSI位点的80%或更多和突变hMSH6 (p = 0.02)。
免疫组织化学
二十四腺瘤可评价的结果与免疫组织化学(图3)。根据微卫星分布状态和表达hMLH1 hMSH2如表所示5。六MSS腺瘤显示hMLH1蛋白质的损失而六七MSI-L腺瘤显示hMLH1损失(一)或hMSH2(5)的蛋白质。结果83年零星和46个家族性结肠直肠癌也表所示5。有15 MSI-L MSI-H腺瘤从主体与一个已知的种系突变。所有15显示的错配修复蛋白损失和生殖系状态一致。
失去hMSH2 (A)和保留hMLH1 (B)在3毫米MSI-H管状腺瘤。这个主题有一个已知的生殖系hMSH2突变。免疫组织化学染色和anti-hMSH2 anti-MLH1。
讨论
在这项研究中,80%的受试者HNPCC结直肠腺瘤显示DNA微卫星不稳定性(MSI)。其他人已经表明,57 - 93%7,16,20.,33HNPCC腺瘤发现MSI。使用26个二核苷酸微卫星标记,雅各布和他的同事们20.发现较低比例的微卫星位点突变被发现在完全良性腺瘤比良性腺瘤病灶的恶性肿瘤。MSI-L阶段似乎是截然不同的,或许早期阶段,主要与二核苷酸不稳定(图2)。是否MSI-H腺瘤必须通过MSI-L阶段还是MSI-H表型可能出现新创是未知的。感兴趣的是,六MSS腺瘤显示hMLH1蛋白质的损失和六个七MSI-L腺瘤显示hMLH1损失(一)或hMSH2(五)蛋白(表5)。损失的海量存储系统(MSS)中腺瘤hMLH1是从hMLH1生殖系突变的主题。没有见过bandshifts六点的9个位点可评价的PCR产品,包括BAT25和BAT40。这些发现与零星的和家庭相比MSS / MSI-L直肠癌(表5)。这将表明MSI-L可能发生的舞台在HNPCC MSI-H进化的地位而MSI-L和MSI-H似乎在零星的大肠癌不同表型。8的稀有MSI-L (MSS)结直肠癌在HNPCC(我们发现两个MSI-L和68 MSI-H癌症与HNPCC-unpublished观察对象)表明,从MSI-L过渡到MSI-H发生在HNPCC腺瘤的阶段。Cawkwell等发现了相似的关联MSI-H地位和损失的DNA错配修复基因表达在结肠直肠癌。34很可能MSI-H腺瘤更容易发展为癌症。这将符合我们的发现一个重大关联MSI-H地位和优质发育不良(p = 0.004)。
值得注意的是11 14(78.6%)腺瘤大小小于5毫米显示MSI MSI-H其中9例(81.9%)。最小的腺瘤与MSI-H在这项研究是2毫米大小和超过50%的腺瘤不到5毫米大小显示高档发育不良。MSI被描述在结直肠肿瘤病灶的微观尺寸(异常地穴焦点)。17开发的多个异常的地穴疫源地MSH2缺陷小鼠的结肠粘膜。35很明显,突变表型(MSI-H以及MSI-L)建立在早期的腺瘤形成HNPCC科目。这也许可以解释的高频率间隔癌症。
TGFβRII36和IGF2R11参与上皮细胞生长而伯灵顿的控制调节细胞凋亡。37这些基因的编码序列和经常重复的大片突变的结肠直肠癌HNPCC或零星MSI-H癌症。10 - 12hMSH3 hMSH6参与DNA修复系统与MSH2蛋白形成复合物。38hMSH3和hMSH6重复序列的编码区域和移码突变已发现在HNPCC癌症显示MSI和零星的癌症。21的种系突变hMSH6也被报道。39突变TGFβRII或伯灵顿在63 - 90%被发现7,16,29日零星的MSI-H癌症和54%19HNPCC癌症。在腺瘤,这些基因的突变的频率是50 - 64%7,16和15%,19分别。这些发现与突变TGFβRII早期腺瘤进展和伯灵顿从腺瘤转变为癌。10,20.
在目前的研究中,九16 MSI-H腺瘤(56%)被发现在一个或多个突变编码区域而没有14 MSI-L或MSS病例显示编码区基因突变。这符合单核苷酸的低频率的不稳定MSI-L病变(无花果2)作为目标包括单核苷酸编码序列运行。有一个(6.3%)TGFβRII和两个突变的突变IGF2R(12.3%)和伯灵顿(12.6%)。3(18.8%)和4(25.0%)的16个MSI-H腺瘤在hMSH3突变和hMSH6,分别。没有腺瘤突变超过两个编码区域。与先前的研究相比16突变的频率编码区域,尤其是TGFβRII很低。IGF2R,这些数据表明,突变的TGFβRII和伯灵顿没有顺序模式但集群内腺瘤显示MSI-H和优质发育不良(表4)。包括CDX-2在内的其他基因13E2F-4,14caspase-5,15和未知基因也可能参与腺瘤进展。
尽管HNPCC患者出现腺瘤以相同的速度为普通人群,HNPCC腺瘤更容易比零星的同行恶性转化。4额外的错配修复基因的体细胞突变可以作为二次调整器和加速MSI和进一步编码区基因突变的积累。21我们的数据表明,hMSH6和hMSH3函数作为次要的调整器。hMSH6突变发生在腺瘤与MSI(表的最高水平4)。然而,突变的可能性MSH6可以附带现象,二次MSI-H建立高水平,不能排除在外。此外,我们的数据表明,突变hMSH3和hMSH6不能唯一的解释从MSI-L过渡到MSI-H至关重要。
尽管对站优势HNPCC结肠癌的MSI阳性零星结肠癌,40我们的数据显示无显著联系腺瘤和MSI(表的位置3)。九腺瘤与编码基因的突变,只有两个是源自于近端结肠。雅各布和他的同事们20.秋山和同事16还表示没有偏爱HNPCC腺瘤。这两种增生性息肉与MSI从近端结肠获得。一个增生性息肉与MSI和TGFβRII突变已被报道。7当前数据没有提供证据表明,零星的增生性息肉在结肠直肠癌的进化中发挥作用在HNPCC但不排除次要角色的向近端息肉。41六MSS腺瘤可能是巧合零星的腺瘤,建议将支持一个时代关系和保留的表达hMLH1和hMSH2五六个腺瘤。事实上,三个MSS腺瘤发生在不到40岁(表3)。看来,甚至在人直肠癌可能偶尔海量存储系统(MSS)中错配修复基因种系突变。14
总之,大多数结直肠腺瘤HNPCC显示低或高水平的DNA微卫星不稳定性和大多数显示hMLH1损失或hMSH2。过渡到优质发育不良与MSI-H表型相关,伴随着TGFβRII编码序列的突变,IGF2R和伯灵顿。MSH3 MSH6可能增加MSI负担,二次调整器。
确认
我们感谢Brenda梅森秘书支持和粘土Winterford摄影援助。由美国国立卫生研究院/格兰特第一U01 CA74778-01(结直肠癌研究协作家庭注册表)。
略语
- HNPCC
- 遗传即结直肠癌
- MSI
- 微卫星不稳定
- 海量存储系统(MSS)中
- 微卫星稳定
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- TBS
- 三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐