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菜单条gydF4y2Ba
上皮细胞增殖gydF4y2Ba
αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体调节人类肠道上皮细胞的增殖gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. 年代SchaakgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  2. 组壁刻证明D库萨克gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  3. C CaylagydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  4. J C DevedjiangydF4y2Ba,gydF4y2Ba
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  7. C丹尼斯gydF4y2Ba
  1. 国家卫生研究所et de la医学研究院,团结INSERM388,路易Bugnard研究所,楚Rangueil, 31403年法国图卢兹Cedex 4gydF4y2Ba
  1. 博士C丹尼斯,INSERM U388,路易Bugnard研究所,楚Rangueil,蝙蝠。31403年法国图卢兹Cedex 4, L3,。电子邮件:gydF4y2Ba丹尼斯在{}rangueil.inserm.frgydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

背景和目的gydF4y2Ba以前的啮齿动物的研究表明,儿茶酚胺刺激α通过激活肠道上皮细胞的增殖gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体位于地下室的细胞。这种效应的发生等待示范在人类和分子机制尚未阐明。在这里,我们研究了α的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂Caco2细胞的克隆表达人类的αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba细胞转染包含α2C10 bicistronic质粒和新霉素磷酸转移酶基因。G418抗性无性系的化验使用放射性配体结合受体表达。受体功能进行测试的能力几个Gi蛋白质和抑制营地生产。有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)磷酸化之后,免疫印迹,和细胞增殖估计通过测量蛋白质和DNA含量。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba永久Caco2细胞转染允许我们获得一个克隆表达α(Caco2-3B)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体密度在一个类似于正常的人类发现肠道上皮细胞。Caco2-3B保留形态学特征和刷状缘酶表达enterocytic分化的特征。受体是耦合Gi2 / Gi3蛋白质及其刺激forskolin诱导营地生产显著减少造成的。治疗的Caco2-3B UK14304(αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂)诱导MAPK的磷酸化状态的迅速增加,细胞外调节蛋白激酶1 (Erk1)和2 (Erk2)。这个事件是完全废除百日咳毒素对细胞和激酶抑制剂的存在(染料木黄酮或PD98059)。但差别是影响蛋白激酶C对这些基因与人体自燃现象瞬态增加酪氨酸磷酸化。最后,持续接触Caco2-3B UK14304导致温和但重要的细胞增殖加速。这些影响在父母的细胞系Caco2。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba本研究的结果支持α的监管作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体在肠道细胞增殖。gydF4y2Ba

  • αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体gydF4y2Ba
  • Caco2gydF4y2Ba
  • 有丝分裂原激活蛋白激酶gydF4y2Ba
  • 肠道细胞增殖gydF4y2Ba

  • 略语gydF4y2Ba

    DMEMgydF4y2Ba
    杜尔贝科修改鹰的媒介gydF4y2Ba
    美国公共电视台gydF4y2Ba
    磷酸缓冲盐gydF4y2Ba
    的兵gydF4y2Ba
    细胞外调节蛋白激酶gydF4y2Ba
    FCSgydF4y2Ba
    胎牛血清gydF4y2Ba
    MAPKgydF4y2Ba
    有丝分裂原激活蛋白激酶gydF4y2Ba
    pCMVgydF4y2Ba
    巨细胞病毒早期启动子/增强子gydF4y2Ba
    EMCVgydF4y2Ba
    脑心肌炎病毒gydF4y2Ba
    PMAgydF4y2Ba
    佛波醇12-myristate 13-acetategydF4y2Ba
    PD98059gydF4y2Ba
    (2)- 2-amino-3-methoxyphenyl 4 h - benzopyran-4-onegydF4y2Ba
    RX821002gydF4y2Ba
    2 -咪唑啉(2-methoxy-1 4-benzodioxan-2-yl) 2gydF4y2Ba
    UK14304gydF4y2Ba
    5-bromo-6 - (2-imidazoline-2-ylamino) -喹喔啉gydF4y2Ba
    sds - pagegydF4y2Ba
    钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳gydF4y2Ba
    PKCgydF4y2Ba
    蛋白激酶CgydF4y2Ba
    BSAgydF4y2Ba
    牛血清白蛋白gydF4y2Ba
    战gydF4y2Ba
    核糖核酸酶保护分析gydF4y2Ba
    德勤gydF4y2Ba
    二硫苏糖醇gydF4y2Ba
    •瑞帕gydF4y2Ba
    无线电免疫沉淀反应gydF4y2Ba
    PVDFgydF4y2Ba
    聚乙二烯二氟化物gydF4y2Ba

    • http://dx.doi.org/10.1136/gut.47.2.242gydF4y2Ba

    来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba

      请求的权限gydF4y2Ba

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      肠道粘膜由去甲神经元广泛内向,和儿茶酚胺调节肠道的几个关键功能障碍。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba其中,修改电解质运动无疑是最好的记录的效果。去甲肾上腺素能促进钠gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,ClgydF4y2Ba−gydF4y2Ba和水吸收在小肠和结肠。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba此外,transepithelial短路电流和净HCO下降gydF4y2Ba3gydF4y2Ba−gydF4y2Ba分泌物是废除。如图所示,用选择性肾上腺素能药物,这antisecretory行动主要是由突触后α介导的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体位于上皮细胞。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba同意这个,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体的αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba亚型识别在肠上皮细胞和colonocytes孤立从不同的物种,包括人类。gydF4y2Ba6 - 9gydF4y2Ba精确的机制,即αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂刺激Na的净吸收gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和ClgydF4y2Ba−gydF4y2Ba仍在争论。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba研究人类colonocytesgydF4y2Ba9 - 11gydF4y2Ba大鼠肠上皮细胞,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba和腺癌HT29细胞线gydF4y2Ba13gydF4y2Ba表明,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体是耦合Gi2 / Gi3蛋白质和刺激引起的抑制细胞内积累阵营——血管活性肠肽或forskolin。因此,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba调节衰减的ClgydF4y2Ba−gydF4y2Ba分泌可能,至少部分,结果从一个直接减少囊性纤维化跨膜电导调节的活动。其他途径独立的阵营也被提出。他们可能包括干扰CagydF4y2Ba+ +gydF4y2Ba依赖机制和/或G蛋白质离子通道的直接耦合。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba

      除了影响transepithelial离子运输、体内的一些研究表明,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体还负责通过儿茶酚胺刺激肠道隐窝细胞增殖。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba到目前为止,α的促有丝分裂的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂曾被观察到在空肠和结肠的老鼠和老鼠。此外,他们发生的分子机制,还有待阐明。假定的α的参与gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体在调节肠道增殖活动的其他物种然而比赛最近的一些发现。首先,在大鼠,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba兔子,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba和人类gydF4y2Ba9gydF4y2Ba肠道粘膜,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体是优先表达在隐窝细胞分裂时,大多数去神经末梢的项目。其次,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体激动剂被发现作为co-mitogens并激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在细胞转染人类α基因编码gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体。gydF4y2Ba17日gydF4y2Ba这个观察,最初仅限于细胞模型的成纤维细胞的起源,最近扩展到上皮细胞。特别是,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体刺激据报道增加MAPK活性和DNA合成好的细胞系,源自负鼠肾近端小管,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba表明这种效果也可能发生在肠上皮细胞的起源。gydF4y2Ba

      本研究的目的是检查假定的生长调节α的属性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体在人类肠道细胞。为此,我们开发了一种克隆来自enterocyte-like分化细胞行Caco2永久表达αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体密度相似,在正常的人类肠道隐窝细胞。的αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体的功能耦合Gi2和/或Gi3在这个模型。刺激激活MAPK和增加引起的细胞生长。进一步使用这个模型也可能有助于调查transepithelial运输的分子机制负责变更αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂。gydF4y2Ba

      材料和方法gydF4y2Ba

      药品和试剂gydF4y2Ba

      (gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] 2 - (2-methoxy-1 4-benzodioxan-2-yl) 2 -咪唑啉(RX821002) (59 Ci /更易)和(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]可乐定(66 Ci /更易)从Amersham购买法玛西亚生物技术(Courtaboeuf、法国),(gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] NADgydF4y2Ba+gydF4y2Ba(800词/更易)来自新英格兰核(美国马萨诸塞州波士顿)和[αgydF4y2Ba32gydF4y2BaP] UTP (ICN 800 Ci /更易)(美国加利福尼亚州科斯塔梅萨)。酚妥拉明是由汽巴捐赠磷(瑞士巴塞尔),和盐酸哌唑嗪和5-bromo-6——(2-imidazoline-2-ylamino)喹喔啉(UK14304)酒石酸辉瑞(三明治,肯特,英国)。Oxymetazoline idazoxan、氯丙嗪、forskolin、百日咳毒素,GppNHp,佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA),和所有其他化学物质来自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。胎牛血清(FCS)和硫酸G418买来Gibco BRL (Cergy Pontoise,法国)。(2)- 2-amino-3-methoxyphenyl 4 h-1-benzopyran-4-one PD98059和染料木黄酮来源于Calbiochem(美国加州拉霍亚)。等工具对营地的决心来自Immunotech (Luminy、法国)。人类αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体基因(α2C10)请提供的R博士J莱夫科维茨(杜克大学、杜伦大学、北卡罗莱纳,美国)。gydF4y2Ba

      表达载体gydF4y2Ba

      使用的表达载体转染Caco2细胞(pα2C10Eneo)是一个bicistronic质粒获得如下。HPalpha2GEN构造,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba它包含α2C10 BamHI-BamHI片段(5.5 kb)的基因,与KpnI和HindIII限制性内切酶消化。相对应的KpnI-HindIII片段核苷酸−1280 / + 1526相对于翻译开始是subcloned pKS + (pBluescriptII k +、Stratagene拉霍亚,加利福尼亚,美国)。这种构造是消化NheIα2C10序列的位置−201和NotI pKS + polylinker。的纯化是克隆插入XbaI bicistronic向量和NotI网站,钢笔。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba结果pα2C10Eneo向量(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)包含一个表达盒由早期人类巨细胞病毒启动子/增强器(pCMV),整个ORF编码为αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体(α2C10),一个内部核糖体进入网站来自脑心肌炎病毒(EMCV)的新霉素磷酸转移酶基因,和一只兔子β球蛋白基因序列含有内含子和一个聚腺苷酸化信号(IVS2-β)。gydF4y2Ba

      Schematic map of the bicistronic expression vector used for transfection of Caco2 cells. The pα2C10Eneo vector is 7.63 kb in size. It contains an expression cassette comprising the human cytomegalovirus early promoter/enhancer (pCMV), the gene encoding human α2A adrenoceptor subtype (α2C10), the internal ribosomal entry site derived from the encephalomyocarditis virus (EMCV), the neomycin phosphotransferase gene (Neo), a rabbit β globin genomic fragment containing sequences for mRNA stabilisation and polyadenylation (IVS2-β).
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1gydF4y2Ba
      图1gydF4y2Ba

      示意图的地图bicistronic表达载体用于Caco2细胞的转染。pα2C10Eneo向量的大小是7.63 kb。它包含一个表达式磁带由早期人类巨细胞病毒启动子/增强器(pCMV),人类α基因编码gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素受体亚型(α2C10),内部核糖体进入位点来自脑心肌炎病毒(EMCV)的新霉素磷酸转移酶基因(Neo),一只兔子β球蛋白基因片段序列包含mRNA稳定和聚腺苷酸化(IVS2-β)。gydF4y2Ba

      细胞培养和转染gydF4y2Ba

      人类结肠恶性腺瘤细胞系,Caco2经常亚文化在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10% FCS和非必需氨基酸。细胞使用磷酸钙转染方法。转染两天后,他们亚文化的存在G418硫酸盐(1毫克/毫升)和抗生素耐药克隆使用克隆缸单独收集。gydF4y2Ba

      ENTEROCYTIC分化和水解酶的活动gydF4y2Ba

      免疫荧光研究进行post-confluent细胞培养合演Transwell过滤器(Dutscher、Brumath、法国)。细胞层paraformaldehyde-30毫米固定与3.7%蔗糖磷酸缓冲盐(PBS) 15分钟和50 mM NH治疗10分钟gydF4y2Ba4gydF4y2BaCl在PBS,以减少非特异性背景。细胞在PBS洋溢着0.05%的皂苷含1%脱脂奶和所有后续步骤进行相同的缓冲区。过滤器被切断,孵化一小时phalloidin-FITC共轭。广泛的洗涤后,样本安装Mowiol和共焦激光显微镜下看(蔡司LSM)。刷状缘相关酶活性测定在整个细胞匀浆。碱性磷酸酶和dipeptidyl肽酶IV化验使用gydF4y2BapgydF4y2Ba-nitrophenyl磷酸盐和氨基乙酰基-gydF4y2BalgydF4y2Ba-proline-4-nitroanilide分别为基质。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba值表示为milliunits每毫克的蛋白质、一个单位被水解的活动每分钟1μmol衬底在37°C。gydF4y2Ba

      RNA提取和战gydF4y2Ba

      细胞总rna分离使用异硫氰酸胍/酚氯仿抽提方法。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba合成的α2C10反义前面描述的。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba核糖核酸酶保护化验(战)进行如下:100μg RNA被添加到30μl杂交缓冲(80% deionised甲酰胺,0.4 M氯化钠,1毫米EDTA, 40毫米管道、pH值6.7)包含过多的(gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] riboprobe标签。样本加热到95°C五分钟,然后立即保持在55°C 14个小时。Non-hybridised探针被添加了0.3毫升的核糖核酸酶(40μg /毫升)和核糖核酸酶T1(2μg /毫升)在300毫米氯化钠,5毫米EDTA, 10毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液(pH值7.5)。两小时后在37°C,消化被停止添加5μl蛋白酶K(10毫克/毫升)和样本进一步孵化15分钟37°C。载体tRNA(10μg)和0.3毫升的解决方案D (4 M异硫氰酸胍,25毫米柠檬酸钠,pH值7.0,0.1米sarkosyl 2-mercaptoethanol和0.5%)被添加到每个管和保护杂交和异丙醇沉淀。RNA丸是用70%乙醇洗净,风干,示例了缓冲区(97% deionised甲酰胺,0.1%钠十二烷基硫酸盐(SDS), 10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值7.0),并运行在5%的丙烯酰胺凝胶含有7 M尿素。48小时的凝胶受到−80°CgydF4y2BaxgydF4y2Ba雷电影放射自显影法。gydF4y2Ba

      受体量化和胃肠道蛋白质鉴定gydF4y2Ba

      受体被量化原油膜制剂使用选择性放射性配体(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] RX821002(αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba拮抗剂)和(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]可乐定(αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂)。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba特定的绑定定义为总之间的差异和非特异性结合测量的10μM酚妥拉明。饱和等温线使用EBDA-LIGAND计算机程序和抑制曲线进行分析。gydF4y2Ba29日gydF4y2BaADP核糖基化进行了如前所述。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba膜(50 - 75μg蛋白质)悬浮在包含1毫米EDTA三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液,1毫米二硫苏糖醇(德勤),和0.05% lubrol (v / v)孵化了60分钟30°C的1μCi [gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] NADgydF4y2Ba+gydF4y2Ba和100 ng preactivated 60μl百日咳毒素在最后一卷。反应混合物中含有70毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(8.0),0.5μM NADgydF4y2Ba+gydF4y2Ba1毫米ATP 10毫米胸苷,EDTA 1毫米,0.1毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba1毫克/毫升gydF4y2BalgydF4y2Ba十四烷基磷脂酰胆碱、10毫米烟酰胺和25毫米德勤。添加2μg反应是停止的牛血清白蛋白(BSA)在0.04% SDS和10%的蛋白质沉淀了70年μl trichloracetic酸。离心后,球团矿与二乙醚洗两次,最后溶解在缓冲Laemmli样本。标签蛋白受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和揭示了放射自显影法。gydF4y2Ba

      营测量gydF4y2Ba

      细胞被分离在PBS包含0.6毫米EDTA和收集的温柔离心(400gydF4y2BaggydF4y2Ba,5分钟)。25毫米的颗粒悬浮在DMEM缓冲玫瑰(pH值7.4)。整除的细胞悬液在200年μl决赛孵化的消息灵通的缓冲DMEM包含0.2毫米IBMX表示浓度的药物测试。15分钟后在37°C,反应停止通过添加1.8毫升的甲醇/甲酸(95/5,v / v)。酒精萃取物是离心机(3000gydF4y2BaggydF4y2Ba,10分钟,4°C)和上层清液蒸发的整除。干燥的样本含有0.1%醋酸缓冲南了gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和营内容由等决定。gydF4y2Ba

      检测磷酸化Erk1 / Erk2和自燃gydF4y2Ba

      细胞被播种在低密度(10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)在100毫米文化菜肴。三天后,他们被孵化呈现静止在FCS自由DMEM 48小时。然后他们被治疗的表示时间的化合物进行测试,与冰冷的PBS快速冲洗,细胞溶解1毫升radio-immunoprecipitation(里帕)缓冲区(10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值7.4,1% Triton X100, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 150毫米氯化钠,2毫米钠原钒酸盐,1毫米phenylmethylsulphonyl氟化物,和0.5μM抑肽酶)。细胞溶解产物用,离心澄清的15分钟15 000gydF4y2BaggydF4y2Ba,储存在−80°C到分析。gydF4y2Ba

      MAPK磷酸化程度的测量在免疫沉淀反应酪氨酰磷酸化蛋白质使用抗体细胞外调节蛋白激酶1 (Erk1)和2 (Erk2)或直接在细胞总蛋白提取使用抗体激活MAPK。酪氨酰磷酸化蛋白在免疫沉淀反应(三个小时在室温下)孵化2毫克的全细胞蛋白质与蛋白质G-sepharose珠子的共轭antiphosphotyrosine单克隆抗体(PY20、转导实验室、肯塔基州的莱克星顿,美国)。珠子被洗了四次里帕,干,悬浮在50μl Laemmli缓冲区,煮五分钟,和离心10分钟15 000gydF4y2BaggydF4y2Ba。蛋白质是由sds - page分离和转移到硝化纤维膜。屁股在TBST孵化了两个小时在室温下(10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液,pH值8.0,150毫米氯化钠,0.2%渐变20)含5%脱脂奶,然后一夜之间在同一个缓冲区包含4°C兔多克隆抗体Erk1和Erk2 (anti-Erk1,摘要;anti-Erk2 1:400;美国加州圣克鲁斯生物技术,圣克鲁斯)。广泛的洗涤后,屁股一小时曾暴露于辣根过氧化物酶共轭驴antirabbit免疫球蛋白。由化学发光免疫反应性的蛋白质是视觉效果(ECL西方墨点法系统,Amersham法玛西亚生物技术,Courtaboeuf,法国)。乐队的强度进行了分析使用ImageQuant软件(分子动力学,森尼维耳市,加州,美国)。在一些实验中,激活Erk1 / Erk2被检测到的兔多克隆抗体识别磷酸化序列MAPK的活动形式(Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)。在这种情况下,总细胞蛋白(30μg)被sds - page分离和转移到Polyscreen /聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(NEN生命科学、比利时)。 Blots were treated for one hour in TBST containing 0.1% BSA and then incubated overnight at 4°C in the same buffer containing antiactive MAPK antibody (1:3000). After extensive washing, bound antibody was detected with the horseradish peroxidase conjugated secondary antibody and revealed by chemiluminescence. The membrane was then stripped of Ig and reprobed using anti-Erk2 antibody to assess equal loading. For determination of Shc phosphorylation, 500 μg of cell proteins were immunoprecipitated using 5 μg of rabbit polyclonal Shc antibody (Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York, USA). After overnight incubation at 4°C, the immunocomplex was precipitated by addition of 50 μl of protein A-agarose beads (Transduction Laboratories, Lexington, Kentucky, USA). After several washes in RIPA, beads were dried, suspended in Laemmli sample buffer, boiled for five minutes, and centrifuged for 10 minutes at 15 000ggydF4y2Ba。受到的蛋白质sds - page, electrotransferred PVDF膜,和探索antiphosphotyrosine-horseradish过氧化物酶共轭单克隆抗体(ECL磷酸化检测系统,Amersham法玛西亚生物技术,Courtaboeuf,法国)。膜被剥夺了搞笑和reprobed使用anti-Shc抗体来评估等于加载。gydF4y2Ba

      细胞增殖实验gydF4y2Ba

      细胞被播种密度的10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在24孔板。播种三天后他们被孵化呈现静止在FCS 48小时的免费培养基。实验开始时更换细胞在DMEM补充0.5% FCS有或没有1μM UK14304。每天都中了。在指定的时间后重新启动细胞增殖,α的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂是通过测量估计总数细胞蛋白质和DNA含量。蛋白质浓度测定使用Coomassie蓝法。gydF4y2Ba31日gydF4y2BaDNA是衡量使用DAPI荧光方法。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba

      统计分析gydF4y2Ba

      结果表示为平均(SEM)的观察表明(n)。使用学生的数据进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba测试和值p < 0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

      结果gydF4y2Ba

      人类α的表达和功能活动gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体在Caco2细胞转染子gydF4y2Ba

      人类结肠恶性腺瘤细胞系Caco2经历enterocytic标准培养条件下分化。这个过程是增长相关。后期的文化、组织细胞分化的单层紧密连接和一个顶端刷状缘,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba并形成穹顶象征transepithelial的传输特性。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba狙击枪和rt - pcr实验以前证明Caco2细胞不会自发地包含αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba为了使这个模型来表达相同的受体亚型正常人类的粘膜,Caco2细胞转染bicistronic构造pα2C10Eneo(无花果gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。20,G418抗性克隆孤立和亚文化,五个是提交第一轮筛选使用狙击枪与特定riboprobe来自α2C10-AR基因。如放射自显影图在图所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba1,五个克隆(克隆)是负面的,而其他人却包含了大量的记录。结合实验使用[gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] RX821002(αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba拮抗剂)从而执行检查受体表达水平。正如所料,没有检测到特定的放射性配体结合在父母的细胞系或克隆1。所有其他克隆显示放射性配体结合位点,但密度从28到300 fmol /毫克的膜蛋白。克隆3 b (Caco2-3B)受体表达水平类似于从正常的人类肠道粘膜上皮细胞,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba被选作进一步的研究。数据从一个典型的饱和绑定Caco2-3B膜实验提出了无花果gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。的数量(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] RX821002结合位点并不是依赖文化的阶段(230(15)和195 (23)fmol /毫克的蛋白质在pre-confluent和post-confluent细胞,分别)和保持稳定连续至少30细胞通道。从相衬和共焦显微镜,Caco2-3B表现出相同的模式enterocytic分化为父母的细胞系。此外,测量细胞提取物的酶的活动表明,刷状缘相关水解酶表达(碱性磷酸酶(12)85亩/毫克蛋白;dipeptidyl肽酶IV, 59(7)亩/毫克蛋白n = 3)。抑制(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] RX821002绑定不同的肾上腺素的化合物表明,育亨宾的Ki值(2.9(1.3)海里),idazoxan(3.7(1.2)海里)、酚妥拉明(9.2(3.1)海里),氯丙嗪(2630(350)海里),和哌唑嗪(2200(420)海里)药理属性匹配预期为αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素受体亚型。gydF4y2Ba

      Screening of positive clones by RPA. RNA from HT29 (used as a positive control), Caco2, and G418 resistant clones were hybridised with [32P]labelled α2C10 probe. Samples were digested with a mixture of RNases A and T1. The resistant hybrids were analysed by electrophoresis. A representative autoradiogram is shown. Lanes P and (−) correspond to the undigested probe and negative control, respectively, carried out on 100 μg of tRNA.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2gydF4y2Ba
      图2gydF4y2Ba

      筛选阳性克隆的狙击枪。从HT29 RNA(作为一个积极的控制),Caco2, G418抗性克隆杂交与(gydF4y2Ba32gydF4y2BaP]标签α2C10调查。样本消化与核糖核酸酶a和T1的混合物。电泳的耐药混合动力车进行分析。一个代表性的放射自显影图显示。车道P和(−)对应于未消化的探针和消极的控制,分别进行100μg tRNA。gydF4y2Ba

      Saturation isotherm of [3H]RX821002 binding to Caco2 and Caco2-3B cell membranes. Membranes prepared from Caco2 and Caco2-3B were incubated in the presence of various concentrations of radioligand. The amount of specifically bound [3H]RX821002 was determined using 10 μM phentolamine to estimate non-specific binding. The data presented are from a typical experiment. The inset shows the corresponding Scatchard plot. Computer assisted analysis of the results from this specific experiment indicated that the Bmax and Kd values of [3H]RX821002 were, respectively, 198 (12) fmol/mg of protein and 1.05 (0.11) nM in membranes from Caco2-3B. No specific binding was detected on membranes from Caco2 cells.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3gydF4y2Ba
      图3gydF4y2Ba

      饱和等温线的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] RX821002绑定Caco2 Caco2-3B细胞膜。膜由Caco2和Caco2-3B孵化在不同浓度的放射性配体的存在。具体的数量约束(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba使用10 H] RX821002决心μM酚妥拉明来估计非特异性结合。是一个典型的实验提供的数据。插图显示相应的Scatchard阴谋。计算机辅助分析的结果从这个特定的实验表明,Bmax和Kd值(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] RX821002分别,198 (12)fmol /毫克的蛋白质和从Caco2-3B 1.05(0.11)纳米膜。没有具体的绑定检测Caco2细胞的细胞膜。gydF4y2Ba

      胃肠道蛋白质耦合的程度进行了分析通过分析受体的能力存在国家高亲和力的受体激动剂(无花果gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。与对手的情况相比,UK14304竞争曲线浅,最好安装在两个网站抑制模型。根据计算机辅助分析的数据从三个独立的实验中,UK14304的Ki值高和低亲和力受体状态,分别为1.05(0.23)和108(30)海里。构象高亲和力的受体激动剂比例代表62人口(6)%的受体。这个分数被废除的Gpp (NH) p / NagydF4y2Ba+gydF4y2Ba或在膜细胞治疗16小时百日咳毒素(250 ng / ml)。此外,(gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] ADP核糖基化证明Caco2-3B表达相同的百日咳毒素敏感的G蛋白的细胞株(无花果gydF4y2Ba4gydF4y2Ba插图)。两个多肽40和41 kDa的分子质量明显标签。免疫印迹与特定的抗体表示对应αi2αi3子单元(没有显示)。提供了进一步证据Gi蛋白质受体耦合的直接研究[gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]可乐定绑定。的确,这(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba122 H)受体激动剂标签(18)fmol网站/毫克的蛋白质具有高亲和力(Kd(0.9) 2.5海里)。正如所料,无显著(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]可乐定绑定中检测出膜从Caco2-3B细胞治疗百日咳毒素。细胞中分离出人类和大鼠结肠隐窝,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba或在人类HT29细胞腺癌行,gydF4y2Ba13gydF4y2BaαgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体是腺苷酸环化酶负耦合。在接下来的一系列的实验我们被问及这种信号转导通路在Caco2-3B也有效。测量细胞内营水平表明Caco2和Caco2-3B细胞同样回应forskolin曝光(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。UK14304、可乐定、或父母(−)肾上腺素无效的细胞系,但明显抑制forskolin诱导营地Caco2-3B积累。值得一提的是,无论是UK14304还是任何其他测试受体激动剂降低基底营地的水平。进一步的实验表明,对forskolin诱导营地UK14304生产的抑制作用是剂量依赖性(ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba(5)12海里)和废除αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba拮抗剂(没有显示)。gydF4y2Ba

      Analysis of receptor coupling and identification of Gi proteins. Caco2-3B cells were or were not treated with 250 ng/ml of pertussis toxin for 16 hours. Cell membrane preparations were incubated in the presence of 3 nM [3H]RX821002 and increasing concentrations of UK14304. The experiments were carried out in the absence or presence of 10 μM GppNHp with 100 mM NaCl. The curves presented are from a specific experiment. Inset: membranes from rat brain, Caco2, and Caco2-3B were ADP ribosylated with pertussis toxin in the presence of [32P]NAD+. The labelled proteins were resolved on SDS-PAGE and autoradiographed as described in materials and methods.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4gydF4y2Ba
      图4gydF4y2Ba

      耦合和胃肠道的识别受体蛋白质的分析。Caco2-3B细胞或没有接受250 ng / ml的百日咳毒素16小时。细胞膜准备孵化在3海里的存在(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] RX821002和UK14304浓度增加。实验进行了在没有或存在10μM GppNHp氯化钠与100毫米。来自一个特定的实验给出的曲线。插图:从老鼠大脑细胞膜,Caco2, Caco2-3B ADP ribosylated百日咳毒素的存在(gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] NADgydF4y2Ba+gydF4y2Ba。标记蛋白被解决在材料与方法中描述的sds - page和放射能照像。gydF4y2Ba

      把这个表:gydF4y2Ba
      表1gydF4y2Ba

      α的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂在基底和forskolin诱导营地积累。完整细胞悬浊液准备从Caco2 Caco2-3B文化菜在无血清培养杜尔贝科修改鹰的介质缓冲和25毫米玫瑰(pH值7.4)包含车辆(基底),1μM UK14304(英国),10μM forskolin(颗),10μM forskolin + 1μM UK14304(颗+英国)10μM forskolin + 10μM可乐定(颗+ clo)或10μM forskolin + 10μM肾上腺素(颗+肾上腺)。营地被放射免疫检定法提取和测量在材料与方法中描述。浓度的阵营表示为nanomoles营地/毫克的细胞蛋白质和好坏(SEM) (n = 8)gydF4y2Ba

      α的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体刺激激活MAPK和细胞增殖gydF4y2Ba

      受体刺激的影响MAPK研究酪氨酸磷酸化蛋白的免疫沉淀反应随后immunodetection anti-Erk1 / Erk2抗体(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。Caco2 Caco2-3B,这些抗体承认两个蛋白质分子质量明显的44和42 kDa。治疗Caco2-3B UK14304导致快速增加的程度的磷酸化MAPK的两种形式。磷酸化早在两分钟后观察治疗,在五分钟,最大,持续至少15分钟。的基础上分析七个独立的实验中,观察到的最大效应五分钟后的接触代表一个双重的磷酸化。无显著变化的磷酸化MAPK在Caco2细胞检测,证明UK14304的影响主要是由于刺激αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体。α的机制,刺激gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体增加MAPK磷酸化被调查直接使用antiactive MAPK抗体总细胞提取物。与anti-Erk抗体在免疫沉淀反应磷蛋白质(如无花果gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),antiactive MAPK抗体显示主要带对应于磷酸化Erk2(参见无花果gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。西方的屁股在无花果gydF4y2Ba6gydF4y2Ba清楚地表明,增加Erk2磷酸化后接触UK14304完全废除的预处理细胞百日咳毒素(250 ng / ml, 16个小时)。因此Gi蛋白的完整性对于α的影响是必要的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂发生。以同样的方式,增加蛋白质酪氨酸激酶的抑制剂,染料木黄酮(25μM),或添加MEK1形式的MAPK激酶的抑制剂,PD98059(50μM),防止UK14304的效果。图中所示gydF4y2Ba7gydF4y2Ba、急性刺激蛋白激酶C (PKC)增加2.5μM PMA五分钟也显著激活MAPK引起的。长期治疗的细胞PMA完全废除任何进一步的回应佛波醇酯,但并不影响UK14304的响应,这表明αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体触发通过一个独立的PKC路径的影响。由几个G蛋白耦合的激活MAPK受体被证明人体自燃现象与磷酸化Rat-1成纤维细胞,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba我们也检查了如果这样的磷酸化发生在αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体刺激Caco2-3B细胞。使用anti-Shc抗体从A431提取准备和Caco2-3B细胞(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)表明,我们的模型主要表达了46和52 kDa的亚型自燃。此外,治疗的细胞1μM UK14304增加磷酸化的两个亚型的自燃引起的。激活后显著与α2分钟的治疗gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂瞬态,降低磷酸化后观察到10分钟。人体自燃现象的时间进程因此磷酸化是兼容激活MAPK的人体自燃现象的前面。gydF4y2Ba

      Effect of UK14304 on mitogen activated protein kinase (MAPK) phosphorylation. Caco2 and Caco2-3B cells were seeded at low density (105 cells/cm2) and grown for three days in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum. Pre-confluent cell layers were then maintained for 48 hours in serum free medium and treated for the indicated time with 1 μM UK14304. Left: tyrosine phosphorylated proteins were immunoprecipitated, separated by SDS-PAGE, and MAPK revealed by immunoblotting with anti-Erk1 and anti-Erk2 antibodies as described in materials and methods. Right: the extent of MAPK phosphorylation is expressed as a per cent of that in control cells (untreated). Results are mean (SEM) (n=3 for Caco2, n=7 for Caco2-3B). Significantly different from untreated cells: *p<0.05, **p<0.02.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5gydF4y2Ba
      图5gydF4y2Ba

      UK14304对有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)磷酸化。Caco2 Caco2-3B细胞被播种在低密度(10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和种植了三天在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清。Pre-confluent细胞层然后保持48小时的无血清培养基和治疗表示时间与1μM UK14304。左:酪氨酸磷酸化蛋白免疫沉淀反应,通过sds - page分离,和MAPK揭示了免疫印迹和anti-Erk1 anti-Erk2抗体中描述的材料和方法。右:MAPK磷酸化程度的表示为百分之一,在控制细胞(治疗)。结果意味着(SEM) (n = 3, Caco2 Caco2-3B n = 7)。从未经处理的细胞明显不同:* * * p < 0.05, p < 0.02。gydF4y2Ba

      Effect of pertussis toxin (PTX), genistein, and PD98059 on mitogen activated protein kinase (MAPK) phosphorylation. Caco2-3B cells were grown and rendered quiescent as indicated in the legend of fig 5. The cells were treated for 16 hours with pertussis toxin (250 ng/ml) or for 30 minutes with either genistein (25 μM) or PD98059 (50 μM). They were then exposed (+) or not (−) to 1 μM UK14304 for five minutes. Top: MAPK phosphorylation was studied using the anti-active MAPK antibody. Bottom: the membrane was stripped of Ig and reprobed with anti-Erk2 antibody to assess equal protein loading.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6gydF4y2Ba
      图6gydF4y2Ba

      百日咳毒素的影响(PTX),染料木素,PD98059对有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)磷酸化。Caco2-3B细胞生长并呈现静止显示在无花果的传说gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。16个小时的细胞治疗百日咳毒素(250 ng / ml)或30分钟高金雀花碱(25μM)或PD98059(50μM)。然后他们被暴露(+)或不(−)1μM UK14304 5分钟。上图:MAPK磷酸化研究使用anti-active MAPK抗体。底部:膜被剥夺了搞笑和reprobed anti-Erk2抗体来评估蛋白质加载。gydF4y2Ba

      Effect of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) on UK14304 induced mitogen activated protein kinase (MAPK) phosphorylation. The Caco2-3B cells were grown and rendered quiescent, as indicated in the legend of fig 5, and treated for 16 hours with 2.5 μM PMA (treated) or vehicle (control). They were then exposed for five minutes to vehicle (−), 2.5 μM PMA (PMA), or 1 μM UK14304 (+). Top: MAPK phosphorylation was studied using the anti-active MAPK antibody. Bottom: the membrane was stripped of Ig and reprobed with anti-Erk2 antibody to assess equal protein loading.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7gydF4y2Ba
      图7gydF4y2Ba

      佛波醇效果12-myristate 13-acetate (PMA) UK14304诱导有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)磷酸化。Caco2-3B细胞生长并呈现静止,表示在图的传说gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和治疗16小时2.5μM PMA(治疗)或车辆(控制)。然后他们被暴露在五分钟车(−),2.5μM PMA (PMA),或1μM UK14304 (+)。上图:MAPK磷酸化研究使用anti-active MAPK抗体。底部:膜被剥夺了搞笑和reprobed anti-Erk2抗体来评估蛋白质加载。gydF4y2Ba

      Identification of Shc isoforms and effect of UK14304 on phosphorylation. Left: identification of the Shc isoforms expressed in Caco2-3B cells. Protein extracts from Caco2-3B and A431 cells (used here as positive control) were subjected to SDS-PAGE and Shc isoforms were revealed by western blot using anti-Shc antibody. Right: UK14304 induced phosphorylation of Shc. The Caco2-3B cells were grown, rendered quiescent as indicated in the legend of fig 5 and then treated for the indicated time with 1 μM UK14304. Shc proteins were immunoprecipitated with anti-Shc antibody and the extent of their phosphorylation estimated by western blot with an antiphosphotyrosine antibody (right upper panel). The membrane was stripped of Ig and reprobed using anti-Shc antibody to assess equal protein loading (right lower panel).
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8gydF4y2Ba
      图8gydF4y2Ba

      人体自燃现象的识别亚型和UK14304对磷酸化的影响。左:Caco2-3B细胞表达的自燃亚型的识别。蛋白质提取物Caco2-3B A431细胞(这里使用积极的控制)受到sds - page和自燃亚型都揭示了使用anti-Shc抗体免疫印迹。右:UK14304诱导人体自燃现象的磷酸化。Caco2-3B细胞生长,使静止的示图的传说gydF4y2Ba5gydF4y2Ba然后接受指定的时间与1μM UK14304。自燃蛋白质与anti-Shc抗体免疫沉淀反应和磷酸化程度的估计与antiphosphotyrosine抗体免疫印迹(右上半部分)。膜被剥夺了搞笑和reprobed使用anti-Shc抗体来评估平等蛋白质加载低(右面板)。gydF4y2Ba

      激活MAPK的通常与细胞增殖有关,我们终于检查α的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体刺激Caco2-3B的增长率。没有影响时发现UK14304测试在无血清或10% FCS的媒介。然而,一个加速扩散进行化验时多次被观察到在含有0.5% FCS的培养基。α的增殖效应gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂是温和但意义重大。估计总细胞蛋白质和DNA含量的测量,它代表了在细胞增殖增加20%(图16天的文化gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。此外,这种效果是完全由于αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体激活,因为它并没有观察到父母的细胞系Caco2(没有显示)。gydF4y2Ba

      Effect of UK14304 on cell growth. Caco2-3B cells were seeded at low density (105 cells/cm2). Three days after seeding, they were rendered quiescent in serum free medium for 48 hours. Cellular growth was then reinitiated in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 0.5% fetal calf serum with or without 1 μM UK14304. Protein content (left) and DNA content (right) per well were determined as described in materials and methods. Data presented are from a typical experiment and the results are mean (SEM) (n=3). Significantly different from untreated cells: *p<0.05, **p<0.01.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图9gydF4y2Ba
      图9gydF4y2Ba

      UK14304对细胞生长的影响。Caco2-3B细胞被播种在低密度(10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。播种三天后,他们呈现静止48小时的无血清培养基。细胞增长然后三周杜尔贝科的修改鹰的媒介(DMEM)补充0.5%胎牛血清有或没有1μM UK14304。蛋白质含量(左)和DNA含量(右)确定每口井中描述的材料和方法。资料来自一个典型的实验和结果意味着(SEM) (n = 3)。从未经处理的细胞明显不同:* * * p < 0.05, p < 0.01。gydF4y2Ba

      讨论gydF4y2Ba

      的αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体调节的生理功能包括神经递质释放,胰岛素分泌,血管收缩,血小板聚集、肾NagydF4y2Ba+gydF4y2Ba再吸收,肠道ClgydF4y2Ba−gydF4y2Ba分泌。gydF4y2Ba37gydF4y2Ba除了这些行动,最近的研究表明,这些受体G蛋白耦合也可以的有丝分裂原激活MAPK通路和行为或co-mitogens转染细胞。gydF4y2Ba17-21gydF4y2Ba后者的效果让人想起前观察表明,政府去甲肾上腺素的啮齿动物激活α通过刺激肠道隐窝细胞扩散gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba尚未发生的促有丝分裂的效应在其他物种等待示范和分子机制还有待阐明。因为它是不可能进行体内研究人类或保持隐窝细胞与正常粘膜在文化、α的假定的行动gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体在转化细胞增殖只能调查。人类结肠腺癌HT29,自发地表达αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体,可能代表了另一种模型方法这个问题。然而,受体表达在这个细胞系增长相关。gydF4y2Ba38gydF4y2Ba更准确地说,受体密度很低在扩散和对数期的增加融合,使HT29不足。绕过这个问题,我们开发了一个模型受体表达独立的文化条件。我们为此目的而保留的宿主细胞是Caco2细胞。这种选择的原因在于,除了扩散研究,这个自发分化模型代表一个宝贵的体外系统调查α的监管效果gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体在肠道离子传输机制。gydF4y2Ba

      Caco2细胞转染给了一个永久的克隆表达α(Caco2-3B)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体的密度类似人类肠道上皮细胞。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba在正常肠上皮细胞或HT29gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba受体是百日咳毒素敏感的G蛋白耦合Gi2和/或Gi3,和刺激引起显著减少forskolin刺激腺苷酸环化酶。接触UK14304诱导增加磷酸化Erk1和Erk2的状态。正如所料,这种效应被添加RX821002(αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba拮抗剂)。这也是观察内源性儿茶酚胺(−)肾上腺素(没有显示)。MAPK磷酸化快速(高峰在5分钟),类似于其他细胞系统发现αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体促有丝分裂的属性。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba先前的研究已经证实,G蛋白耦合机制激活MAPK根据不同受体或受体细胞类型检查。事实上,Erk1/2磷酸化可能由《Gq》或Gi / o和依赖PKC或Ras激活。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba当αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体通过胃肠道刺激PKC途径在人类好的细胞或血小板的依赖,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba当他们增加磷脂酶C活性和细胞内钙gydF4y2Ba+ +gydF4y2Ba在冥界或转染CHO细胞,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba我们调查如果涉及UK14304 PKC激活的影响。短期暴露Caco2-3B细胞PKC激活PMA导致增加Erk的磷酸化。然而,UK14304没有明显的影响经过脱敏的PKC活性的影响。相反,它是由百日咳毒素完全废除了治疗,表明它是完全依赖激活Gi蛋白质。然而,很明显,抑制腺苷酸环化酶不负责α的作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂,因为影响Erk在哪里观察条件下(即仅在存在UK14304)细胞内营水平不变。相比之下,MAPK磷酸化的变化被废除,染料木黄酮和PD98059表明酪氨酸激酶和MEK 1对于UK14304采取行动是必要的。进一步阐明导致MAPK信号通路激活,人体自燃现象的磷酸化是测量。人体自燃现象的两个主要的亚型(46 kDa和52 kDa),在Caco2-3B表达,是暂时性的磷酸化后受体激动剂接触。在转染COS7细胞,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba因此α的可能性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体Caco2-3B刺激一连串的事件包括招聘Gi蛋白质,Gβγ亚基形成Shc-Grb2-SOS介导的复杂,随后激活MEK 1和MAPK。gydF4y2Ba

      最近的一项研究的subclone HT29细胞(HT29-N2)表明,减少MAPK活性中起关键作用的生化和形态分化肠道细胞。gydF4y2Ba45gydF4y2Ba因此可以想象,相反可能适用,激活MAPK的UK14304增强Caco2-3B扩散。事实上,没有刺激的影响观察UK14304扩散进行了测试在高浓度的FCS的存在与否。然而,增长大幅提高发现当细胞被置于中含有微量的生长因子(0.5% FCS)。因此如果αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba静止细胞受体激动剂是低效的,不能认为是本身有丝分裂原,它作用于细胞缓慢增长,因此行为作为co-mitogen Caco2-3B细胞。在这方面,我们的研究结果与发现转染3 t3f442a细胞或细胞中αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂加速增长,即使是在FCS的缺失。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba早些时候,然而,符合观测CCL39细胞转染人类αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba事实上,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂不能刺激成纤维细胞的细胞的增殖时单独测试,但它们确实刺激(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]胸腺嘧啶核苷掺入化验与纤维母细胞生长因子相结合的时候。为什么UK14304不会增加Caco2-3B扩散在无血清培养基还不清楚。很可能激活MAPK不够持久和/或不充分导致退出阶段,进入细胞周期。gydF4y2Ba46gydF4y2Ba它也是值得注意的,在大鼠主动脉平滑肌细胞,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba激活MAPK的αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂与细胞增殖增加无关,而是由于f -肌动蛋白解聚导致细胞迁移。相反,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂被证明促进肌动蛋白聚合作用和细胞在小鼠preadipocytes蔓延。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba在后者情况下,α的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂对细胞粘附与激活RhoA / FAK的途径。gydF4y2Ba49gydF4y2BaCaco2细胞上有趣的是,之前的研究表明,ρ蛋白质机制中发挥着至关重要的作用,生长因子刺激肠道细胞的迁移,从而有助于维护上皮细胞的完整性。gydF4y2Ba50gydF4y2Baα是否的问题gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂也刺激迁移或附件Caco2-3B值得进一步关注。最后,克隆Caco2-3B保留两极分化上皮细胞的形态学特征和未来可能代表一个合适的模型来研究α的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体在transepithelial运输。初步结果表明,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂增加肽转运体PepT1这些细胞的活动,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba建议至少部分可乐亭观察到体内的影响gydF4y2Ba52gydF4y2Ba将直接刺激αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体位于肠道上皮细胞。gydF4y2Ba

      总之,目前的研究表明,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体激活MAPK通路和充当co-mitogens细胞系来源于人类肠道上皮细胞。进一步的研究是必要的澄清的精确分子机制负责这一行动,并评估这些受体的作用在其他上皮功能。然而,与以前的结果,我们的结果支持α的参与gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体在调节肠道细胞增殖。gydF4y2Ba

      确认gydF4y2Ba

      这项工作是支持的生物医学2项目PL963373(欧洲委员会,布鲁塞尔,比利时)和由基金会资助倒拉医学研究院(法国巴黎)。期间参与本研究,JCD是收件人的奖学金基金会易普森(法国巴黎)。我们感谢F Quinchon和E Fonta有用的技术援助。gydF4y2Ba

      略语gydF4y2Ba

      DMEMgydF4y2Ba
      杜尔贝科修改鹰的媒介gydF4y2Ba
      美国公共电视台gydF4y2Ba
      磷酸缓冲盐gydF4y2Ba
      的兵gydF4y2Ba
      细胞外调节蛋白激酶gydF4y2Ba
      FCSgydF4y2Ba
      胎牛血清gydF4y2Ba
      MAPKgydF4y2Ba
      有丝分裂原激活蛋白激酶gydF4y2Ba
      pCMVgydF4y2Ba
      巨细胞病毒早期启动子/增强子gydF4y2Ba
      EMCVgydF4y2Ba
      脑心肌炎病毒gydF4y2Ba
      PMAgydF4y2Ba
      佛波醇12-myristate 13-acetategydF4y2Ba
      PD98059gydF4y2Ba
      (2)- 2-amino-3-methoxyphenyl 4 h - benzopyran-4-onegydF4y2Ba
      RX821002gydF4y2Ba
      2 -咪唑啉(2-methoxy-1 4-benzodioxan-2-yl) 2gydF4y2Ba
      UK14304gydF4y2Ba
      5-bromo-6 - (2-imidazoline-2-ylamino) -喹喔啉gydF4y2Ba
      sds - pagegydF4y2Ba
      钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳gydF4y2Ba
      PKCgydF4y2Ba
      蛋白激酶CgydF4y2Ba
      BSAgydF4y2Ba
      牛血清白蛋白gydF4y2Ba
      战gydF4y2Ba
      核糖核酸酶保护分析gydF4y2Ba
      德勤gydF4y2Ba
      二硫苏糖醇gydF4y2Ba
      •瑞帕gydF4y2Ba
      无线电免疫沉淀反应gydF4y2Ba
      PVDFgydF4y2Ba
      聚乙二烯二氟化物gydF4y2Ba

      引用gydF4y2Ba

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