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癌症
11 q23处改变PPP2R1B基因位于人类结肠直肠癌
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  1. Y高木涉,
  2. M Futamura,
  3. K山口,
  4. 年代青木,
  5. T高桥,
  6. 年代Saji
  1. 第二部手术,岐阜大学医学院Tsukasa-machi、岐阜500 - 8705,日本
  1. 博士Y高木涉。电子邮件:yutakagi在}{emailmsn.com

文摘

背景/目的1998年PPP2R1B基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的亚基被认定为假定的肿瘤抑制基因在肺癌和结肠癌11 q22-24染色体区域。本研究的目的是确定类型的改变主要直肠癌和结肠癌这些改变和临床病理的数据之间的相关性。

方法突变分析PPP2R1B基因序列编码的结合位点C催化亚基(亨廷顿伸长亚基TOR(热)重复11 - 15号)和监管的部分结合位点B亚基进行互补脱氧核糖核酸样本30主结直肠癌标本上使用的组合和相应的正常组织聚合酶链反应和随后的直接DNA测序。

结果五个错义突变检测到了生产氨基酸替换四个结肠癌病例(13.3%;四个30直肠癌):15甘氨酸(GGT)丙氨酸(GCT)和499年亮氨酸(TTA)异亮氨酸(ATA)在相同的情况下,和498年缬氨酸(GTG)谷氨酸(呕吐),500年缬氨酸(GTA)甘氨酸(GGA)365年丝氨酸(TCT)脯氨酸(有条件现金转移支付)。这五个突变,三个(60%)位于热重复13和4个(80%)显示T其它核苷酸替换。此外,一个正常的多态性,478年亮氨酸,被发现。这些突变和临床病理的数据之间不存在相关性。

结论我们的研究结果表明,PPP2R1B基因是11 q23处真正的目标之一,和它的失活参与所有类型的结肠直肠癌的发展。

  • PPP2R1B基因
  • 结肠直肠癌
  • 肿瘤抑制基因
  • 蛋白磷酸酶

  • 略语

    LOH
    杂合性丢失
    RT
    逆转录酶
    聚合酶链反应
    聚合酶链反应
    热
    亨廷顿伸长亚基TOR
    阿拉巴马州
    丙氨酸
    瓦尔
    缬氨酸
    通用电气
    甘氨酸
    Glu
    谷氨酸
    Ile
    异亮氨酸
    低浓缩铀
    亮氨酸
    爵士
    丝氨酸
    箴
    脯氨酸
    PP2A
    蛋白磷酸酶2

    • http://dx.doi.org/10.1136/gut.47.2.268

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      杂合性丢失(LOH)是一种最常见的改变固体肿瘤中发现和识别领域的高水平的遗传物质的损失可能会导致染色体的识别区域窝藏假定的肿瘤抑制基因。

      该地区11 q22-24中度到高频率的LOH结直肠癌(29 - 34%),1,2乳腺癌(40 - 50%),3和肺癌(63%)。4PPP2R1B基因最近被确定为一个候选人在肺癌和结肠癌肿瘤抑制基因的染色体区域。5PPP2R1B基因编码β同种型亚基的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2 (PP2A)。PP2A全酶包括三个子单元:65 kD结构/监管(PR65 / a)单元,一个36 kD催化C (PP2Ac)亚基,和一个变量监管B亚基。6全酶,形成三聚物,调节不同的活动,如分化、增殖,细胞凋亡,通过可逆磷酸化。7PR65 / 15串联单元显示一系列的内部重复,称为热(亨廷顿伸长亚基TOR)的主题。8,9热量重复图案的特点是一对反平行的α螺旋(称为a和B)堆在一系列连续生成定期重复的蛋白质结构,反映了蛋白质序列的内部重复。热主题形式的A和B螺旋凸,凹脸,分别。相邻的平行叠加热重复将相邻intrarepeat形成一个连续脊,提供一个平台,调节蛋白质PR65 /亚基之间的相互作用和PP2Ac和B亚基。8PR65 /一个亚基结合PP2Ac亚基通过热量重复在11 - 15号C终点站10和绑定PR65 /和PP2Ac亚基被废除的序列改变热量重复13 - 15。5

      这里我们报告突变序列的分析功能重要领域(11 - 15号的热量重复),除了热量重复1 - 4和9,在30原发性结肠直肠癌。本研究的目的是确定类型的改变主要结肠癌和直肠癌,并评估PPP2R1B突变和临床病理因素之间的相关性。

      材料和方法

      患者样本

      30主结肠直肠癌和相应的正常组织样本来自18男12女病人,24 - 86岁(平均年龄63岁)诊断在手术过程中在岐阜大学医学院从1997年7月到1997年11月。根据TNM分类(肿瘤、节点和转移),11肿瘤阶段显示四个阶段我,七个阶段II, III期12,和七个四期病例。关于肿瘤站点,升结肠有15例,横结肠两个,五在乙状结肠,八个在直肠。肿瘤病理诊断为直肠癌。在所有情况下的组织样品在液氮快速冻结和储存在−80°C到分析。

      逆转录-聚合酶链反应

      总RNA(2μg)、分离和纯化的标准程序,使用0.3μg随机引物,反向转录20 U的核糖核酸酶抑制剂,10毫米deoxynucleoside三磷酸盐,20 U的逆转录酶(豆类生物医药有限公司,京都,日本)根据制造商的建议的反应条件。聚合酶链反应(PCR)进行的25μl反应混合物包含以下:1μl互补DNA混合,2.5μl 10 X PCR缓冲(50毫米氯化钾,10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8.3,和1.5毫米MgCl2),4.0毫米deoxynucleoside三磷酸腺苷,1.25 U的Taq(豆类)和0.5毫米的PCR引物。引物对PPP2R1B旨在扩大三个区域(图1)。如下:使用的引物对热重复1 - 4,S1 (5′- CAG CAG插科打诨插科打诨AAA棉酚猫G)和AS1 (5′atc CCC行动TGC TAA GCG TTT C)(472个基点);热量重复9 - 12,S2 (5′gcc猫TGA AGA标签AGA广汽C)和AS2 (5′- AGC TCG TTC标签GGC GTA TAC)(445个基点);热量重复12 - 15,S3 (5′-TTA TGT ATG GCT TGG CTC GTG G)和AS3 (5′ttc有条件现金援助有条件现金援助GCT有条件现金援助猫答G)(452个基点)。热循环的反应是程序如下(豆类、PCR热循环仪议员):最初的变性步骤是一分钟94°C,紧随其后的是35周期30秒94°C的变性、退火30秒55°C,一分钟在72°C扩展。最后在72°C扩展为所有PCR反应10分钟。

      Schematic view of PPP2R1B cDNAs. Three sets of polymerase chain reaction primers were used to amplify a portion of the gene. Numbers indicate the internal repeats (HEAT repeats) and shaded numbers indicate the sequence of binding sites for the PP2Ac subunit on the PR65/A subunit.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
      图1

      示意图的PPP2R1B互补。三套聚合酶链反应引物被用来放大部分基因。数据显示内部重复(热量重复)和阴影数字显示的结合位点序列PP2Ac PR65 /亚基单元。

      序列分析突变

      PCR扩增产品electrophoretically 2%琼脂糖凝胶上分离。乐队合适大小的凝胶被削减,纯化基因第三清洁设备(美国加州Bio101, Vista),并使用ABI测序棱镜染料终止循环测序工具包(美国加州福斯特城优秀的,),ABI棱镜377自动DNA测序器(美国加州福斯特城ABI,)。序列从肿瘤病例一致并与正常PPP2R1B序列。更改时发现他们被重复PCR和测序证实新产品放大。

      临床病理的数据

      数据,包括性别、年龄、疾病的阶段,组织病理学结果可以从临床和病理记录。临床病理分期是根据UICC分期系统。

      统计分析

      费雪的精确概率检验被用于统计分析的检测突变和传统的临床病理参数之间的关系。p值< 0.05被认为是显示统计学意义。

      结果

      DNA测序PCR产品

      每个热PPP2R1B重复片段的基因被成功放大通过逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),所有30原发性结直肠癌标本和相应的正常结直肠组织。序列分析表明,不同PPP2R1B基因改变中只有四个结肠癌标本并不是相应的正常结肠组织(无花果2)。这四个案例显示五个错义突变预测导致氨基酸的变化。案例2号携带了甘氨酸(g)丙氨酸(Ala) (GGT GCT)在密码子15 -亮氨酸(亮氨酸)异亮氨酸(Ile) (TTA ATA)在密码子499。病例号11、22日和25日有一个缬氨酸(Val)现在谷氨酸(Glu) (GTG GAG)在498密码子,Val, g (GGA GTA)在500密码子,和丝氨酸(Ser)脯氨酸(Pro)有条件现金转移支付(TCT)在密码子365年,分别为(表1)。一个C G颠换1453核苷酸位置(热量重复12)没有氨基酸替换,478年CTG列伊(CTC),肿瘤被发现的10号,16,18、19日,23日,26日和27日(无花果3)。

      DNA sequence electropherograms showing the PPP2R1B gene mutations identified in patients with colorectal cancer. Individual electropherograms for the tumour are shown in the upper panels and the corresponding normal tissues (controls) are shown in the lower panels. The relevant nucleotide is indicated by an arrow.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
      图2

      DNA序列重复显示PPP2R1B基因突变在大肠癌患者。重复的肿瘤上所示面板和相应的正常组织(控制)较低的面板所示。相关的核苷酸由一个箭头表示。

      把这个表:
      表1

      结肠直肠癌PPP2R1B序列变化

      DNA sequence showing a single base substitution without amino acid substitution of the PPP2R1B gene. The consensus sequence is shown in the upper panel and an identified substitution is shown in the lower panel.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
      图3

      DNA序列显示单个碱基替换没有PPP2R1B基因的氨基酸替换。共识序列上所示面板和一个确定替换下面板所示。

      突变之间的相关性和CLINICOPATHLOGICAL状态

      没有明显关联突变和年龄、性别、病理因素(组织学类型、侵入深度、淋巴结转移、阶段)或肿瘤站点(表2)。

      把这个表:
      表2

      患者的临床和病理特征

      讨论

      的五个突变在目前的分析,发现三个(60%)发生连续热重复13。11 - 15号的热量重复被发现参与PP2Ac亚基的结合位点,10和另外两个实验表明,PP2Ac亚基与PR65 /亚基被废除的交互序列改变的热量重复13 - 15。5,12此外,三分之一的突变,498年Val Glu,改变从疏水亲水氨基酸在高度保守的疏水残基,脊内高度保守的残留物(无花果4)。的可能性,由于一个或多个突变,一个高度保守的区域PR65 /亚基的必要形式功能与PP2Ac三聚物,应考虑监管B亚基可能会受到损害。PP2A的角色全酶形成三聚物使其必不可少的多样化的活动:downregulation的有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)级联、细胞周期检查点控制,13和核抑制端粒酶活性表达情况。14这些发现支持的重要参与PPP2R1B结直肠的突变致癌作用。有趣的是,五个碱基对的替换,4例(80%)显示胸腺嘧啶核苷酸替换;在此前的一项研究中所有突变检测结肠癌胸腺嘧啶胞嘧啶,5和胸腺嘧啶其它核苷酸替换的频率远高于p53(6.3%)和APC突变(1.1%)之前报道在结肠直肠癌。15这些发现表明,可能存在一种机制或因素导致PPP2R1B不同于导致p53突变和/或APC突变在结肠直肠癌。此外,目前的研究表明一个C G颠换没有热量重复12中氨基酸替换,478年低浓缩铀,结肠直肠癌和一些正常结直肠组织。一种解释可能是单一的C G颠换密码子478是一个正常的多态性(图3)。

      Multiple sequence alignment of HEAT motif sequences and location of the mutations and polymorphism. Boxed amino acids represent highly conserved residues and shaded amino acids indicate hydrophobic residues. Amino acids underlined are mutated except for L ( 478Leu ) in HEAT repeat 12.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
      图4

      多序列比对的热主题序列和位置的突变和多态性。盒装代表高度保守的氨基酸残基,阴影表明疏水氨基酸残基。氨基酸强调突变除了L (478年亮氨酸)热量重复12。

      澄清这些突变的相关临床病理因素,每个类别的突变进行分析根据临床病理的因素。之间没有显著相关的任何PPP2R1B突变检测在当前分析和临床病理的因素。这一发现与组合之前的两项研究的结果是一致的:肿瘤PPP2R1B变化揭示了高频的LOH 11号染色体上q23处5之间也没有联系LOH 11号染色体上q23处和临床数据(患者性别、年龄、肿瘤站点或公爵”阶段)。1,2然而,由于小数量的肿瘤的突变,不能得出明确的结论。

      比较温和的频率(29 - 34%)11 q23处LOH1,2低频率的突变在目前的研究中发现,以及之前的研究5建议以下。显微解剖技术紧随其后的是直接序列分析可能显示PPP2R1B基因的突变频率高。除了PPP2R1B基因,可能有另一个基因或基因11 q23处结肠直肠癌的发展。到目前为止,多个基因参与肿瘤发生在11 q23-24已报告,如ATM (ataxia-telangiectasia障碍基因q23.1 11点),1611 q23处MLL1(基因经常重新安排在急性白血病),17DDX10(假定的RNA解旋酶基因在11 q23.1),18LOH112CR2A (11 q23处潜在的肿瘤抑制基因),19Chk1(晚上11抓起一个基因编码一种蛋白质激酶所需的DNA损伤检查点功能),20.和APOC3 (11 q23处载脂蛋白颈- 3)。21最近,王先生和他的同事们22第二个肿瘤抑制基因参与报道肺癌PPP2R1B位于端粒。据我们所知,这些基因突变在人类结肠直肠癌尚未确定。进一步调查的染色体区域11 q23处可能导致分子机制的理解和说明是结直肠癌的病因学。

      略语

      LOH
      杂合性丢失
      RT
      逆转录酶
      聚合酶链反应
      聚合酶链反应
      热
      亨廷顿伸长亚基TOR
      阿拉巴马州
      丙氨酸
      瓦尔
      缬氨酸
      通用电气
      甘氨酸
      Glu
      谷氨酸
      Ile
      异亮氨酸
      低浓缩铀
      亮氨酸
      爵士
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      PP2A
      蛋白磷酸酶2

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