条文本gydF4y2Ba
文摘gydF4y2Ba
背景gydF4y2Ba瘦素是一种重要的监管机构的食物摄入和能量消耗。它最初被认为是表示只在和由脂肪细胞分泌的。最近,在其他组织瘦素表达还指出,包括鼠胃粘膜。瘦素和瘦素受体表达的信息在人类胃缺乏。gydF4y2Ba
目的gydF4y2Ba探讨瘦素及其相应受体的表达在人类胃上皮细胞。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba胃底和窦的胃粘膜活检,小学文化的人胃上皮细胞,和人类胃癌细胞株AGS筛选不同瘦素和瘦素受体的表达同种型mRNA的反向transcriptase-polymerase连锁反应。免疫组织化学进行了本地化的瘦素和瘦素受体蛋白在胃粘膜。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba信使rna的瘦素及其四个受体亚型(huOB-R长受体同种型;huB219.1-3在短时间内检测到受体亚型)胃粘膜活检,人类胃上皮细胞培养,胃癌细胞。免疫组织化学显示,首席以及壁细胞瘦素和瘦素受体的活性。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba瘦素和瘦素受体表达在人类胃粘膜。这些发现表明旁分泌和自分泌瘦素对胃上皮细胞功能的影响。gydF4y2Ba
- 瘦素gydF4y2Ba
- 瘦素受体亚型gydF4y2Ba
- 免疫组织化学gydF4y2Ba
- 胃粘膜gydF4y2Ba
略语gydF4y2Ba
- FITCgydF4y2Ba
- 异硫氰酸荧光素gydF4y2Ba
- huOB-RgydF4y2Ba
- 人类长瘦素受体同种型gydF4y2Ba
- huB219.1-huB219.3gydF4y2Ba
- 人类短暂的瘦素受体亚型gydF4y2Ba
- rt - pcrgydF4y2Ba
- 反向transcriptase-polymerase连锁反应gydF4y2Ba
- BSAgydF4y2Ba
- 牛血清白蛋白gydF4y2Ba
来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba
瘦素的产品gydF4y2Ba肥胖gydF4y2Ba基因,被张确认gydF4y2Ba等gydF4y2Ba在1994年。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba已知167氨基酸cytokine-like肽调节食物摄入量和能量消耗与下丘脑中的特定受体通过交互。确定其相应的受体是通过一个表达式由塔尔塔利亚克隆策略gydF4y2Ba等gydF4y2Ba在1995年。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba最初认为是专门表示由脂肪细胞分泌,瘦素表达最近被发现在许多额外的组织,包括胎盘,乳腺上皮细胞,肝星状细胞,分化转化研究gydF4y2Ba3 - 5gydF4y2Ba进一步发现,瘦素可能角色(也就是说,在增殖和分化的刺激造血作用,在控制生殖状态,和以促进血管生成)。gydF4y2Ba6日至14日gydF4y2Ba1998年,BadogydF4y2Ba等gydF4y2Ba在大鼠胃上皮发现瘦素表达gydF4y2Ba15gydF4y2Ba并假定瘦素系统可能参与缩胆囊素介导的规定控制食物摄入量。gydF4y2Ba
瘦素受体的测序分析显示一个类的跨膜受体细胞因子受体家族,gp130受体的近亲,g - csf受体,白血病抑制因子受体。gydF4y2Ba16日至18日gydF4y2Ba互补脱氧核糖核酸数据库暴露的进一步筛选和分析四个人类受体亚型,包括一个长形式的胞内域303个氨基酸,含有序列信号转导功能,和三个短形式,起源于替代C终端编码外显子RNA拼接。此外,记录缺失跨膜域显示一种可溶性受体的存在。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba
分析组织瘦素受体的分布mRNA在啮齿动物展示了高水平在脉络丛,肺,肾,除了有点低水平在几乎所有的组织。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba进一步的mRNA的调查表明,短受体亚型比长同种型丰富得多。没有公布的数据是可用的瘦素和瘦素受体表达在人类胃,因此我们试图确定相应如果瘦素及其受体表达在人类胃。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
人类胃粘膜活检gydF4y2Ba
胃底和窦的粘膜的样本来自受试者在组织学验证正常胃粘膜接受胃镜检查胃肠道症状的评估。所有患者知情同意。检查样品在液氮快速冻结对RNA的提取和制备低温恒温器部分使用Tissue-Tek嵌入,或在4%福尔马林固定石蜡包埋。gydF4y2Ba
人类胃上皮细胞的分离gydF4y2Ba
人胃上皮细胞在胃胃组织标本中分离获得手术如前所述。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba从每个病人获得知情同意,根据修改后的版本的《赫尔辛基宣言》。此外,这项研究是经当地伦理委员会批准的Medizinische Hochschule汉诺威。手术标本(3 - 10 g粘膜湿质量)被手术切除后立即从宏观上影响胃的一部分,放置在25毫升中等我,包含70更易/ l氯化钠,20 l NaHCO更易gydF4y2Ba3gydF4y2Ba1.5更易/ l NagydF4y2Ba2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba1.5,5 l更易与氯化钾,更易与l MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba1 l CaCl更易gydF4y2Ba2gydF4y2Ba11更易与l葡萄糖,和50更易与l消息灵通的。胃粘膜被刮掉,切成小块,悬浮在媒介即粘膜材料离心机(200gydF4y2BaggydF4y2Ba在40毫升,5分钟)和resuspended中等我补充胶原酶(从40毫克gydF4y2Bahistolyticum梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba;勃林格曼海姆,德国曼海姆)。七分钟的暂停是preincubated 37°C时搅拌。暂停沉淀(200gydF4y2BaggydF4y2Ba在40毫升,8分钟)和孵化中我用24毫克的链霉蛋白酶(从补充gydF4y2Ba链霉菌属将gydF4y2Ba;勃林格曼海姆),40毫克的胶原酶,20毫克的透明质酸酶(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国),和0.2%的牛血清白蛋白(BSA)。酶消化了20分钟后,细胞通过尼龙过滤布(60μm),和洗了三次中我和0.2% BSA补充。孤立的细胞resuspended RPMI 1640中(德国卡尔斯鲁厄Gibco)。细胞的数量和活力测定台盼蓝排斥(0.04%台盼蓝;Gibco)。gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
人胃上皮细胞在鼠尾胶原涂层孵化250毫升塑料水瓶(格林尼,Nurtingen,德国)。大约10×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba每250毫升瓶细胞使用包含RPMI 1640补充10%热灭活胎牛血清,庆大霉素(100μg /毫升),青霉素(100国际单位/毫升)和两性霉素B(2.5μg /毫升)。烧瓶孵化在37°C在空气中富含5%的股份有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在100%湿度。除了胃上皮细胞的主要文化,类似的研究进行使用人类胃癌细胞株AGS(写明ATCC)。细胞培养条件相同的作为主要文化胃上皮细胞的描述,除了两性霉素B的使用。gydF4y2Ba
RNA隔离gydF4y2Ba
总RNA提取(i) 2 - 4天的胃上皮细胞主要文化孵化250毫升塑料水瓶,(2)一个支流AGS细胞单层,和(3)人类胃粘膜活检样本使用商业RNA隔离设备(试剂盒RNeasy、希尔登,德国)。此外,RNA是人类脂肪组织提取得到的大网膜在胃手术以及人类胎盘产后立即获得。RNA从脂肪组织和胎盘被用作积极控制瘦素和瘦素受体的表达。gydF4y2Ba
反向TRANSCRIPTASE-POLYMERASE连锁反应(rt - pcr)gydF4y2Ba
5μg总RNA的转录的互补使用200 U(上标RTase(生活技术,卡尔斯鲁厄,德国),5 nmol核苷酸(dATP、dTTP dCTP, dGTP), 10 pmol益生元(dT)gydF4y2Ba12 - 18gydF4y2Ba(法玛西亚,弗莱堡,德国),0.2μmol二硫苏糖醇,2μl 10×反应缓冲(生命技术),20 U RNasin (Promega,曼海姆,德国)和蒸馏,去离子水在20μl反应体积。反应混合物在37°C孵化为60分钟,然后终止通过加热五分钟在90°C。总共500 ng的cDNA使用PCR反应。PCR反应混合物(50μl最终体积)包含:20更易与l盐酸三(pH值8.0),50 l更易与氯化钾,1.5 l MgCl更易gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,更易与0.2 l四种核苷酸,每个引物0.25μmol / l, 2.5 UgydF4y2BaTaqgydF4y2Ba聚合酶(技术)。反应混合物在热循环(孵化Robocycler梯度96;美国加州拉霍亚,Stratagene) 35周期在下列条件下(变性、退火、延伸):94°C的30秒,60°C 30秒,一分钟和72°C,紧随其后的是10分钟72°C。gydF4y2Ba
寡核苷酸引物配对表列出用于这项研究gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。瘦素具体设计引物对使用软件Primer3 (gydF4y2Bahttp://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3gydF4y2Ba)。寡核苷酸的瘦素受体亚型前面描述的gydF4y2Ba22gydF4y2Ba确定了长huOb-R受体对碘氧基苯甲醚和三个短受体亚型huB219.1-huB219.3。引物对普遍可以检测所有亚型。PCR在1.8%琼脂糖凝胶电泳分离的产品与溴化乙锭染色。放大的特异性PCR限制性内切酶分析证实了产品。gydF4y2Ba
免疫组织化学gydF4y2Ba
石蜡嵌入材料用于瘦素和瘦素受体的过氧化物酶染色,而低温恒温器部分被用于免疫组织化学染色的两倍。低温恒温器部分(7μm)被固定在丙酮10分钟和加工为石蜡部分描述。部分石蜡嵌入式胃粘膜活检(4μm) deparaffinised在二甲苯和水化前分析。内源性过氧化物酶用3%的过氧化氢水就熄了10分钟。30分钟的幻灯片被封锁了磷酸缓冲盐补充BSA为1%。阻塞之后,一夜之间在4°C孵化主要抗体稀释1:75发现瘦素(Ob-A20 sc - 842,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,加利福尼亚,美国),1:10 0稀释对瘦素受体(Ob-R h - 300 sc - 8325, Ob-R M-18 sc - 1834和Ob-R酮- sc - 8391,圣克鲁斯生物技术),和1:125稀释胃蛋白酶原的检测(所提供的多克隆抗体,在兔子长大,Foltmann教授,哥本哈根大学,哥本哈根,丹麦)。本地化主要抗体绑定使用生物素化的二次抗体检测,链霉亲和素结合辣根过氧化物酶,3-amino-9-ethylcarbazol衬底,包含在Histostain-Plus工具包(酶实验室,Inc .,旧金山,加利福尼亚,美国)。山羊的反人类的瘦素受体抗体,一头驴antigoat生物素化的二次抗体(Dianova,汉堡,德国)使用稀释1:200检测主要抗体本地化。瘦素和瘦素受体的阻断肽抗体(圣克鲁斯生物技术)添加10μg / ml主要抗体孵化期间的直接竞争控制抗体特异性。遗漏的主要抗体没有表现出免疫染色。gydF4y2Ba
胃上皮细胞类型识别的瘦素和瘦素受体的表达,使用胃蛋白酶原抗体进行免疫荧光双标记(1:125)、壁细胞(人血清的antiparietal细胞阳性病人(接触),胃粘蛋白(兔多克隆抗体h-MG(1:20 00),请提供1月德克,鹿特丹,荷兰),或chromogranin (1:125 Dako,德国汉堡)和相关的瘦素和瘦素受体的抗体。本地化主要抗体绑定是探测到物种的特定的异硫氰酸荧光素(FITC)共轭二次抗体(1:200)和罗丹明共轭二次抗体(1:200)物种的不同。瘦素在壁细胞的识别,过氧化物酶和FITC染色使用。使用荧光显微镜的细胞进行分析(奥林巴斯BX 60)。确定数量的瘦素和瘦素受体免疫反应性的细胞在胃底和窦的标本相同的主题和表示为一个百分比的胃腺体的上皮细胞总数。至少400个细胞在随机选择的字段数。数据意味着(SD)从三个不同的主题。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
mRNA的表达瘦素在人类胃粘膜gydF4y2Ba
的表达gydF4y2Ba肥胖gydF4y2Ba基因(瘦素)在人类胃被rt - pcr分析使用特定的引物(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)推导出的克隆人类gydF4y2Ba肥胖gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba23gydF4y2Ba产生220个基点PCR产品(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在胃粘膜活检,发现瘦素mRNA表达主要培养胃上皮细胞,和人类胃癌细胞株AGS。确认特异性扩增的PCR产物,限制性内切酶分析使用BsaI表现出预期的164个基点的碎片和56个基点(数据未显示)。gydF4y2Ba
mRNA的表达瘦素受体亚型在人胃黏膜gydF4y2Ba
胃粘膜和胃上皮细胞培养筛选已确定瘦素受体亚型的表达。所有胃标本展示了三个短受体亚型huB219.1-huB219.3以及长huOB-R受体对碘氧基苯甲醚(无花果gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。虽然PCR不是基因表达的定量测定,矮瘦素受体同种型的PCR产物huB219.2表现出较弱的信号与其他亚型相比,特别是在主要培养的上皮细胞。gydF4y2Ba
瘦素蛋白表达在人类胃粘膜gydF4y2Ba
使用亲和纯化兔多克隆抗体的抗原决定基映射提出反对的羧基端gydF4y2Ba肥胖gydF4y2Ba基因产物(瘦素),强大的免疫染色的下半部分胃腺体(无花果gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。因为这个网站类似的胃蛋白酶原分泌首席细胞执行首席细胞组织化学染色,在连续相邻的部分(图gydF4y2Ba3gydF4y2BaB)。这些研究证实胃蛋白酶原免疫反应性的细胞也有瘦素免疫反应性(无花果gydF4y2Ba3gydF4y2BaC, D)。然而,瘦素免疫反应性还发现在胃蛋白酶原-上皮细胞但程度不一样。这些细胞被想起的站点和形态学壁细胞,因此免疫荧光双标记和FITC共轭antiparietal细胞抗体进行披露coexpression瘦素和壁细胞抗原在同一个细胞(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。粘液细胞表面并没有显示瘦素的免疫染色。胃底和窦的粘膜显示类似腺分布的瘦素免疫反应性,但瘦素阳性细胞的百分比较高基底的地区(31(6)%)比腔(10 (1)%)。gydF4y2Ba
瘦素受体蛋白表达在人类胃粘膜gydF4y2Ba
瘦素受体的免疫反应性主要被探测到的midregion和胃下部腺体使用与绑定特异性多克隆抗体,守恒的胞内区域的氨基酸序列映射(氨基酸879 - 896,Ob-R M-18)。这种染色模式与瘦素免疫反应性。免疫荧光双重染色法确定了首席和壁细胞瘦素受体免疫反应性的(无花果gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。与绑定特异性抗体在氨基末端氨基酸序列映射(h - 300细胞外地区)M-18抗体染色显示出类似的模式。瘦素受体免疫反应性变化在不同细胞相同的基底的地区的人口和高(28(3)%)与腔(9 (1)%)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在这项研究中,我们表明,瘦素和其相应的受体亚型表达在人类胃。此外,我们发现,瘦素及其受体在胃上皮局部腺体。有趣的是,瘦素和瘦素受体位于首席和壁细胞。虽然它不是当前研究的目的提供细胞瘦素的定量分析内容,我们的免疫组织化学数据表明细胞瘦素的主要来源。gydF4y2Ba
使用rt - pcr过程,我们发现所有四个接头变种人的瘦素受体已被确认到目前为止,包括三个短受体亚型(huB219.1-huB219.3)以及长同种型受体(huOb-R)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba我瘦素受体类的同源性细胞因子受体可能对信号转导途径提供重要的线索。JAK / STAT信号通路级联已被确定为一个长形式的瘦素受体。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba相比之下,简短的瘦素受体亚型在统计分析发现是不活跃的,因此可能没有信号转导功能。然而,最近的研究显示,一个简短的瘦素受体也能导致信号转导。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba此外,所有的人类和小鼠短受体亚型包含一盒1序列的保守P×JAK2绑定和胞内信号的关键。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba因此不同的瘦素受体亚型的表达在人类胃可能表明不同组织瘦素的生理和病理生理作用。gydF4y2Ba
虽然瘦素的生理行为假设未知,最近发现在小鼠巨噬细胞显示瘦素刺激促炎的免疫反应gydF4y2Ba27gydF4y2Ba这表明瘦素可能在胃粘膜炎症中发挥作用。事实上,我们的患者的初步数据gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba胃炎表明瘦素表达的调节gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba感染(未发表的数据)。瘦素可能进一步角色在上皮细胞的生理机能,包括影响胃蛋白酶原的监管和/或胃酸分泌。支持这个假说的coexpression瘦素和瘦素受体在胃癌细胞和壁细胞。然而,胃瘦素可能不仅当地的旁分泌作用而且内分泌行动通过门静脉排水和通过刺激迷走神经传入中枢神经系统的影响。gydF4y2Ba28 - 30gydF4y2Ba
总之,我们已经证明了瘦素和瘦素受体表达的首席和壁细胞在人类胃。Coexpression相应的瘦素和瘦素受体表明胃瘦素可能在人类胃旁分泌和自分泌功能。瘦素系统迄今未知的生理作用在人类胃需要在未来的研究中定义。gydF4y2Ba
略语gydF4y2Ba
- FITCgydF4y2Ba
- 异硫氰酸荧光素gydF4y2Ba
- huOB-RgydF4y2Ba
- 人类长瘦素受体同种型gydF4y2Ba
- huB219.1-huB219.3gydF4y2Ba
- 人类短暂的瘦素受体亚型gydF4y2Ba
- rt - pcrgydF4y2Ba
- 反向transcriptase-polymerase连锁反应gydF4y2Ba
- BSAgydF4y2Ba
- 牛血清白蛋白gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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