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生长因子
表皮生长因子可减少硫代乙酰胺引起的多器官衰竭
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  1. 我是卡巴列罗一个，
  2. J Berlanga一个，
  3. D拉米雷斯b，
  4. P Lopez-Saura一个，
  5. R Gozalezb，
  6. D·N·弗洛伊德c，
  7. T Marchbankd，
  8. R J普莱福德d
  1. 一个古巴哈瓦那国家科学研究中心遗传工程和生物技术中心b古巴哈瓦那国家科学研究中心生物化学系，c英国莱斯特市莱斯特总医院消化内科d英国伦敦ICSM消化病学科
  1. R J Playford教授，帝国理工学院医学院消化内科，汉默史密斯医院校区，伦敦W12 0NN。r.playford在{}ic.ac.uk

摘要

背景多器官衰竭是一种严重危及生命的状态，目前的治疗方法是次优的。表皮生长因子(EGF)在体外和体内模型中是一种有效的修复刺激剂。因此，我们研究了它在降低有毒物质硫代乙酰胺(TAA)引起的死亡率和损伤方面的潜在有益作用。

方法小鼠(每组20只)禁食过夜后腹腔注射人重组EGF(10或30 μg/kg)或生理盐水(对照组)。在EGF前30分钟或后30分钟，所有动物都接受TAA (40 mg/kg腹腔注射)。24小时后，杀死幸存的动物，收集组织，评估器官损伤程度。

结果50%(10/20)的对照组动物在第一个24小时内死亡。无论是TAA前还是TAA后，高剂量的EGF几乎完全阻止了死亡率(p<0.01)，而低剂量的EGF则降低了约50%。在对照组动物中，整个长度的空肠和回肠坏死伴有或不伴有粘膜剥蚀。相反，EGF治疗组坏死仅占总长度的10-20% (p均<0.01)v控制)。对照组动物表现出明显的肾小球簇塌缩、间质出血和血浆肌酐水平升高。EGF (30 μg/kg;p < 0.01)。所有组的肝脏组织学变化(小叶中心坏死)和丙氨酸转氨酶水平(增加10倍)相似。

结论尽管EGF不能预防与TAA相关的肝毒性，但它降低了死亡率、肾损伤和胃肠道损伤。这些研究提供了初步证据，表明EGF可能是预防和/或治疗多器官衰竭的一种新方法。

  • 胃肠道损伤
  • 肾毒性
  • 肝损伤

  • 本文中使用的缩写

    表皮生长因子
    表皮生长因子
    hrEGF
    人重组表皮生长因子
    TAA
    硫代乙酰胺
    财政部
    多器官衰竭
    ALAT
    丙氨酸转氨酶

    • http://dx.doi.org/10.1136/gut.48.1.34

    数据来自Altmetric.com

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      多器官衰竭(MOF)是一种严重的危及生命的疾病，通常由严重创伤、烧伤或暴发性感染引起。无论初始事件是什么，一旦确定，MOF的死亡率就很高(高达80%)。1这种情况下的病理生理机制尚不清楚，但重要的致病因素可能包括缺氧、肠通透性增加、细菌易位、内毒素血症和不受控制的全身炎症反应(见Nguyen和同事)2)．

      降低患者患MOF风险的新疗法具有直接的临床潜力。许多在住院期间发展到MOF的患者可以在早期(通常在入院时)根据初始损伤的严重程度(例如烧伤患者受影响的皮肤表面积百分比)进行识别。因此，有一个潜在的治疗窗口，如表皮生长因子(EGF)可以在完全MOF综合征的发展之前使用。

      硫代乙酰胺(Thioacetamide, TAA)作为一种肝毒素被广泛应用于急性和慢性肝损伤动物模型的建立。3.，4其有害影响部分归因于TAA的生物转化为TAA磺酮和亚砜形式，这些形式与蛋白质广泛反应，导致蛋白质变性。5，6虽然研究较少，但给药TAA也会导致肾脏损伤(特别是近端小管)7)和胃肠道，8这表明TAA可能是多器官衰竭的有用模型。

      EGF是一种由唾液腺和十二指肠的布伦纳腺体产生的53个氨基酸肽。它是一种有效的促进胃肠道增殖和愈合的兴奋剂，作为细胞保护剂，“稳定”细胞对抗有害物质，如吲哚美辛。9此外，我们最近发现EGF可以预防四氯化碳引起的肝损伤。10因此，人们对其治疗人类胃肠和肝脏疾病的潜在临床价值感兴趣。我们现在报告了我们的研究，检查EGF是否可以影响有毒物质TAA引起的肾、肝和胃肠道损伤的程度。

      材料与方法

      动物

      成年雄性OF-1雄鼠(20-22克)被单独安置在金属底笼子中，并允许自由获得水和商业食物。动物在实验前驯化了7天，实验是根据当地的监管准则进行的。

      化学物质

      人重组EGF，表达于酿酒酵母,购自HeberBiotc SA(哈瓦那，古巴)。给药前，用0.9%生理盐水稀释hrEGF，并通过0.22 μm过滤器消毒。TAA从Sigma化学公司(圣路易斯，密苏里州，美国)获得，并在盐水中稀释。所有溶液均在每次实验前新鲜配制。

      生化检测

      比色法测定血清丙氨酸转氨酶(ALAT)水平，11根据供应商的说明(Hoffman LaRoche，巴塞尔，瑞士)。根据制造商说明书(Reactivos SPINREACT SA, Barcelona, Spain)测定血清肌酐水平。

      试验协议

      所有实验开始前，小鼠禁食16小时

      初步研究

      进行了一系列初步实验，检查了单独给予不同剂量TAA对生存的影响。每组10只小鼠给予10、20、40或60 mg/kg的TAA(单次腹腔注射)，然后观察48小时。在此期间，给予10、20、40和60 mg/kg TAA的动物的死亡率分别为10、20、60和100%，几乎所有死亡都发生在给予TAA 20 - 21小时后。后续研究选择40 mg/kg的剂量，因为这接近LD50．

      EGF预处理对TAA毒性的影响

      由于后勤方面的原因，在两个不同的场合进行了两个独立的实验。在每个实验中，小鼠(每组10只)被随机分配在接受TAA (40 mg/kg腹腔注射，体积为1ml) 30分钟前接受生理盐水或hrEGF(10或30 μg/kg腹腔注射)。24小时后，存活的动物被乙醚轻度麻醉，并通过心脏穿刺采集血液。然后用颈椎脱位法处死动物并进行尸检。收集胃，用3毫升10%缓冲福尔马林充气。随后沿着大弯曲打开，用生理盐水冲洗，并使用解剖显微镜检查粘膜损伤。小肠游离解剖，用生理盐水2ml冲洗，称量，用解剖钳沿长度切开，宏观观察。收集近5cm小肠(“十二指肠”)进行分析，然后从剩余的小肠长度中再取5 (2cm)等间距段，固定在缓冲的福尔马林中，随后进行形态学评估(见下文)。肾脏、肝脏、大肠、心脏、肺、脾脏和胰腺也被收集并进行组织学评估。

      另外6只小鼠，在相同的环境下，不给予TAA或EGF，但以相同的方式处理，以确定局部验证的“正常”值。

      微观分析

      所有组织学和形态测定均采用盲法进行。计算机图像分析用于量化小肠和肝损伤。简单地说，显微图像是使用索尼DXC-107相机拍摄的，并通过VideoBlaster SE-100帧抓取卡显示在IBM计算机上。4×物镜用于肠损伤评估，25×物镜用于肝损伤评估。

      对于肠道损伤，每个显微镜视野延伸超过1500 μm，包括约25个绒毛和垂直切片隐窝。使用DIGIPAT形态测量图像处理包(EICISOFT Calle 24 No. 408, Vedado, Havana, Cuba)分析组织样本的整个长度。严重损伤粘膜的总长度，定义为直接坏死区域，然后确定并表示为所检查组织长度的百分比。

      肝脏组织以类似的方式处理，使用与肠道组织相同的设备和软件捕获和定量图像。在标准化组织面积为40mm的范围内确定每个碎片的损伤总面积2，通过测量和添加单个中心周围苍白病灶的大小。

      肾组织用10×物镜测定损伤肾小球数和每个野出血灶数。

      给药后EGF对TAA毒性的影响

      为了检验TAA后给予EGF的潜在价值，采用相同的方案进行了两个独立的实验，每次每组n=10。所使用的方案如上所述，除了在TAA后30分钟给予EGF，而不是在TAA前30分钟。在这些研究中，我们还使用了一组不同的参数来测量肠道损伤，以表明损伤的明显变化不依赖于使用特定的检测方法。在研究结束时，用2ml冰盐水冲洗小肠，收集的液体用于随后的血红蛋白测定，使用商业试剂盒(Reactivos SPINREACT SA，巴塞罗那，西班牙)，氰化血红蛋白法。将小肠沿其长度打开，进一步用冷生理盐水冲洗，用纸吸干，并称重。然后在磷酸盐缓冲盐水中均质，并采用劳瑞法测定总蛋白。使用商业试剂盒(GeneQuant, Pharacia)单独等分测定总DNA含量。简单地说，这是通过在含有1 M Tris pH 8, 0.5 M EDTA, 20% SDS和20 mg蛋白酶k的萃取缓冲液中在55°C下消化组织匀浆4小时来实现的。随后进行三次苯酚/氯仿萃取，并用乙醇沉淀DNA。颗粒干燥后在100 μl TE中重悬，随后在260 nm处进行分光光度测定。结果以三次读数的平均值表示。 Blood samples were collected by cardiac puncture for ALAT and creatinine assays.

      统计数据

      在两个不同的场合使用相同方案的实验数据几乎完全相同，证实了我们发现的可重复性。为了证明这种可重复性，我们将死亡率数据的结果分别显示为单独结果和累积结果(表2)1，2)．随后对这两种情况的器官损伤数据进行了分析，以便进行统计比较。死亡率资料采用χ2测试。由于来自生化和组织学分析的数据不是正态分布，数据以中位数和四分位范围表示，统计分析使用非参数Mann-Whitney U检验。

      查看该表:
      表1

      大鼠在给药前30分钟给予硫代乙酰胺(TAA) (40 mg/kg)与或不加表皮生长因子(EGF) 24小时生存值。在两次实验中，每组10只小鼠

      查看该表:
      表2

      在给药30分钟后，给予硫代乙酰胺(TAA)和无表皮生长因子(EGF)大鼠24小时生存价值。在两次实验中，每组10只小鼠

      结果

      死亡率

      在最初24小时观察期内死亡的动物，在给予TAA后16小时观察到总体状况恶化，出现进行性嗜睡、直立和俯卧。所有死亡均发生在TAA注射后20-21小时。在涉及TAA前接受EGF的动物的研究中，对照组动物的死亡率为50%，接受低剂量EGF的动物的死亡率为20%，接受高剂量EGF的动物的死亡率为0%(表2)1)．在TAA后给药，EGF在动物中显示出类似的保护作用(表2)．死后检查显示小肠有大量腔内出血，组织学变化与存活动物相似。在最初的24小时内死亡的动物没有进行小肠组织的形态测量分析，因为死后的变化可能会影响结果。

      解剖时幸存动物的宏观观察

      对照组小肠和肝脏易碎性增加。许多动物还显示出小肠腔内出血的证据。在EGF治疗的动物中也发现了类似的变化，尽管它们在定性上被认为不那么严重，这在TAA后给予EGF的动物中得到了定量证实(见下文)。心脏、肺、脾、胰腺和肾脏宏观上正常。

      在taa之前给予egf的进一步研究结果

      微观评估

      主要的组织学改变出现在小肠、肝脏和肾脏。

      肠

      对照组的十二指肠组织学变化很小。相反，整个空肠和回肠显示广泛的粘膜坏死，通常伴有剥脱(图2)1在高剂量和低剂量EGF处理的动物中，这些变化都显著减少(图1B).定量评估显示，给予不含EGF的TAA的动物出现了空肠和回肠的粘膜坏死，影响其长度的100%。相比之下，两种剂量的EGF均能显著缩短坏死小肠组织的长度(均p<0.05)vTAA治疗未给予EGF的动物;表格3.)．各组大肠组织学正常。

      Thioacetamide (TAA) induced small intestinal injury. (A) Twenty four hours after administration of TAA (40 mg/kg) to mice, the normal villus structure of the jejunum and ileum is lost and marked necrosis is seen within the remaining mucosa. (B) Administration of epidermal growth factor (EGF, 30 μg/kg), 30 minutes prior to TAA, markedly preserved small intestinal architecture. Similar preservation was seen when a dose of 10 μg/kg of EGF was used (not shown). Tissues were stained with haematoxylin and eosin. Original magnification ×10. Bar=100 μm.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
      图1

      硫代乙酰胺(TAA)致小肠损伤。(A)小鼠给予TAA (40 mg/kg) 24小时后，空肠和回肠的正常绒毛结构消失，剩余黏膜可见明显坏死。(B) TAA前30分钟给予表皮生长因子(EGF, 30 μg/kg)，小肠结构明显保存。当使用剂量为10 μg/kg的EGF(图中未显示)时，也能看到类似的保存。组织用苏木精和伊红染色。原始放大×10。酒吧= 100μm。

      查看该表:
      表3

      表皮生长因子(EGF, 10或30 μg/kg)预处理对硫代乙酰胺(TAA)损伤器官系统的影响对照组动物不接受TAA或EGF。TAA治疗组(单独TAA和TAA+EGF)的所有报告参数均显著高于对照组

      肝

      小叶中心坏死，偶尔与出血性病灶相关，在所有三组中都可见2)，常伴有一定程度的炎症浸润。服用TAA可使血清ALAT水平增加约10倍(p<0.01)(表3.)．根据组织学或转氨酶水平的升高评估，EGF预处理不影响TAA给药引起的肝损伤程度(表2)3.)．

      Thioacetamide (TAA) induced hepatic injury. TAA treated animals showed marked hepatic injury, mainly centrilobular necrosis with occasional haemorrhagic foci. The histological appearance was similar in all treatment groups. Tissues were stained with haematoxylin and eosin. Original magnification ×20. Bar=50 μm.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
      图2

      硫代乙酰胺(TAA)致肝损伤。TAA治疗的动物表现出明显的肝损伤，主要是小叶中心坏死，偶有出血灶。所有治疗组的组织学外观相似。组织用苏木精和伊红染色。原始放大×20。酒吧= 50μm。

      肾脏

      对照组动物显示广泛的肾小球簇塌陷(图3.A)。小管系统的上皮细胞中也发现了轻微的退行性急性变化，髓质中也出现了出血区(图3.B)。这些变化在高剂量和低剂量EGF治疗的动物中都减少了(图3.C).通过显微镜下观察到的塌陷肾小球簇和出血灶的数量以及血浆肌酐水平的变化来评估定量，支持EGF具有保护作用的这一发现。对于所有这些参数，高剂量或低剂量EGF均可导致损伤量显著减少约70-80%(表2)3.)．

      Thioacetamide (TAA) induced renal injury. Tissues were stained with haematoxylin and eosin. The renal tissue of TAA treated animals showed extensive collapse of the glomerular tufts.. Original magnification ×10. (B) Higher power photomicrograph of the same tissue demonstrating that only minor degenerative acute changes in the epithelial cells of the tubular system were seen. Original magnification ×20. Bar=50 μm. (C) Pretreatment with EGF reduced the renal changes caused by TAA. Original magnification ×20. Bar=50 μm.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
      图3

      硫代乙酰胺(TAA)致肾损伤。组织用苏木精和伊红染色。经TAA处理的动物肾组织显示广泛的肾小球簇塌陷。原始放大×10。(B)同一组织的高倍显微照片显示，在管状系统的上皮细胞中只看到轻微的退行性急性变化。原始放大×20。酒吧= 50μm。(C) EGF预处理减少了TAA引起的肾脏变化。原始放大×20。酒吧= 50μm。

      进一步的结果来自于taa后给予egf的研究

      TAA单独导致每克湿重基础上表达的DNA和蛋白质含量显著降低(图4)．TAA还引起腔内血红蛋白明显升高。与TAA前的EGF方案一样，血浆ALAT和肌酐升高。TAA后给予EGF可减少TAA引起的大部分变化(图4）;腔内血红蛋白和血浆肌酐显著低于单独给予TAA的动物，黏膜DNA和蛋白质含量显著高于单独给予TAA的动物。然而，EGF并没有逆转TAA引起的ALAT升高。

      Effect of epidermal growth factor (EGF) given 30 minutes after thioacetamide (TAA) on multiple organ systems. EGF reduced luminal bleeding (A), and the reduction in wet weight (B), DNA (C), and protein content (D) of the gut caused by TAA. The rise in plasma creatinine caused by TAA was also reduced by administration of EGF (E) although it did not influence the rise in serum alanine aminotransferase (ALAT) (F). *p<0.05, **p<0.01 compared with animals given TAA alone.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
      图4

      硫代乙酰胺(TAA)后30分钟给予表皮生长因子(EGF)对多器官系统的影响。EGF减少了TAA引起的腔内出血(A)和肠道湿重(B)、DNA (C)和蛋白质含量(D)的减少。虽然EGF (E)不影响血清丙氨酸转氨酶(ALAT) (F)的升高(*p<0.05， **p<0.01)，但与单独给予TAA的动物相比，EGF (E)也降低了TAA引起的血浆肌酐的升高。

      讨论

      我们研究了高剂量硫代乙酰胺对多器官系统的影响，并确定了EGF对持续损伤程度的影响。给药TAA (40 mg/kg腹腔注射)与50%的死亡率相关，主要损伤部位为小肠、肝脏，肾脏损伤程度较轻。在TAA前或TAA后30分钟给予EGF可显著降低死亡率、肠损伤和肾损伤，且呈剂量依赖性。然而，根据组织学和生化评估，EGF对肝损伤的程度影响不大。

      给药TAA是一种公认的诱导肝损伤的方法。3.，4其毒性可能与TAA生物转化为TAA磺酮和亚砜形式有关，这些形式与蛋白质广泛反应，形成乙酰limididysine衍生物，导致其变性和电荷修饰。5，6多个蛋白质系统已被证明是受伤的，包括那些存在于内质网，那些参与线粒体呼吸，和应激反应蛋白，如热休克蛋白家族。6，12，13TAA还可能通过产生自由基来损伤细胞，14导致脂质过氧化。无论涉及的分子机制是什么，给药TAA会导致细胞凋亡和坏死增加，当使用高剂量TAA时，坏死是主要的。15在目前的一系列研究中，小肠组织的组织学检查显示整个小肠都有明显的坏死变化。在这种特殊情况下，坏死可能是肠损伤的主要最终途径。然而，在该模型中确实发生了一定程度的凋亡，当收集的肠道残留DNA在琼脂糖凝胶上运行时，存在低水平的DNA阶梯(CIGB，个人通信)。对这一过程的进一步检查可能会跟踪凋亡相关酶(如caspases)的变化，但由于在含有高水平坏死组织的区域中几乎没有存活的粘膜组织，这一事实将变得复杂。

      本研究中观察到的肝脏变化(小叶中心坏死和转氨酶水平升高)之前已经描述过。3.，4也有人指出，TAA可损伤其他器官系统，包括肠道和肾脏。7，8奥尔特加等在大鼠饮水中长期口服TAA可引起空肠和回肠细胞间隙增大，淋巴细胞浸润。8在我们使用小鼠进行的研究中发现了更广泛的变化，几乎可以看到粘膜完全坏死。这种毒性差异可能与所使用的剂量有关(本研究中为40 mg/kg，而约为25 mg/kg)，但也可能与给药途径和所研究的物种有关。与奥尔特加的研究相反等我们检查了整个小肠，发现近端肠道(十二指肠)几乎不受TAA的影响。近端肠道保持完整的原因尚不清楚，但可能是TAA有毒代谢产物的肠肝循环(这将导致壶腹近端十二指肠相对保留)，胰腺蛋白酶损伤肠道的要求，或流向十二指肠的内脏血液得到了更好的保存。

      肾内主要组织学改变为簇状塌陷，近端小管有轻微退行性改变。这种簇状塌陷的部分解释可能是由于出血进入肠腔引起的低灌注。EGF可防止瘤簇塌陷和肾小管损伤。值得注意的是，对于肠道和肾脏的改变，TAA诱导的组织学损伤被比作缺血/再灌注事件。16，17因此，除了上述分子机制外，TAA还可能通过诱导血管收缩或干扰参与细胞呼吸的其他关键途径而造成损伤。

      产生EGF的主要来源是唾液腺，十二指肠的Brunner腺体和肾脏。许多研究表明，EGF是一种有效的刺激生长的各种类型的细胞在体外18在体内19并作为一种细胞保护剂，对多种有害物质如非甾体类抗炎药引起的胃损伤具有拮抗作用9，20.以及三硝基苯磺酸引起的结肠炎。21此外，我们最近发现外源性EGF可以减少四氯化碳介导的肝损伤，10提示其对肝损伤的防治有一定价值。然而，关于其在预防/治疗多器官系统损伤(如MOF期间发生的损伤)方面的价值的信息相对较少。

      从这些研究中获得的生化和组织学数据表明，EGF能显著减轻TAA引起的肠和肾损伤，并呈剂量依赖性。然而，EGF发挥这些作用的机制尚不清楚。EGF影响多个系统，包括前列腺素的上调，这些系统可能在介导这些效应中起重要作用20.和粘液22生产，增加肠系膜血流量，23，24上调超氧化物歧化酶(从而降低自由基诱导的毒性)，25影响与应激相关的蛋白激酶。26有趣的是，EGF似乎没有影响肝损伤的程度，但显著降低了死亡率。因此，TAA引起的严重肠道损伤和腔内出血可能是导致动物死亡的主要因素。

      EGF的临床试验目前正在进行，用于治疗肠溃疡性疾病，如坏死性小肠结肠炎。27我们的研究提供了初步证据，EGF也可能对MOF有益，其中肠道通透性的增加被认为是其病因的重要组成部分。2MOF是一种严重的危及生命的疾病，通常由严重创伤、烧伤或暴发性感染引起。1MOF的病理生理机制尚不清楚，但重要的致病因素可能包括缺氧、肠通透性增加、细菌易位、内毒素血症和不受控制的全身炎症反应。2无论起始事件是什么，一旦确定，MOF的死亡率就很高。1用于诱导MOF的两种最流行的动物模型是给药zymosan，28后者通过诱导胰腺损伤引起MOF，而肠毒素通过多种机制导致MOF，包括心血管衰竭。29目前的研究表明，TAA诱导的损伤提供了一个互补的模型，其初始毒性作用主要集中在肝脏和小肠粘膜。

      能够降低患者发生MOF风险的新疗法具有直接的临床潜力。许多在住院期间发展到MOF的患者可以在早期(通常在入院时)根据初始损伤的严重程度(例如烧伤患者受影响的皮肤表面积百分比)进行识别。1，2因此，存在一个潜在的“治疗窗口”，在完全MOF综合征发展之前，可以使用EGF等药物。进一步研究EGF本身或其他EGF受体配体(如转化生长因子α和双调节蛋白)在预防MOF和治疗MOF方面的潜在益处，一旦完全确定，似乎是有必要的。

      致谢

      我们感谢组织病理学科K O'Reilly博士的组织学建议。研究经费由医学研究委员会、威康信托基金会和皇家学会提供。

      本文中使用的缩写

      表皮生长因子
      表皮生长因子
      hrEGF
      人重组表皮生长因子
      TAA
      硫代乙酰胺
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