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条文本gydF4y2Ba

菜单条gydF4y2Ba
胃肠道癌症gydF4y2Ba
反义治疗针对变异人类大肠癌Ki-ras腺癌gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. H J N AndreyevgydF4y2Ba*gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  2. P J。罗斯gydF4y2Ba*gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  3. D坎宁安gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  4. 便士克拉克gydF4y2BabgydF4y2Ba
  1. 一个gydF4y2Ba医学系的皇家马斯登医院,伦敦,英国,gydF4y2BabgydF4y2Ba癌症研究中心运动疗法,癌症研究所,萨顿,英国萨里gydF4y2Ba
  1. PA克拉克博士Haddow一起喝实验室、CRC癌症治疗中心癌症研究所,15科茨沃尔德丘陵Rd,萨顿,英国萨里郡,SM2 5 ng。gydF4y2Ba克拉克在{}icr.ac.ukgydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba克里斯汀•拉(Ki-ras)突变是常见的胃肠道癌症,一个基码12突变,甘氨酸,缬氨酸,特别积极地结直肠癌。gydF4y2Ba

的目标是gydF4y2Ba调查如果这缬氨酸点突变可以有针对性的反义寡核苷酸和确定任何反义/信使rna相互作用的疗效。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba二十9反义寡核苷酸对目标筛选和控制Ki-ras RNA在无细胞系统和目标和控制细胞系文化。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba的活动和特异性寡核苷酸多样。结果对个人寡核苷酸是一致的在细胞培养细胞自由模型和使用两个不同的吸收促进剂。只有一个寡核苷酸是特定目标的乳沟Ki-ras mRNA在无细胞系统和具体出现在细胞培养,虽然Ki-ras mRNA和蛋白表达的改变单一治疗后不能被探测到。无细胞系统实验表明,寡核苷酸的点突变相对难以接近。其他网站上Ki-ras RNA分子,远离点突变,可以更有效地目标。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba成功针对临床相关Ki-ras点突变与反义寡核苷酸是困难的,因为RNA结构突变的网站与其他网站相比,效率低下Ki-ras信使RNA。gydF4y2Ba

  • Ki-ras突变gydF4y2Ba
  • 反义治疗gydF4y2Ba
  • 结直肠癌gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.48.2.230gydF4y2Ba

来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    结直肠癌有不良预后生存率和改善在过去40年一直令人失望。分子遗传学的进展表明,大肠癌发展积累的遗传异常。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这些基因变化提供了可能作为早期诊断疾病的标志,作为预后指标,和治疗的目标。在2721年的一项多中心研究结直肠癌患者,我们证明了这些特征的遗传缺陷,缬氨酸突变的存在对克里斯汀•拉(Ki-ras)基因的密码子12,死亡的风险增加了43%,比其他Ki-ras突变与贫穷相关的结果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba

    反义寡核苷酸治疗旨在阻止单个蛋白质的表达是至关重要的发展的一个特定的癌症和依赖于合成寡核苷酸引入细胞hybridisation-binding-to具体补充目标信使rna通过沃森克里克碱基配对可以发生。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba这种杂交可以通过许多机制,抑制蛋白表达gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba其中一个是激活的核糖核酸酶H,无处不在的胞内酶。核糖核酸酶H劈开反义RNA工器/破坏RNA但离开反义寡核苷酸免费绑定到进一步补充mRNA。如果反义目标是独一无二的正常细胞的癌症和缺席,希望反义分子将在正常细胞没有活动。初步临床研究已经表明,反义治疗可以安全的相对无毒的战略和功效,已经有证据表明。gydF4y2Ba6 - 8gydF4y2Ba

    反义寡核苷酸的设计是至关重要的功效的碱基配对维护目标的二级和三级结构可能防止杂交一些反义RNA分子。gydF4y2Ba9gydF4y2BaRNA在寡核苷酸结合结构的影响很难预测和小寡核苷酸结构的差异会导致杂交效率之间存在较大的差异。因此,对于每个目标RNA,大量的寡核苷酸需要筛选确定哪些是最有效的。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba另外,图书馆的随机寡核苷酸可以识别区域的RNA中最平易近人的。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba

    没有研究系统地研究反义治疗的疗效针对胃肠道癌症临床相关的点突变。我们调查了如果一个特定Ki-ras点突变与一个贫穷的结果可能是有针对性的反义寡核苷酸。我们的目的是屏幕上一系列的反义寡核苷酸来识别一个活跃分子善意反义的作用机制。gydF4y2Ba

    方法gydF4y2Ba

    细胞系gydF4y2Ba

    人类原发性结直肠SW480细胞腺癌,纯合子突变在12码(缬氨酸甘氨酸:GGT→GTT)被用作目标细胞培养模型。另外两人结直肠癌细胞系,HT29(野生型Ki-ras等位基因密码子12/13-mutated密码子61)和lovos(杂合的密码子13 GGC→广汽天冬氨酸突变)提供控制细胞系模型。Ki-ras基因型经DNA测序。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba

    细胞系在杜尔贝科的修改维护鹰中补充了50个单位/毫升青霉素,链霉素50毫克/毫升、2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺和10%热灭活胎牛血清在non-humidified 5%有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba大气孵化器在37°C。gydF4y2Ba

    免费细胞核糖核酸酶H化验gydF4y2Ba

    外显子1的Ki-ras从SW480放大,HT29,和lovos基因组DNA使用引物:5′-CAGTCAGTAAGCTTCCTAA TACGACTCACTATAGGGAGTATAAGGC CTGCTGAAAATGACTGAATATAA-3′(T7噬菌体发起人)和5′-CAGT CAGTGAATTCACA AGATTTACCTCTAT TGTTGGATCATAT-3′在35周期为一分钟92°C,一分钟60°C, 72°C两分钟。RNA是由体外转录RNA聚合酶和T7噬菌体并将其与T4噬菌体RNA连接酶和3′末端gydF4y2Ba32gydF4y2Ba卡式肺囊虫肺炎。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba大师混合(4μl /反应)-50 000切伦科夫计数/分钟/热猝灭反应3′标记RNA, 1μl /反应5×缓冲区(700更易与氯化钾,125更易与三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.6,50 mM MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba),0.13户/反应gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba核糖核酸酶H(法玛西亚),和5单位/反应rRNase是添加到1的μlμM寡核苷酸在37°C 30分钟。反应被终止添加5μl凝胶加载缓冲区(10 M尿素,1.5×此种,0.015% w / v溴酚蓝,0.015% w / v二甲苯苯胺)在68°C 10分钟。乳沟产品8%变性聚丙烯酰胺电泳,分析了/ 7 M尿素凝胶直接放射自显影法紧随其后。gydF4y2Ba

    类似的方法被用来准备一个3′标记RNA包括Ki-ras mRNA的前三个外显子编码。这种RNA是孵化如上的寡核苷酸浓度(1 - 1000 nM)在30分钟的时间。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba它也被用来屏幕访问网站与2.5μg孵化后淬火热库的随机寡核苷酸序列和0.13户/反应gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba核糖核酸酶在37°C H 5到15分钟。这些条件滴定得到的寡核苷酸和核糖核酸酶H浓度和时间的孵化,以确保一个单一的核糖核酸酶H削减发生大约每10 RNA分子。核糖核酸酶H削减网站映射相比3′末端标记记录孵化与核糖核酸酶TgydF4y2Ba1gydF4y2BaTgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2BaB的仙人掌gydF4y2Ba(数据没有显示)。这消除了二次的风险削减后引起的结构变化主要削减。(全部细节将发表在其他地方,罗斯gydF4y2Ba等gydF4y2Ba在准备。)gydF4y2Ba

    反义治疗细胞系gydF4y2Ba

    细菌毒素链球菌溶血素O用于permeabilise细胞单层培养细胞悬浮通过修改协议。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba条件允许临时permeabilisation细胞膜的链球菌溶血素O的前提下长期使用MTT测定细胞生存能力优化gydF4y2Ba17gydF4y2Ba并通过coincubation propidium碘。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba细胞被播种在0天达到80% confluency收成。1天,媒体被和细胞被洗两次鹰介质与杜尔贝科的修改。每个好治疗15μl解决方案包含10μM反义寡核苷酸,和7.5单位/毫升链球菌溶血素在4°C O preactivated一小时与5毫米二硫苏糖醇体积由鹰介质与杜尔贝科的修改。细胞化验控制处理同等体积的媒体或控制寡核苷酸。细胞培养30分钟37°C,洗两次,然后包含媒体代替血清。gydF4y2Ba

    阳离子脂质转染作为替代链球菌溶血素permeabilisation。的屏幕可以脂质系列(英杰公司)确认Pfx-3(1:1的混合物的专有阳离子脂质和涂料在2毫克/毫升)的最佳脂质转染SW480细胞。细胞被播种在0天如上所述,在第一天的溶液Pfx-3 24μg /毫升是免费OptiMEM血清培养基(Gibco生活技术,佩斯利,英国)gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺和CaCl 2毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba100 mg / l。寡核苷酸的400 nM的解决方案也在OptiMEM准备。相同数量的两种解决方案在室温下混合和孵化,而细胞在OptiMEM洗两次。转染的解决方案是添加到每个。细胞培养四个小时在37°C,转染的解决办法是删除,含血清培养基更换。吸收FITC标记寡核苷酸被发现在四个小时大约80%的脂质细胞治疗。这种效应持续至少24小时。几乎没有可检测的荧光在细胞治疗脂质(数据没有显示)。gydF4y2Ba

    细胞生存和增殖化验gydF4y2Ba

    可行性是肝癌和化验的反应和扩散是衡量gydF4y2Ba3gydF4y2BaH胸腺嘧啶核苷掺入。gydF4y2Ba3gydF4y2BaH胸苷在无菌磷酸盐缓冲盐水稀释0.1 mCi /毫升和10μl被添加到每个治疗microwell细胞收获前24小时。细胞被洗用新鲜的媒体,trypsinised,困在过滤器垫(Skatron)使用一个Inotech细胞收割机。过滤器在100%乙醇固定,干gydF4y2Ba3gydF4y2BaH胸腺嘧啶核苷掺入测量Inotech板读者在氩90% / 10%甲烷气体流。gydF4y2Ba

    分析Ki-ras表达式gydF4y2Ba

    信使核糖核酸gydF4y2Ba

    单链高特定活动对人类GAPDH反义RNA探针(外显子5 - 8)和Ki-ras(外显子1 - 3)是由体外转录的[a -gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] UTP。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba核糖核酸酶保护信使rna在细胞溶解产物直接进行分析,5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/分析,使用直接保护试验(美国Ambion)。保护片段被电泳分离8%变性聚丙烯酰胺/ 7 M尿素凝胶和直接探测到放射自显影法。gydF4y2Ba

    蛋白质gydF4y2Ba

    细胞复苏,洗两次,resuspended 10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在冰冷的裂解缓冲/毫升(10毫升:50毫米三HCl, 150毫米氯化钠,pH值7.5,1% (v / v) Nonindet p 40, 1% (w / v)钠十二烷基硫酸盐,×1蛋白酶抑制剂;完整的迷你平板电脑,勃林格,德国曼海姆)经过25针规和留在冰20分钟。暂停在16 000离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 20分钟。上层清液被移除,25μl整除用于蛋白质估计,剩下的是储存在−70°C。蛋白质含量是由洛瑞化验(BioRad)。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba

    等量的蛋白质(100μg)和彩虹分子量标记(Amersham生命科学,白金汉郡,英国)解决了12.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba和electrotransferred hybond-c硝基。gydF4y2Ba21gydF4y2BaKi-ras蛋白质检测使用主要反人类的c-Ki-ras鼠抗体(致癌基因研究产品,剑桥,麻萨诸塞州,美国)特定的野生型和突变蛋白。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba免疫印迹被封锁在TBST 5%脱脂牛奶(20毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8.0,150毫米氯化钠,0.05%渐变20)和在室温下孵化一小时5μg /毫升抗体(1%明胶和TBST)。C-raf-1蛋白质检测使用0.25μg /毫升鼠标反人类的C-raf-1抗体(美国列克星敦转导实验室)在室温下了两个小时在5%脱脂牛奶TBST (pH值7.5)。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba特定抗原抗体相互作用是检测辣根过氧化物酶共轭antimouse使用增强化学发光免疫球蛋白免疫印迹检测试剂(Amersham生命科学)。gydF4y2Ba

    寡核苷酸gydF4y2Ba

    二十9种不同13-17mer寡核苷酸(和他们的反向顺序控制)补充区域包括缬氨酸的密码子12甘氨酸Ki-ras点突变是合成(Genosys,剑桥,英国)和高压液相色谱纯化(无花果gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。寡核苷酸大于17 mer不是有效地判别点突变。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba最小化潜在的非特异性毒性观察与phosphorothioate寡核苷酸,我们最初使用的寡核苷酸磷酸二酯支柱和两个终端phosphorothioate联系3′,5′末端。gydF4y2Ba25日- 27日gydF4y2Ba限制分子也会增加稳定性与纯磷酸二酯分子。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba几个寡核苷酸也作为正式phosphorothioates合成。细胞自由研究17 mer随机寡核苷酸合成纯磷酸二酯骨干。反义寡核苷酸PR4是phosphorothiated 17 mer针对核苷酸373 - 409。gydF4y2Ba

    The Ki-ras wild-type (HT29), mutated control (LoVo), and target (SW480) sequences, and the 29 different designs of oligonucleotides tested.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1gydF4y2Ba
    图1gydF4y2Ba

    Ki-ras野生型(HT29)、突变控制(lovos)和目标(SW480)序列,和29个不同的寡核苷酸的设计测试。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    反义Ki-ras信使rna在细胞免费化验gydF4y2Ba

    以确定反义寡核苷酸可以显示为点突变特异性,每个寡核苷酸与核糖核酸酶H和孵化gydF4y2Ba32gydF4y2BaP结束标记RNA对应Ki-ras mRNA的第1外显子。这个RNA含有目标12缬氨酸密码子突变,控制13密码子突变,或控制野生型序列。gydF4y2Ba

    孵化的寡核苷酸、RNA靶序列和核糖核酸酶H导致五乳沟产品虽然有些寡核苷酸不活跃(无花果gydF4y2Ba2gydF4y2BaA、B)。个人解理强度产品多样。然而,乳沟的相对强度、大小和数量的产品是可再生的。即13日和14日即是不活跃的,15即显示可怜的活动而削减(图16即诱导增加gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然而,17(图即是最活跃gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)。很明显,寡核苷酸倾斜5′的突变是最活跃的。这些扭曲3′是不活跃的。gydF4y2Ba

    (A) The 13–16mer oligonucleotides incubated with the 3′ end labelled exon 1 RNA and E coli RNase H. A reverse sequence oligonucleotide to 17.2 (scr) was included as a control for background degradation of the target RNA. (B) The 17mer oligonucleotides incubated with the 3′ end labelled exon 1 RNA and E coli RNase H. A reverse sequence oligonucleotide to 17.2 (scr) was included as a control for background degradation of the target RNA.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2gydF4y2Ba
    图2gydF4y2Ba

    (一)13-16mer寡核苷酸孵化的3′末端标记外显子1 RNA和大肠杆菌核糖核酸酶h . 17.2反向序列寡核苷酸(scr)是包括作为背景的控制降解RNA的目标。(B)的17个mer寡核苷酸孵化的3′末端标记外显子1 RNA和大肠杆菌核糖核酸酶h . 17.2反向序列寡核苷酸(scr)是包括作为背景退化的控制目标的RNA。gydF4y2Ba

    与核糖核酸酶TgydF4y2Ba1gydF4y2Ba与寡核苷酸测序车道建议产品17.2 SW480巷代表乳沟的前体在突变网站(数据未显示)。孵化的控制RNA携带13天冬氨酸突变导致裂解产品的检测与寡核苷酸17.1,-17.5和17.3,与野生型RNA也导致一些乳沟除了17.2。因此寡核苷酸17.2似乎非常具体的RNA诱导乳沟的前体的目标。gydF4y2Ba

    反义Ki-ras信使rna在细胞培养gydF4y2Ba

    比较细胞系的寡核苷酸序列的疗效我们使用直接permeabilisation方法同样有效的在所有三行(数据没有显示)。可行性,评估使用MTT测定线粒体的活动,并不是在任何一致的方式的影响,3、5或7天lovos或SW480细胞(数据未显示),当细胞接受单剂量链球菌溶血素O和每个29反义寡核苷酸或链球菌溶血素O。因此,治疗的效果使用扩散试验进一步检查。gydF4y2Ba

    对于每一个反义设计,更大的减少胸苷掺入在24小时内被认为比两个控制细胞系SW480细胞从同一条直线与未经处理的控制。一些寡核苷酸似乎有更大的特异性及其影响gydF4y2Ba3gydF4y2BaH胸腺嘧啶核苷掺入不同细胞系之间。图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba说明了数据从17 mer系列的寡核苷酸。17.2最大的特异性和有效性被认为与寡核苷酸诱导0.06 (SEM)减少32.2%胸苷掺入SW480细胞在一个最小的剂量,但影响HT29(野生型)和lovos细胞系(天冬氨酸13)控制。gydF4y2Ba

    Thymidine uptake in three different cell lines after treatment with a single 10 μM dose of each of the 17mer antisense molecules designed to target a point mutation on codon 12. Streptolysin O was used to facilitate oligonucleotide uptake. The data show the proportional effect on thymidine incorporation in cells treated with streptolysin and oligo compared with controls treated with streptolysin O. If a specific effect occurred from the antisense oligonucleotides, the proportion of antisense treated cells to control cells would be less than 1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3gydF4y2Ba
    图3gydF4y2Ba

    胸苷吸收在三个不同的细胞系治疗后用一个10μM剂量的每个17 mer反义分子设计目标对密码子12点突变。链球菌溶血素O被用来促进寡核苷酸吸收。数据显示比例对胸苷的影响结合在细胞治疗链球菌溶血素和低聚糖与控制治疗链球菌溶血素o .如果特定效应发生的反义寡核苷酸,反义治疗的细胞来控制细胞的比例会小于1。gydF4y2Ba

    获得的数据与链球菌溶血素O permeabilisation随访SW480细胞使用阳离子脂质比较17 mer与控制反向反义寡核苷酸序列寡核苷酸。三个细胞株需要不同的脂质配方实现高效转染细胞系之间的DNA,因此直接比较使用脂质不能。gydF4y2Ba

    当gydF4y2Ba3gydF4y2BaH胸腺嘧啶核苷掺入测量细胞内用反义治疗或逆转序列,获得的结果类似于使用链球菌溶血素O(无花果gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。寡核苷酸17.2又似乎是最有效的反向序列和其他相比反义的设计。没有检测到活动如果17.2添加到媒体没有增强吸收permeabilisation或转染(数据没有显示)。gydF4y2Ba

    Thymidine incorporation in the target SW480 cell line treated with the 17mer antisense or reverse sequence oligonucleotides plotted as proportion of counts measured in cells treated with antisense compared with counts in cells treated with reverse sequence (oligonucleotide at 2 μg/ml, cationic lipid 12 μg/ml).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4gydF4y2Ba
    图4gydF4y2Ba

    目标SW480细胞株中胸苷掺入处理17 mer反义或逆转寡核苷酸序列绘制的比例计数测量细胞对反义与计数细胞治疗逆转序列(寡核苷酸在2μg /毫升,阳离子脂质12μg /毫升)。gydF4y2Ba

    Ki-ras表达反义治疗后细胞gydF4y2Ba

    证实反义的特异性效应与17.2在我们的系统中,我们检查了反义治疗后Ki-ras mRNA和蛋白水平。Ki-ras mRNA水平变化已报告发生后24小时内反义治疗。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba不过,我们无法发现Ki-ras mRNA水平变化与17 SW480细胞治疗后24小时mer寡核苷酸转染到细胞使用阳离子脂质(无花果gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),一个可能的解释的缺失影响Ki-ras嵌合寡核苷酸的mRNA表达不稳定。然而,这是打折的完全phosphorothioated版本17.2也同样无效的减少Ki-ras mRNA表达(无花果gydF4y2Ba5gydF4y2BaB)。此外,我们发现一个活跃的Ki-ras反义承认野生型Ki-ras可以减少Ki-ras具体有效的表达在24小时内,证明我们的模型系统生产和检测反义效果(图的能力gydF4y2Ba5gydF4y2BaC)。gydF4y2Ba

    (A) RNase protection analysis of Ki-ras and GAPDH expression following 24 hour treatment of SW480 cells with oligonucleotides 17.1–17.7 and their respective reverse sequence controls (scr). (B) Treatment of SW480 cells for 24 and 48 hours with the end capped and fully phosphorothiated versions of oligonucleotide 17.2 (C) Ki-ras antisense (PR4) recognises wild-type Ki-ras effectively and specifically reduces Ki-ras expression at 24 hours.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5gydF4y2Ba
    图5gydF4y2Ba

    (A)的核糖核酸酶保护分析Ki-ras和GAPDH表达与寡核苷酸SW480细胞治疗24小时后17.1 - -17.7和各自的反向顺序控制(scr)。(B)治疗SW480细胞24和48小时的限制和完全phosphorothiated版本17.2 (C) Ki-ras反义寡核苷酸(PR4)承认具体有效的野生型Ki-ras减少Ki-ras表达式在24小时。gydF4y2Ba

    另一种解释是,我们发现的影响是由于立体阻塞Ki-ras mRNA的翻译,这将降低蛋白质含量没有改变mRNA水平。然而,未发现Ki-ras蛋白质表达的变化在任何细胞化验8中,16日,24日,36岁,或寡核苷酸治疗后48小时内(无花果gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。它也不太可能改变Ki-ras蛋白质含量发生早于8小时,错过了。Ki-ras蛋白的半衰期是未知的。然而,当环己酰亚胺,一般蛋白质合成抑制剂,添加(50μg /毫升)文化和Ki-ras SW480细胞蛋白质含量分别在不同的时间点54小时,检测Ki-ras蛋白质才消失30小时后(数据未显示)。很可能逮捕蛋白质合成环己酰亚胺比会突然和可能更完整的看过最好的反义疗法。因此,它似乎是合理的,如果一个反义效应发生,它将被视为治疗后至少30小时。gydF4y2Ba

    Protein was extracted from SW480 cells following 24 hours of treatment with oligonucleotides 17.1–17.7 or their respective reverse sequence (RS) controls. Expression of Ki-ras and the control c-raf protein were analysed on the same gel.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6gydF4y2Ba
    图6gydF4y2Ba

    从SW480细胞蛋白提取寡核苷酸治疗后24小时内17.1 - -17.7或各自的反向序列(RS)控制。Ki-ras表达式和控制c-raf蛋白质进行分析在相同的凝胶。gydF4y2Ba

    筛选Ki-ras mRNA网站访问寡核苷酸和核糖核酸酶HgydF4y2Ba

    这些观察暗示Ki-ras mRNA的点突变的目标站点并不容易,因此也许解释的温和对扩散的影响和缺乏可检测对mRNA和蛋白表达的影响。我们指出,最好的寡核苷酸(17.2)要求寡核苷酸的近似500倍超额实现目标外显子1的部分乳沟衬底RNA。gydF4y2Ba

    电脑制图显示密码子12 Ki-ras在于结构化的碱基配对区域mRNA(无花果gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。甘氨酸,缬氨酸点突变对这种结构的影响很小,稍微削弱碱基配对和打开一个小环在这个地区。gydF4y2Ba

    Computer predicted secondary structure of oligonucleotides 100–330 of the Ki-ras mRNA (exon 1=nucleotides 182–303). The bold uppercase indicates sites mutated in the cell lines used in this study. The bold lower case indicated on the SW480 sequence indicates the sequence targeted by oligonucleotide 17.1 and the italic lower case that targeted by oligonucleotide 17.7.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7gydF4y2Ba
    图7gydF4y2Ba

    计算机预测二级结构的寡核苷酸100 - 330 Ki-ras mRNA(外显子1 =核苷酸182 - 303)。粗体大写表示网站的突变细胞株用于这项研究。粗体小写表示SW480序列表示序列的寡核苷酸的目标17.1和17.7的斜体小写寡核苷酸的目标。gydF4y2Ba

    然而,计算机预测RNA结构可以是不可靠的,因此在点突变结构的可访问性寡核苷酸和核糖核酸酶H是调查使用细胞免费屏幕。结束标记RNA对应于前三个外显子Ki-ras mRNA的孵化与随机图书馆17 mer寡核苷酸和核糖核酸酶h的随机寡核苷酸库包含一个表示所有可能17 mer序列。这个试验因此允许只有17岁即补充最访问地区的RNA结合并激活核糖核酸酶h .并行孵化与特定的RNA序列允许精确定位的网站随机引发的图书馆。大量的网站优先消化,尽管密码子12点突变不是其中之一(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。这表明目标点突变并不容易寡核苷酸或核糖核酸酶H。gydF4y2Ba

    A 3′ end labelled RNA encompassing exons 1–3 was incubated with a random library of 17mer oligonucleotides and E coli RNase H. A number of sites were preferentially digested but this did not include the point mutation at codon 12. 1, Marker lane, RNA+RNase T1 for 15 minutes at 68°C. 2, RNA+oligonucleotide library+RNase H for 15 minutes or five minutes (3). 4, The labelled RNA incubated in the absence of RNase H for 15 minutes or five minutes (5).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8gydF4y2Ba
    图8gydF4y2Ba

    3′末端标记RNA包括外显子1 - 3是孵化随机图书馆17 mer寡核苷酸和大肠杆菌核糖核酸酶h .许多网站优先消化,但这并不包括在密码子12点突变。1车道标记RNA核糖核酸酶T1 + 15分钟在68°C。2、RNA +寡核苷酸库+ 15分钟或5分钟的前体(3)。4,标记RNA没有孵化15分钟或5分钟的前体(5)。gydF4y2Ba

    我们比较的活动17.2和寡核苷酸PR4-which优先目标的一个细胞消化网站免费化验与外显子1 - 3 Ki-ras信使rna含有缬氨酸12点突变。在一个时间点的动力学分析,很明显,17.2是远不及PR4有效,需要100倍的寡核苷酸来实现类似的削减率(图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

    Comparing the activity of 17.2 and oligonucleotide PR4—which targeted one of the preferentially digested sites—in the cell free assay against the exons 1–3 Ki-ras mRNA containing the valine 12 point mutation. At a single time point, at 30 minutes, taken from the kinetic analysis, 17.2 required 100 times more oligonucleotide than PR4 to achieve a similar rate of cutting.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图9gydF4y2Ba
    图9gydF4y2Ba

    比较17.2和寡核苷酸的活动PR4-which优先目标的一个细胞消化网站免费化验与外显子1 - 3 Ki-ras信使rna含有缬氨酸12点突变。在一个时间点,在30分钟,从动力学分析,17.2需要寡核苷酸100倍PR4实现类似的削减率。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    在这项研究中,我们筛选大量的功效在诱导核糖核酸酶反义分子H乳沟的临床重要的目标,一个点突变Ki-ras mRNA。不同分子结构设计通过改变寡核苷酸长度和倾斜点突变的序列互补的两个方向远离中心。gydF4y2Ba

    我们最有效的寡核苷酸需要穿透细胞膜获得疗效和完全不活动时直接添加到组织文化传媒在缺乏细胞permeabilisation或阳离子脂质。在两个吸收促进剂的存在,寡核苷酸给了相似的结果。然而,我们没有看到影响细胞的生存能力,在目标或控制细胞,尽管我们确实看到一致的虽然使用温和的对细胞增殖的影响gydF4y2Ba3gydF4y2BaH胸腺嘧啶核苷掺入化验。gydF4y2Ba

    有人建议,寡核苷酸的3′,5′末端胸苷可能干扰gydF4y2Ba3gydF4y2BaH胸腺嘧啶核苷掺入因此给误导的结果。gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba我们没有看到证据。事实上,最有效的寡核苷酸,17.2,只有一个胸苷位于六个核苷酸的3′末端。此外,反义和反顺序控制相同的寡核苷酸碱基组成并没有产生相同的效果和结果gydF4y2Ba3gydF4y2BaH胸腺嘧啶核苷掺入在细胞培养密切匹配的无细胞系统的结果。gydF4y2Ba

    未能证明其蛋白质或RNA表达变化可能是因为封顶寡核苷酸是不够稳定的维护影响核糖核酸或蛋白质。然而,从其他地方数据表明,年底封顶寡核苷酸的稳定文化不是一个重要的问题gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,我们仍然没有看到影响mRNA表达当一个完全phosphorothioated 17.2是用于细胞培养。我们的模型系统能够检测反义作用作为一个寡核苷酸设计目标更容易网站完全抑制Ki-ras表达式。这表明突变网站是不容易有针对性,适度对扩散的影响是由信使rna和蛋白质含量低于阈值的变化检测免疫印迹或核糖核酸酶的保护。这似乎是最有可能的解释,特别是针对事实在17.2这寡核苷酸的比较自由分析更加有效地诱导细胞核糖核酸酶H Ki-ras mRNA的乳沟。其他不太可能的解释包括瞬态早期蛋白表达减少遗漏,造成影响的前体介导反义行动对其他mrna通过与Ki-ras部分互补反义寡核苷酸,或者通过non-antisense抗增殖作用生成机制。gydF4y2Ba

    所有这些数据支持论点的RNA结构目标区域可以影响寡核苷酸功效,如我们的模型的寡核苷酸的3′倾斜最有效的寡核苷酸突变特别无效而倾斜5′点突变。当种植RNA,越活跃寡核苷酸绑定网站包括阀杆循环带着点突变,一个相邻的干细胞循环,这些结构之间的连接。相比之下,最不活跃的分子是局限于阀杆循环带着点突变。gydF4y2Ba

    毫无疑问,针对一个点突变是可能的。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33-39gydF4y2Ba没有之前的研究试图Ki-ras突变系统的目标,尽管两个研究使用了两种寡核苷酸随机目标Ki-ras突变及其结果加重我们的发现。一个用17 mer反义目标甘氨酸,丝氨酸12 Ki-ras密码子突变。gydF4y2Ba40gydF4y2Ba4μM IC反义特定抗增殖效果gydF4y2Ba50gydF4y2Ba证明,但在集成电路吗gydF4y2Ba50gydF4y2Ba没有明显减少Ki-ras蛋白表达,这是实现只有通过多次给药高剂量。第二项研究gydF4y2Ba41gydF4y2Ba用16 mer目标12缬氨酸密码子突变,但发现它没有反义相关剂量200μM活动。这寡核苷酸相当于我们的寡核苷酸16.2我们还发现无效的。gydF4y2Ba

    总之,优化反义活动需要屏幕不同序列的寡核苷酸的活动。有必要引起效果是否由于非特异性行为或特定的反义活动。在这些一系列的实验,分子被发现似乎有更大的活动,增加了其目标特异性。然而,我们也使用现有骨干化学表明,针对密码子12是困难而寡核苷酸指向一个网站更容易引起预期的大幅减少表达式。的缺陷已被确认Ki-ras介导途径在早期直肠癌的95%,但包括Ki-ras本身的突变在只有40%的肿瘤,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba针对一个可访问的网站可能是一个更实际的方法。另一种方法将寡核苷酸链化学反应能力的发展不稳定在密码子12 RNA结构。基本原理的突变蛋白的临床意义和目标是圣杯避免非特异性毒性仍然应该大力推进改革。gydF4y2Ba

    确认gydF4y2Ba

    HJN Andreyev由英国消化基金会(现在消化疾病基金会)。PA克拉克和PJ罗斯是由癌症研究活动(批准号SP2330和SP2388/0101)。我们还要感谢Francesco Distefano-Brown更多宝贵的技术援助和安迪·诺曼博士优秀统计的建议。gydF4y2Ba

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    脚注gydF4y2Ba

    • ↵gydF4y2Ba*gydF4y2Ba这两个作者的贡献同样这个手稿。gydF4y2Ba