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摘要
背景结肠黏膜上皮细胞增殖和凋亡的改变与结肠癌风险的增加有关。目前尚不清楚这些改变是否代表一种普遍的“磁场缺陷”。
目标分析结肠癌高危和无明显风险受试者结肠细胞增殖和凋亡的节段模式。
方法对15例切除的腺瘤(小于或等于1.5 cm)患者和9例无明显结直肠癌风险的受试者进行了全结肠镜检查。粘膜活检取自右结肠、左结肠和乙状结肠。用溴脱氧尿苷免疫组化法和脱氧尿苷核苷酸末端标记DNA链断裂分别评价隐窝细胞增殖和凋亡。结果分别以总标记指数(TLI)和标记指数(LI)表示结肠隐窝分裂的五个隔室(第四和第五隔室一起评估)的细胞增殖，以凋亡指数(AI)表示细胞凋亡评估。
结果两组细胞增殖均未见明显节段性变异。与对照组相比，腺瘤患者右侧(p>0.05)、左侧(p<0.005)和乙状结肠(p<0.05)段的TLIs较高，隐窝室(1室，p<0.01;2室，p<0.005;3室，p<0.001;4 ~ 5室，p<0.01)。对照组各节段AIs相似，但腺瘤患者左结肠和乙状结肠AIs低于其右结肠指数(p<0.05, p<0.05)，对照组相应值(p<0.01, p<0.05)。
结论既往腺瘤患者结肠黏膜呈弥漫性增生，远端有异常分布的增殖细胞，凋亡明显减少。这些变化代表了恶性肿瘤的重大风险，并可能解释了左半结肠肿瘤的高患病率。
- 细胞增殖
- 细胞凋亡
- 结肠癌风险
本文中使用的缩写
- ACF
- 异常的隐窝病灶
- 人工智能
- 凋亡指数
- APC
- 腺瘤性大肠息肉病
- BrdU
- 溴脱氧尿苷
- BSA
- 牛血清白蛋白
- 轻拍
- diaminobenzidine
- dUTP
- 三磷酸脱氧尿苷
- HNPCC
- 遗传性非息肉病性结直肠癌
- 李
- 标签索引
- 美国公共电视台
- 磷酸盐缓冲盐水
- 挂钩
- 聚乙二醇溶液
- 负2
- 末端脱氧核苷酸转移酶
- TLI
- 标签总指数
- TUNEL
- TdT介导dutp -生物素缺口末端标记
数据来自Altmetric.com
从正常结肠上皮细胞到癌症的进展涉及到遗传改变的积累，逐渐导致一系列具有不同生物学特征和形态学方面的表型阶段的发展。1在结直肠癌的致癌级联中，最早的事件之一是结肠直肠腺体内细胞增殖的紊乱。2在易患结肠癌的患者(如散发腺瘤患者)的表面正常黏膜中，已描述了沿结肠隐窝长度的复制细胞的过度增殖和异常分布。3 - 8
然而，这些腺体中的细胞更新不仅包括增殖，还包括细胞损失。细胞凋亡是细胞丢失的生理机制，是由复杂的遗传信号网络调控的程序性细胞死亡。在细胞复制的平衡中，细胞凋亡有助于维持正常的组织稳态。9日至15日
上皮细胞凋亡率的改变被认为在结直肠癌的发生中起着重要作用。在结直肠上皮细胞向癌转化过程中，细胞凋亡被逐步抑制。16日至18日p53基因和bcl-2家族(最著名的参与调节上皮细胞凋亡的基因)的表达也随着组织经历正常黏膜、腺瘤和癌的连续阶段而逐渐改变。17，月19 - 21日
这些发现表明，隐窝上皮细胞增殖和凋亡之间的生理平衡的丧失发生在结肠癌发生的早期阶段。这些人类结肠隐窝动力学模式的改变，是否作为一种“全域缺陷”，存在于癌症发展高风险受试者的整个结肠黏膜中，22或者它们是否在结肠的某些部位更明显，而不是其他部位，目前尚不清楚。体外实验3.H胸苷标记技术，Terpstra和同事23发现在小腺瘤患者中，结肠近端细胞增殖率略高于远端。相比之下，在大腺瘤或癌症患者或健康对照组中，没有明显的部位相关差异。因此，这些作者得出结论，从结肠的一个区域采集的粘膜活检标本可以安全地被认为是整个结肠的代表。然而Ponz de Leon和他的同事，6使用同样的离体技术，发现在内窥镜下正常且个人和家族病史为结直肠肿瘤阴性的个体中，盲肠的增殖率低于其他节段，但他们的报告没有提供结肠癌高风险受试者节段变异的比较数据。Kubben及其同事的研究24基于增殖细胞核抗原或溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)免疫组化发现，在无结肠器质性疾病的受试者中，增殖指数沿结肠从右向左逐渐降低。在另一项研究中，使用隐窝细胞生产速率来评估健康人的细胞增殖，发现盲肠中的细胞周转率高于结肠中的任何其他部位。25最近，刘和同事26使用Ki-67抗原的Mib-1抗体检测细胞增殖模式，通过DNA链断裂的末端脱氧尿苷核苷酸划痕末端标记(TUNEL)和Bak的免疫组化(多克隆抗血清)检测细胞凋亡，Bak是Bcl-2同源物，与上皮细胞凋亡位点共定位27贯穿整个正常人类结肠的长度。虽然他们没有发现细胞增殖的节段相关差异，但右结肠中经历Bak介导的细胞凋亡的上皮细胞数量低于左结肠或直肠。
在本研究中，我们评估了一组有大型散发性腺瘤病史的患者结肠不同节段表面正常黏膜的细胞增殖和凋亡情况。这项研究的目的是确定这两种生物现象之间的平衡的丧失是否可以在整个结肠粘膜中检测到，代表一种在致癌级联早期发生的普遍表型变化。
方法
研究设计
这项研究得到了罗马天主教大学医学院伦理委员会的批准。所有研究过程均获得研究参与者的知情书面同意。
高风险研究人群最初由18例患者组成，他们接受了内窥镜息肉切除术，切除了一个或多个直径大于1.5 cm的散发性结直肠腺瘤。息肉切除术后，他们参加了由罗马三大医院(天主教大学内科和外科以及新里贾纳·玛格丽特医院和圣贾科莫医院的内窥镜科)管理的结肠腺瘤患者监测方案。监测方案规定在息肉切除术后6-12个月进行全肠镜检查，以确认没有新的息肉(清洁结肠结肠镜检查)。本研究的招募仅限于大腺瘤患者，试图获得具有同质证实风险水平的人群。28，29排除标准包括家族史提示家族性腺瘤性息肉病或遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)、炎症性肠病、既往结直肠手术、当前代谢性或危及生命的疾病、凝血缺陷和/或怀孕。
对照组的13名受试者年龄在45岁以上，从上述中心的人群中选择，进行结肠镜筛查以预防结肠癌。对照组的排除标准包括所有高危人群以及不存在结肠癌的临床和家族性危险因素。
为了尽量减少可能影响结肠隐窝细胞动力学的特定成分的摄入量差异，在研究开始前20天，所有31名受试者都被安排在平均热量摄入量为2200千卡/天的标准饮食中。在此期间结束时，根据饮食日记的评估确定了饮食依从性，并规定了一种标准制剂，包括口服聚乙二醇溶液(PEG 4000;意大利米兰的Isocolan-Bracco)。该溶液的平均总液体摄入量为3.5-4升，(每升)含有59克聚乙二醇、5.7克硫酸钠、1.7克碳酸氢钠、1.5克氯化钠和0.7克氯化钾。
第二天早上0800 - 1200之间进行了全结肠镜检查(清洁结肠结肠镜检查)。在腺瘤组，息肉切除和研究检查之间的平均间隔为9个月。在筛查结肠镜检查期间进行检查的13名对照受试者中，有2人出现内镜异常，因此被排除在其余研究之外。
使用直径为2.8 mm的活检钳(FB 24U-1 Olympus, Tokyo, Japan)，我们从其余29名受试者(18名腺瘤患者，11名对照组)中各收集了12份扁平粘膜样本。(高数量的活检是必要的，以确保有足够数量的定向良好的隐窝进行免疫组织化学分析)。活检部位如下:右结肠(盲肠至脾屈)4例，左结肠(脾屈至乙状结肠下行交界)4例，直肠乙状窦束(乙状结肠下行交界至直肠)4例。每个部位的两个标本被用于细胞增殖研究，另外两个用于评估细胞凋亡。活检后立即将标本仔细放置在滤纸上，以保持隐窝的正确方向。
细胞增殖和凋亡的免疫组化
采用BrdU免疫组化方法评估结肠隐窝细胞增殖模式。如前所述，使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)生物素缺口末端标记(TUNEL)对DNA链断裂进行评估30.．简而言之，对每个受试者进行了以下分析程序:
细胞增殖研究
收集后，立即将6个扁平粘膜活检标本(每个结肠节段各2个)放置在装有补充Hepes-的RPMI 1640培养基的无菌中隔安装小瓶中l-谷氨酰胺(Gibco，佩斯利，苏格兰)和5-溴-2-脱氧尿苷3毫米(Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州，美国)。95% O的混合物25% CO2通过隔膜注射，直到小瓶内的压力为3atm。然后将小瓶在37°C的震荡水浴中孵育90分钟。标本用4℃生理盐水溶液四次更换清洗，70%乙醇固定过夜，石蜡包埋。结合BrdU的免疫组化检测基于链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合物法(italscientiica, Genoa, Italy)。在组织切片(3 μm)中，用2种二甲苯溶液清除石蜡，并在分级的乙醇和水中再水化。将组织浸泡在3% H中可阻断内源性过氧化物酶活性2O2在磷酸盐缓冲盐水(PBS) (pH值7.4)中在室温下浸泡5分钟。DNA变性是通过在37°C下加入2 N HCl 30分钟获得的。洗涤后，加入1%的牛血清白蛋白(BSA)以减少背景染色。切片在室温下用PBS 1:100稀释的单克隆抗brdu抗体(Ylem, Avezzano, Italy)孵育60分钟。洗净后，切片在室温下与链霉亲和素生物素化辣根过氧化物酶复合物孵育45分钟。最后，在室温下加入二氨基联苯胺(DAB) 5分钟，观察免疫反应。用苏木精弱反染色10秒。经上述处理而不含抗brdu抗体的玻片作为阴性对照。
细胞凋亡的研究
每个研究对象的6个扁平粘膜活检标本(每个结肠节段各2个)在4℃的4%中性缓冲多聚甲醛中固定过夜，并用石蜡包埋。对于凋亡细胞的原位检测，由Gavrieli及其同事描述的TUNEL方法31使用时稍加修改。这项技术能够检测含有DNA链断裂的细胞。标准脱蜡后，切片用20 μg/ml蛋白酶K (Boeringher Mannheim, Germany)在室温下消化15分钟。内源性过氧化物酶活性被H2O2在室温下浸泡5分钟。洗净后，将载玻片放入含有TdT缓冲液1×， CoCl的平衡缓冲液中2在平衡缓冲液中加入0.3 U/μl TdT酶和5 μM生物素- dutp (Boehringer)得到的反应溶液(37℃)中，在室温下1× (Boeringher)反应5分钟。反应在60分钟后停止。清洗标本，应用2% BSA减少背景染色。用链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物在室温下孵育45分钟后检测到合并的生物素- dutp，并使用DAB反应来观察标记的细胞。苏木精敷10秒以产生微弱的反染色。对于每组玻片，大鼠胸腺组织切片(已知含有大量凋亡细胞)作为阳性对照。阴性对照为结肠黏膜样品，未培养TdT酶和生物素- dutp。
样品合格性和定量
我们的分析仅限于那些整个长度可以完全可视化的地穴。只选择定向良好的隐窝(理想情况下是那些基底与粘膜肌层接触的隐窝)进行分析。如果隐窝违反U型标准或有多层基底，也排除在分析之外。对于每个受试者，从结肠的每个区域至少检查20个隐窝柱。所有载玻片均由同一检查者(AA)在显微镜下进行评估，该检查者不知道标本的来源(包括组和结肠段)。
在细胞增殖研究中，BrdU染色的细胞在×1000倍率下被识别和计数(图2)1)．对于每个隐窝列(hemicrypt)，我们记录总细胞数，以及标记细胞的数量和位置。标记细胞与总细胞的比例以百分比表示，并记录为增殖的总标记指数(TLI)。为了评估隐窝内增殖细胞的分布，每个柱从基底(室1)到腺体口(室5)被分为5个隔室，并计算每个隔室的标记指数(LI)。由于隐窝上部的标记细胞数量通常很低，因此计算第4和第5隔间(隔间4 - 5 LI)的单个LI。34
人结肠隐窝溴脱氧尿苷免疫组化研究。棕色染色细胞(复制细胞)大多位于腺体基部。原始放大×200。
对于细胞凋亡的研究，根据用于细胞增殖研究的相同标准选择切片并进行分析。沿着隐窝柱识别TUNEL染色细胞，并在×1000倍率下计数。正常情况下，凋亡细胞在结肠的腺上皮中是罕见的13大部分都位于地窖的上部14，18(图2)．因此，细胞凋亡的LI仅计算隐窝作为一个整体(AI:凋亡指数，即标记的细胞数量与列中计数的细胞总数的比率)。Moss及其同事描述，为了尽量减少人工制品造成的错误，通过将每个切片与苏木精-伊红染色的相邻切片进行比较，将坏死区域从TUNEL标记的细胞计数中排除。18
使用TdT介导的dutp -生物素缺口末端标记(TUNEL)方法检测人结肠隐窝上部的凋亡上皮细胞(箭头)原始放大×200。
对于每个受试者，我们计算了TLI、四个腔室中的每一个的平均值，以及三个结肠段中的每一个和整个结肠的AI的平均值。后一个参数代表了一个特定患者的所有隐窝检查的平均值。然后计算节段和全结肠指数的组均值。
统计分析
数据以组均值(SEM)表示。使用Mann-Whitney U检验评估患者与对照组之间的差异。采用单因素方差分析(ANOVA)评估组间均数差异的统计学意义。p值<0.05被认为是显著的。当方差分析出现显著差异时，采用Bonferroni检验进行事后多重比较。
结果
两组中所有受试者对标准饮食的坚持被认为是令人满意的。腺瘤组18例患者中的3例和其余11例对照组中的2例后来被排除在分析之外，因为他们的组织学切片中隐窝数量过多，不符合上述标准。分析了15例腺瘤患者和9例对照组的完整数据(即所有三个结肠节段的TLI、腔室LIs和AI)。两组的概况见表1．
扩散的研究
细胞增殖研究数据见表2．两组中任何结肠节段的隐窝平均长度(以每隐窝柱的细胞数表示)均无显著变化，且任何给定节段(息肉组)均无显著组间差异v控制:54.1 (2.5)v右冒号55.8 (1.7);57.1 (2.1)v左冒号55.6 (1.8);53.1 (1.9)v乙状结肠58.3例(2.01例)。
腺瘤组全结肠TLI平均值(8.2(0.3))明显高于对照组(5.3 (0.2);p < 0.0001)。对于1、2、3和4-5区室的整个结肠LIs也是如此。所有腺瘤患者全结肠TLIs >7.0，而每个对照的相应值均< 7.0(数据未显示)。腺瘤组三个结肠节段的平均TLIs也显著高于腺瘤组，这也是两组在整个结肠中存在显著差异的原因。
相比之下，对隐窝内增殖细胞分布的分析显示，两组之间仅在左结肠存在统计学上的显著差异。与对照组相比，腺瘤组1室的左结肠LIs显著升高(17.7(1.3))。v11.8 (0.4)， p<0.01)， 2区(20.5 (1.1)v．8.1 (1.7);P <0.005)，第三区(6.9 (1.5)v0.0 (0);P <0.001)， 4-5区(0.9 (0.3)v0.0 (0);p < 0.01)。
两组TLIs均无明显节段性变化。区室LIs的分段分析显示两组间室3有显著差异。在息肉组中，该隔室的右结肠LI高于左结肠(p=ns)和直肠乙状结肠段(p<0.05)，但仅后者有显著性差异。对照组右结肠腔室3li显著高于左结肠(p<0.05)和直肠乙状结肠段(p<0.05)。然而，在这种情况下，远端结肠区3室的增殖明显多于左侧结肠(p<0.05)。在两组中，其他隔室的LIs在整个结肠长度内基本相同。
细胞凋亡的研究
在腺瘤组和对照组中，TUNEL阳性细胞多在隐窝上部靠近表面上皮边界处。在结肠的所有节段都观察到这种模式。
腺瘤组平均全结肠AI明显低于对照组(1.4(0.1))。v2.7 (0.2);p < 0.0001)。比较各组间的分段指标(图3.)，对照组值之间无差异(右冒号2.6 (0.2);左冒号2.7 (0.3);而腺瘤组左结肠和乙状结肠的AIs均明显低于右结肠(左结肠v右冒号1.2 (0.1)v2.1 (0.2) (p<0.05);乙状结肠直肠v右冒号1.03 (0.1)v2.1 (0.2) (p<0.05))。腺瘤组左结肠、乙状结肠指标均明显低于对照组相应节段指标(左结肠1.2 (0.1)v2.7 (0.3) (p<0.01);乙状结肠1.03 (0.1)v2.9 (0.5) (p<0.05))。
腺瘤患者和对照组结肠三个节段凋亡指标的分布。横柱表示组均值(SEM)。
讨论
在本研究中，我们比较了有(即先前切除的大腺瘤)和没有已知结肠癌危险因素的患者的上皮细胞增殖模式和凋亡。从结肠的三个节段收集粘膜活检，以确定可能观察到的任何改变的局部或弥漫性。
体外BrdU免疫组化检测S期细胞，这是人类细胞增殖研究的标准技术，7，33在高危组(相对于对照组)中显示了普遍的过度增殖状态。过度增生表现为全结肠TLIs显著升高，隐窝上部隔室(3和4-5)标记细胞数量异常高。后者的变化主要是由于在全结肠LIs中观察到的所有隔室的统计学上显著的组间差异。这些发现证实了以前的报道。23，34
关于结肠不同部位的正常增殖模式(即在没有已知结肠癌危险因素的患者中观察到的增殖模式)已发表了相互矛盾的报告。6，24，25这种差异可能反映了在细胞增殖研究中使用的不同技术，以及被检查对象的遗传背景和饮食习惯。例如，即使饮食中多不饱和脂肪/饱和脂肪比例的短期变化也可以改变结肠的上皮动力学模式。32为我们的受试者规定的研究前饮食应该将这种类型的影响降至最低。
在我们的两个研究组中，TLIs没有显著的节段性变化。这些观察结果与Roncucci及其同事的观察结果一致。34Terpstra和同事23发现腺瘤< 1cm患者的TLIs存在区域内差异，而有大腺瘤(> 1cm)病史的患者则无差异。格林和同事35报告了在HNPCC携带突变风险为50%的患者中，整个结肠呈显著线性趋势，升结肠中TLIs最高，直肠中TLIs最低。这些结果表明，不同的结肠癌危险因素(例如，小或大的腺瘤，家族性易感性)可能与结肠粘膜中不同的细胞增殖模式有关。如果是这样的话，在这方面具有异质性的高风险人群中进行的研究预计将产生模棱两可的结果，这可能解释了以前发表的数据中的一些差异。因此，我们选择了基于大腺瘤性息肉病史的高危患者，排除了可能反映遗传综合征的结肠癌家族史的患者。
对照组右结肠标本平均腔室3li明显高于左结肠和乙状结肠标本;腺瘤组也有类似的差异。造成这种区域差异的原因尚不清楚，但可能是这段结肠腔内特定微环境的结果(菌群、浓度、胆汁酸质量等)。隐窝室3内增殖的意义是一个有争议的问题6，34，35但是我们和其他调查人员6，34我们认为，这一发现代表了隐窝底部(1室和2室)的“正常”增殖室的扩张。即使这种扩张没有延伸到隐窝口(4-5室)，这个中间室的未分化细胞可能比位于1室和2室的细胞更容易受到各种腔内因素的影响。
我们的研究结果表明，在大腺瘤患者中，正常的节段到节段的增殖模式基本被保留，尽管增殖率本身明显高于平均风险受试者。隐窝内增殖细胞的分布也有明显的变化，这在左结肠中尤其明显，这种变化意味着突变事件的额外风险，因为隐窝口处高度脆弱的非分化细胞更容易暴露于腔内因子。
在这两组中，对整个结肠细胞凋亡的研究得出了有趣的结果。在对照组受试者中，我们发现不同部分的人工智能没有显著变化。这一发现与刘及其同事最近报道的结果形成了鲜明对比26在平均风险受试者中，他们发现右结肠中TUNEL阳性(凋亡)细胞少于左结肠或直肠。造成这种差异的原因尚不清楚。这些作者还报道了TUNEL阳性细胞的百分比与Bak的表达之间的强相关性，Bak是一种促凋亡蛋白，被认为是肠上皮细胞程序性死亡的主要内源性启动子。27在我们看来，这种相关性增加了他们发现的可信度。因此，我们在对照组中没有观察到任何节段性变化的事实可能是该组中包含的受试者数量较少的结果。
然而，我们研究中腺瘤组的数据值得特别关注。左结肠和直肠乙状结肠段的AIs较右结肠明显降低，也明显低于对照组相应值。许多动物和人类的研究表明，结肠隐窝内凋亡活性的调控不当在结肠癌的发生中起着重要作用。17，18，21，22，36-38我们已经证明，在我们检查的高风险人群中，这种失调(表现为凋亡率降低)是一种弥漫性现象，涉及结肠左侧明显正常的黏膜。
上述上皮隐窝细胞周转的变化提出了一个问题，即这些特征是在结肠癌发生的多阶段过程早期发生的真正表型改变的表达，还是它们代表了对各种腔内因素的非特异性反应。在Fearon和Vogelstein提出的模型中，2过度增殖的状态被认为先于肿瘤开始，但这一概念最近受到了质疑。35，39一些研究人员认为，这些变化是一个非特异性的发现，反映了饮食、药物、年龄或方法缺陷等因素的影响。为了支持这一点，格林和同事们35研究表明HNPCC患者正常黏膜的体细胞突变率没有增加。40然而，在家族性腺瘤性息肉病和克罗恩病中，非肿瘤性结直肠黏膜中干细胞体细胞突变的增加已被描述。41在后一种疾病中，体细胞突变的积累归因于与结肠炎症变化相关的再生上皮细胞增殖的增加40，41和/或用已知的诱变剂(例如硫唑嘌呤)治疗，40一些人认为它与这些患者患结肠癌的风险增加有关。40再次，这些差异表明不同的危险因素(遗传和获得性)与非肿瘤性结肠粘膜突变的不同风险水平相关。在这种情况下，在腺瘤患者中发现的增殖的普遍改变似乎可能会增加结肠粘膜细胞突变的可能性。
我们发现腺瘤患者左结肠细胞凋亡减少将进一步破坏该区域上皮细胞更新的稳态平衡，也可能增加黏膜的遗传不稳定性。加瓦尔和他的同事42发现与正常对照组和小息肉患者相比，胆汁酸诱导的正常出现的癌症患者直肠黏膜凋亡减少。他们假设，在一生中持续暴露于致癌物可能会导致具有有效凋亡机制的细胞逐渐清除，生存选择和抗凋亡克隆的积累，这将为癌症的发展提供一个领域。有趣的是，在3例具有不同高危情况的非癌症患者(表现为大体正常黏膜的腺瘤性改变、结直肠癌家族史、大管状绒毛腺瘤史)中也发现了相同程度的细胞凋亡减少。
目前尚不清楚为什么只有腺瘤患者的左结肠细胞凋亡显著减少。这和我们观察到的其他节段差异似乎支持这样的假设，即环境因素在改变这些患者的腺上皮转换中起着重要作用。在动物模型中，脂肪含量相对较高的西式饮食诱导了细胞凋亡的短暂但弥漫性激活，随后是结肠隐窝中部凋亡细胞的显著耗尽和含有非典型细胞核的上皮细胞群的扩张。长期保持这些饮食的小鼠会出现单侧隐窝发育不良病变。36不管有大腺瘤病史的患者结肠黏膜上皮隐泡细胞生死序列改变的确切机制是什么，这些改变在癌变方面的影响可能与它们的持久性有关。
另一个有趣的点是结肠上皮细胞动力学变化和异常隐窝灶(ACF)之间的关系，ACF被认为是息肉和癌症的显微前体。43-47在结直肠癌患者中，在结肠各节段的正常黏膜中观察到成百上千的acf。45，48这些病灶中只有少数会发展为腺瘤或癌:大多数从未达到宏观尺寸，许多甚至会消退。49尽管如此，它们的广泛分布表明，在结直肠癌患者中，整个结肠的正常黏膜呈现形态变化，并有可能在致癌途径中向更晚期发展。
涉及APC基因的突变被认为是结直肠癌发展的最早事件之一。1，50，51该基因被认为通过抑制细胞生长和调节上皮细胞凋亡发挥其主要功能之一。38然而，虽然APC体细胞突变可能导致ACF向腺瘤的进展，但它们似乎不参与正常黏膜向ACF的转变。39，49，52因此，其他分子和生物事件必然是ACF发生的原因。
上皮细胞动力学在ACF中发生了深刻的改变。53-56在喂食胆酸的大鼠中，偶氮甲烷诱导的ACF内的上皮细胞表现出抗凋亡性，隐窝本身的细胞数量高于正常，特别是中间部分(+ 25-40%)。57ACF中这种细胞更新不平衡的重要性也出现在化学预防化学诱导致癌的实验中。各种假定的化学预防剂已被证明通过降低细胞增殖、增强凋亡和降低ACF密度来发挥其保护作用。58 - 61有趣的是，在结直肠癌患者中，从右到左结肠的ACFs密度似乎增加了，45，48，62这与我们在腺瘤患者中观察到的隐窝细胞转换改变的一般从右向左的趋势相一致。这种相似性提高了细胞增殖和凋亡率之间平衡的丧失与ACFs的发展之间的关系(因果关系?)的可能性。
正如我们在研究中观察到的那样，发现一大片粘膜中含有具有高增殖倾向和降低凋亡活性的腺体，这一事实支持了“野区癌变假说”。22根据这一理论，粘膜长期暴露于致癌物中会导致结肠大片区域的弥漫性生物异常，最终会产生癌症。同样值得注意的是，我们高危组的细胞增殖和凋亡之间的严重不平衡定位于大多数结肠恶性肿瘤发生的左结肠。63，64
许多研究者发现，凋亡细胞的正态分布在腺瘤组织中是相反的36，37，65其特征是隐窝底部的这些细胞密度异常高。在我们的研究中，在腺瘤对照组和患者中，TUNEL阳性细胞普遍存在于隐窝靠近表面上皮的上部。这一观察结果表明，在高危患者表面健康的黏膜中，尽管细胞增殖与凋亡的平衡发生了深刻的改变，但正常的凋亡细胞迁移模式仍被保留。
使用原位末端标记技术检测肠道中的凋亡细胞和凋亡指数来测量这一现象已经受到一些作者的批评66他们认为这种方法不能充分区分坏死细胞和凋亡细胞。67 - 69然而，当可以合理地排除坏死时，TUNEL阳性通常被认为是细胞正在或即将发生凋亡的指示，67，69其检测人结肠黏膜凋亡细胞的敏感性已被多个研究小组证实。18，26，65
总之，我们的研究结果表明，在低风险受试者和既往切除结肠腺瘤患者的整个结肠长度中，上皮细胞动力学是相当一致的。然而，与前一组相比，高危患者在结肠各节段的增殖率更高，在左结肠，隐窝内复制细胞的正态分布明显改变。在这些患者中，与同一组的右结肠和对照组的整个结肠相比，左结肠的凋亡也明显减少。这些发现表明，在有结肠癌风险的受试者中，细胞增殖和凋亡的弥漫性改变作为一种全身性异常沿结肠发生，特别是在左半部分，增殖和程序性细胞死亡之间的深刻不平衡可能是该区域恶性肿瘤高发的原因。
致谢
作者感谢亚历山德罗·里内利的技术援助和玛丽安·肯特在翻译和编辑手稿方面的帮助。本研究得到了国家Ricerche (CNR) No 96.02998的部分资助。CT04, 1996年。这项研究的初步结果于1997年在华盛顿特区举行的第97届美国胃肠病协会年会上发表。
本文中使用的缩写
- ACF
- 异常的隐窝病灶
- 人工智能
- 凋亡指数
- APC
- 腺瘤性大肠息肉病
- BrdU
- 溴脱氧尿苷
- BSA
- 牛血清白蛋白
- 轻拍
- diaminobenzidine
- dUTP
- 三磷酸脱氧尿苷
- HNPCC
- 遗传性非息肉病性结直肠癌
- 李
- 标签索引
- 美国公共电视台
- 磷酸盐缓冲盐水
- 挂钩
- 聚乙二醇溶液
- 负2
- 末端脱氧核苷酸转移酶
- TLI
- 标签总指数
- TUNEL
- TdT介导dutp -生物素缺口末端标记