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结肠直肠癌
e -钙粘蛋白基因启动子区高甲基化(背景)与散发性和溃疡性结肠炎相关的结直肠癌
免费的
  1. J M D Wheeler__，一个，b，
  2. 金H C__，一个，
  3. J A埃夫斯塔西乌__，一个，
  4. M伊卜拉欣-一个，
  5. N J McC莫滕森b，
  6. W F博德默一个
  1. 一个英国牛津大学约翰拉德克里夫医院分子医学研究所，帝国癌症研究基金癌症与免疫遗传学实验室，OX3 9DSb英国牛津大学约翰拉德克里夫医院结直肠外科
  1. J M D Wheeler。wheelerj在{}icrf.icnet.uk

摘要

背景溃疡性结肠炎相关结直肠癌(UCACRC)与散发性结直肠癌(SCRC)有一些不同的临床病理和遗传特征。e -钙粘蛋白基因的高甲基化(背景)在结直肠癌中未见报道。

目标研究了一组SCRC和UCACRC的突变背景的启动子区高甲基化背景．

研究对象与方法14例UCACRC患者和14例SCRC患者均可获得DNA。所有外显子背景经聚合酶链反应(PCR)扩增，单链构象多态性和直接测序进行筛选。的超甲基化背景亚硫酸盐修饰后，通过甲基化特异性PCR检测启动子区，并与之前免疫组化研究中E-cadherin蛋白的表达进行比较。

结果28例癌症中有13例(46%)的高甲基化背景启动子区域——UCACRC组有8种癌症(57%)，SCRC组有5种癌症(36%)(NS)——这与E-cadherin表达降低相关(p<0.05)。甲基化有与癌症晚期相关的趋势，尽管这没有达到统计学意义。没有突变背景在两组中都有一些多态性。

结论我们已经证明了启动子区域的超甲基化背景在46%的结直肠癌中。UCACRC组和SCRC组之间没有差异。正如UCACRC和SCRC之间的遗传变化存在特定差异一样，这些癌症的遗传途径也可能存在很大程度的重叠。

  • 甲基化
  • 启动子区域
  • 钙粘蛋白(背景)
  • 溃疡性结肠炎
  • 结肠直肠癌

  • 本文中使用的缩写

    UCACRC
    结直肠癌相关溃疡性结肠炎
    公司
    散发性结直肠癌
    r
    复制错误
    聚合酶链反应
    聚合酶链反应
    SSCP
    单链构象多态性

    • http://dx.doi.org/10.1136/gut.48.3.367

    数据来自Altmetric.com

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      癌的发生被广泛认为是一个多步骤的过程。1在每一步中，遗传或表观遗传改变发生，并可使肿瘤细胞具有选择性优势，以扩大其通过体细胞水平的独立过程进化的克隆。1，2结直肠癌在表现年龄、部位、组织学和预后方面存在差异。由于腺瘤到癌的过程伴随着遗传事件，3.不同类型的结直肠癌的发病机制中涉及的遗传途径可能存在差异。

      溃疡性结肠炎的癌症风险增加是有据可查的，与疾病持续时间长和发病年龄早直接相关。4，5与散发性结直肠癌(SCRC)相比，溃疡性结肠炎相关结直肠癌(UCACRC)具有几种不同的临床病理特征。它们通常由扁平发育不良或畸形相关病变或肿块引起，而SCRC通常由腺瘤性息肉引起。UCACRC通常发生在较早的年龄，沿整个结肠分布相对均匀，并且通常具有间变性或粘液表型。这些差异使观察者认为UCACRC和SCRC之间的遗传途径存在差异。尽管基因突变APC，k -,TP53在UCACRC和SCRC中都很常见，但这些基因的突变频率在UCACRC中较低。6 - 8p16和Bcl-2表达的差异也暗示了不同的癌变途径。9，10

      恶性肿瘤的特征之一是侵袭间质和周围组织。与肿瘤侵袭过程有关的分子之一是钙粘蛋白(E-cadherin)2 +依赖细胞-细胞粘附分子。在正常上皮细胞中，E-cadherin位于基底外膜上，沿着隐窝的整个长度，在上皮组织的发育和维持中起着重要的作用。11e -钙粘蛋白被编码背景该基因位于染色体16q22上。在细胞质中，e -钙粘蛋白结合几种底层蛋白:α和β-catenin，以及γ-catenin/ plakhb，通过它们连接到肌动蛋白的细胞骨架。12，13此外，E-cadherin可能通过与APC竞争与β-catenin的结合而影响β-catenin相关的细胞内信号通路。14在发炎组织中，E-cadherin的表达减少，以确保细胞的流动性和溃疡的愈合。这种现象在溃疡性结肠炎和克罗恩病等炎症性肠疾病中有很好的描述。15E-cadherin表达和功能的丧失与结直肠癌的分化丧失和侵袭性增加有关。16

      e -钙粘蛋白基因(背景)在上皮细胞中被认为是一种肿瘤侵袭/抑制因子，在许多上皮性癌症中，包括小叶性乳腺癌和弥漫性胃癌中，已经描述了突变。17，18最近，失活突变背景已在人类结直肠癌细胞系中被描述。19在癌症启动子区域的高甲基化已经被描述为许多基因，如p16，20.，21VHL，22而且hMLH123，24并且通常与癌症中相应蛋白质的缺乏表达有关。也有研究表明，E-cadherin的表达是沉默的高甲基化背景启动子区域在许多肿瘤中，包括乳腺癌、前列腺癌和肝细胞癌。25日- 27日

      在本研究中，我们通过研究UCACRCs与SCRCs的突变发生率是否存在差异，寻求UCACRCs可能沿着与SCRCs不同的途径发展的额外证据背景启动子区在UCACRC和SCRC之间的超甲基化。

      材料与方法

      从英国牛津帝国癌症研究基金会的档案中获取了14个无结直肠癌家族史的ucacrc和14个SCRCs的DNA。

      复制错误(RER)状态是通过荧光标记引物和聚合酶链式反应(PCR)条件下扩增BAT26和BAT25来确定的，如前所述。28，29将2 μl PCR产物与0.5 μl Rox标准品和1 μl甲酰胺加载缓冲液混合，热变性，冰淬，然后用377 Prism荧光半自动测序仪(应用生物系统公司，Norwalk, Connecticut, USA)在6%丙烯酰胺测序凝胶上电泳。使用Genescan 2.02软件(perkins - elmer, Norwalk, Connecticut, USA)分析结果。所有pcr均重复进行，那些为RER+的肿瘤使用CA重复标记物进行确认D16S520而且D5S404。

      聚合酶链反应和单链构象多态性(pcr-sscp)分析

      所有的16个外显子背景使用先前发表的引物进行扩增。17所有反应在总体积50 μl中进行，最终反应浓度为1×标准PCR缓冲液(Promega, Madison, Wisconsin, USA)， 200 μM dNTPs, 1.5 mM Mg，每个引物0.2 μM, 1U Taq聚合酶。由于外显子1中GC核苷酸的含量较高，因此添加了5%的DMSO。扩增子跨越4-5外显子被缩小到适合SSCP的大小，用2u的酶消化PCR产物Rsa在37°C下孵育2小时。按照前面描述的方式执行SSCP。30.将异常带移与来自感兴趣区域的89名随机对照的基因组DNA进行比较(最初为HLA等位基因频率研究收集，由英国牛津的J Bodmer博士提供)。

      直接测序

      如果在SSCP分析中观察到异常带移，则通过直接测序确定核苷酸序列，并使用基于377 Prism荧光的半自动测序仪(应用生物系统公司)分析结果。使用Sequencer 3.0软件将这些序列与已发表的序列进行比较。

      甲基化特异性PCR

      甲基化状态背景如前所述，通过对亚硫酸氢钠化学处理后纯化的基因组DNA进行甲基化特异性PCR来评估启动子区域。22引物序列为“未甲基化”和“甲基化”的甲基化特异性PCR背景启动子区域和PCR条件之前已经描述过。22PCR产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色。以未甲基化的乳腺癌细胞系MDA-MA-468和甲基化的乳腺癌细胞系MDA-MA-231和MDA-MA-435作为对照。25，26所有结果均经重复分析证实。

      统计数据

      两组之间的比较使用Wilcoxon秩和检验，Fisher精确检验或t使用SAS软件测试(v 6.11, SAS Institute Inc.，北卡罗来纳州，美国)。采用Fisher精确检验和χ分析启动子高甲基化与E-cadherin表达降低的关系2测试。

      结果

      临床病理特征

      UCACRC患者的平均年龄小于SCRC患者(p=0.001)。在性别分布、分化、分期或RER状态等其他因素方面，两组间无显著差异(见表2)1)．UCACRC更常见地位于右结肠，尽管这在统计学上不显著。

      查看该表:
      表1

      溃疡性结肠炎相关结直肠癌(UCACRC)和散发性结直肠癌(SCRC)中CDH1启动子区甲基化状态及临床病理特征

      r状态

      1个UCACRC和2个SCRC被发现为RER+(表1)．

      基因变化背景

      UCACRC和SCRC均未发现突变。我们发现了一些多态性，包括内含子的变化，即内含子2、内含子4和内含子12的单碱基取代，以及密码子692的无声变化(GCC→GCT, Ala→Ala)(表2)．所有多态性均存在于杂合子中。内含子2的变化(ctgggt→ctaggt)是一个新的变化，仅存在于UCACRC组。在80个人类随机对照中没有出现这种变化。前面已经描述了所有其他更改。两组间多态性频率差异无统计学意义。

      查看该表:
      表2

      CDH1在溃疡性结肠炎相关结直肠癌(UCACRC)和散发性结直肠癌(SCRC)中的多态性研究

      甲基化状态

      所有28种癌症都显示出至少一个未甲基化等位基因的PCR产物。14个UCACRC中有8个和14个SCRC中有5个显示了甲基化等位基因的PCR产物1)．UCACRC和SCRC的甲基化等位基因频率差异不显著。当所有病例合并分为甲基化组和非甲基化组时，病理分化、分期或RER状态无显著差异(表2)3.)．高甲基化在UCACRC中Duke的C、D发生率为61.5%，SCRC中为46.7%，但差异无统计学意义。

      Silver staining of methylation specific polymerase chain reaction (PCR) products following electrophoresis on an acrylamide gel. Sample pairs 1–6 are from ulcerative colitis associated colorectal cancer (UCACRC), and 7–11 are from sporadic colorectal cancer (SCRC). E-cadherin protein expression is shown as present (+; grade 2/3) or absent (−; grade 0/1). Primer sets used for PCR amplification are designated as unmethylated (U) or methylated (M), and a PCR product is shown as present (+) or absent (−). A PCR product is seen using unmethylated primers in the unmethylated breast cancer cell line, MDA-MA-468, and with methylated primers in the methylated breast cancer cell line, MDA-MA-435 (C=control). Hypermethylation of the promoter region of CDH1 correlated significantly with reduced E-cadherin immunohistochemical expression (Fisher's exact test, p=0.036). The methylated cancers that expressed E-cadherin protein may have been hemimethylated (methylation of one allele) and were therefore still able to express E-cadherin protein.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
      图1

      甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)产物在丙烯酰胺凝胶电泳后的银染色。样本对1-6来自溃疡性结肠炎相关结直肠癌(UCACRC)， 7-11来自散发性结直肠癌(SCRC)。E-cadherin蛋白表达如图所示(+;2/3级)或缺课(−;年级的0/1)。用于PCR扩增的引物组被指定为未甲基化(U)或甲基化(M)， PCR产物显示为存在(+)或不存在(−)。在未甲基化乳腺癌细胞系MDA-MA-468中使用未甲基化引物，在甲基化乳腺癌细胞系MDA-MA-435中使用甲基化引物(C=对照)，可以看到PCR产物。CDH1启动子区高甲基化与E-cadherin免疫组化表达降低显著相关(Fisher精确检验，p=0.036)。表达E-cadherin蛋白的甲基化癌症可能已经半甲基化(一个等位基因的甲基化)，因此仍然能够表达E-cadherin蛋白。

      查看该表:
      表3

      与启动子甲基化相关的临床特征和复制错误(RER)状态

      甲基化状态及其与e-cadherin蛋白表达的关系

      先前对这些样本的免疫组化显示了类似的E-cadherin表达模式(和背景等位基因缺失)。31在之前的研究中，那些膜染色超过25%的肿瘤细胞(2/3级)的病例被认为是E-cadherin表达阳性。将免疫组化数据与相应的数据进行比较背景本研究中的启动子甲基化状态。E-cadherin启动子区高甲基化与E-cadherin免疫组化表达降低显著相关(Fisher精确检验，p=0.036;χ2测试中,p = 0.034)。11个0/1级肿瘤中有8个甲基化，而16个2/3级肿瘤中有11个未甲基化4)．

      查看该表:
      表4

      E-cadherin表达及其与甲基化状态的关系

      讨论

      我们之前描述过突变背景8%的结直肠癌细胞系。19在本研究中，我们未发现任何突变背景在UCACRC或SCRC中，尽管这可能是由于样本数相对较小。先前的突变在RER+细胞系中被描述(33%)，我们的28个样本中只有3个是RER+。然而，我们在相当比例的结直肠癌中检测到启动子区域的高甲基化。虽然，启动子区域的超甲基化背景在80%以上的甲状腺乳头状癌中可见，这与e -钙粘蛋白表达减少有关，32的超甲基化背景只有46%的样本中检测到启动子。57%的UCACRC和36%的SCRC是高甲基化的，但这种差异没有统计学意义。具有高甲基化启动子区的肿瘤没有不同的临床病理特征，如晚期或分化差。然而，高甲基化背景启动子与E-cadherin蛋白表达减少或缺失显著相关(p=0.036)。的超甲基化背景启动子在人类结直肠癌中未见报道。Yoshiura和同事33研究了一组人类癌细胞系。然而，只有一个细胞系(SW1116)起源于结肠，在结肠中被发现未甲基化背景启动子和表达E-cadherin mRNA。

      其他研究表明，启动子区域的超甲基化背景前列腺癌、乳腺癌和肝细胞癌与蛋白表达降低有关。25日- 27日我们的结果表明，启动子区域的超甲基化背景与e -钙粘蛋白表达减少有关这类似于使用甲状腺和肝细胞癌的石蜡切片背景启动子甲基化与e -钙粘蛋白表达强度降低或异质模式相关。25，32

      在所有具有未甲基化引物的肿瘤中都可以看到PCR产物，可能我们的一些肿瘤只是部分甲基化或半甲基化(一个等位基因的甲基化)，尽管这很难检查，因为肿瘤没有被微解剖，因此受到背景基质的污染。因此，未甲基化PCR产物可能是这种背景基质的代表。也有可能存在一种高甲基化的癌细胞亚群，实际上不表达E-cadherin，但另一种没有甲基化的细胞亚群却表达E-cadherin。发现有高甲基化CDH1启动子的四种癌症也有E-cadherin蛋白的3级表达(>50%)。很可能这些癌症是半甲基化的，因此仍然能够表达e -钙粘蛋白。前面已经对hMLH1人结直肠癌细胞系的基因及其蛋白34没有被背景基质污染。

      剂量效应，作为至少部分甲基化的结果背景启动子降低E-cadherin的表达，可能对肿瘤的生长有足够的好处。如果基因剂量没有达到功能的一半，或者没有提供足够的选择优势，则需要一个显性的负面效应才能将水平显著降低到一半以下。然而，我们还没有在这些样本中发现任何可以执行这一功能的突变。

      综上所述，虽然我们没有发现突变背景,我们证明了启动子区域的高甲基化背景46%的结直肠癌。甲基化的背景以前在结直肠癌中没有描述过，但我们已经证明这与E-cadherin表达降低显著相关。E-cadherin表达的降低可能是肿瘤进展过程中选择等位基因高甲基化的基础。我们没有发现e -钙粘蛋白表达的显著差异，背景即UCACRC和SCRC之间启动子的超甲基化。正如UCACRC和SCRC之间的遗传变化存在特定差异一样，这些癌症的遗传途径也可能存在很大程度的重叠。

      本文中使用的缩写

      UCACRC
      结直肠癌相关溃疡性结肠炎
      公司
      散发性结直肠癌
      r
      复制错误
      聚合酶链反应
      聚合酶链反应
      SSCP
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      脚注

      • ↵__这些作者的贡献相当。