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背景/目的失活的p16INK4A(p16肿瘤抑制基因的启动子区域甲基化已经证明不仅在许多类型的肿瘤,包括肝细胞癌(HCC),而且在早期肿瘤出现前的病变在肺、结肠癌、食道癌和胰腺癌。本研究的目的是检查的甲基化状态p16启动子在pre -和/或non-neoplastic肝脏疾病。
病人/主题/方法的甲基化状态p16在22个评价肝癌17肝硬化,17个慢性肝炎,九个原发性胆汁性肝硬化(PBC),八个自身免疫性肝炎,七药物诱导的肝脏疾病,六脂肪肝,和三个正常肝组织使用甲基化特定聚合酶链反应(MSP)。p16蛋白表达也检查了免疫组织化学染色。
结果甲基化的p16启动子中检测出肝细胞癌(72.7%,16/22)和肝硬化(29.4%,5/17)和慢性肝炎(23.5%,4/17),所有的阳性B或C型肝炎病毒的感染。甲基化没有检测到任何其他的样品。所有甲基化阳性肝癌、肝硬化和慢性肝炎样本显示p16的表达,和之间的显著相关性被发现甲基化表达和损失。分析序列样本个体患者甲基化阳性肝癌透露,损失的p16表达启动子甲基化发生在18的20例慢性肝炎阶段没有临床检测癌。
结论我们的研究结果表明,甲基化的p16p16蛋白表达的启动子和由此产生的损失是早期事件的一个子集hepatocarcinogenesis,他们检测患者的随访是有用的高患肝癌的风险,如乙肝或丙肝病毒感染。
- 甲基化
- p16
- hepatocarcinogenesis
- 肿瘤出现前的疾病
- 肝炎病毒感染
- 甲基化特异性PCR
略语
- 肝细胞癌
- 肝细胞癌
- 乙型肝炎病毒
- 乙型肝炎病毒
- 丙肝病毒
- 丙型肝炎病毒
- 中国人民银行
- 原发性胆汁性肝硬化
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- MSP
- 甲基化特异性PCR
来自Altmetric.com的统计
肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在日本的癌症死亡的主要原因。1乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染被认为是参与hepatocarcinogenesis。慢性肝炎和肝硬化与乙肝病毒或丙肝病毒之前大多数肝癌。慢性炎症和肝硬化的过程往往伴随着肝细胞的再生,并连续再生可能使肝细胞不受控制的生长和恶性转化的细胞周期调节的中断,衰老和细胞凋亡。乙肝病毒编码的基因产物相互作用p53和影响的生理功能p53。2丙肝病毒已被证明的核心蛋白调节基因转录、细胞增殖和细胞死亡。3,4然而,hepatocarcinogenesis相关的病毒机制仍不清楚。
p16细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,在细胞周期调控中起着重要的作用5和衰老。6p16是其中一个最经常改变肿瘤抑制基因在人类癌症。7频繁的p16表达已经报道在HCC的损失。8然而,突变和纯合子缺失p16在肝细胞癌是罕见的,8 - 14虽然相互矛盾的结果报告。15,16的报告在9 p21 LOH,p16在肝细胞癌基因,还显示了不同频率。卖地,15报告频率的差异p16改变可能是由于不同的风险因素,如乙肝病毒、丙肝病毒、酒精、地理区域的差异。
有人提出异常甲基化的CpG岛的CpG二核苷酸丰富的地区主要分布在许多基因的启动子区域,作为另一种肿瘤抑制基因的失活机制癌症。17,18相比之下罕见的基因改变,频繁的甲基化p16子一直在观察肝细胞癌,11,13,14,19尽管一项研究未能检测肝细胞癌中的甲基化。20.这种差异可以解释的事实和样品不同种族和病原学的背景分析和/或不同的方法。不同比例的差异可能导致特定的目的,如乙肝病毒和丙肝病毒感染,在研究。
最近,异常甲基化的p16子也被报道在肺肿瘤出现前的早期病变,21结肠癌、22食管,23和胰腺。24这些发现表明,p16的损失函数,通常由于启动子甲基化,可能是一个早期事件在各种类型的肿瘤的发病机制。25在这方面,感兴趣的是弱扩增的DNA甲基化在少数non-tumour肝脏组织中甲基化DNA检测的强信号相应的肿瘤组织。13虽然这些研究结果表明,新创的甲基化p16启动子可能发生癌变前的或亚细胞早期hepatocarcinogenesis恶性变化,这些观察的功能意义尚未阐明。在这项研究中,我们分析了5′CpG岛的甲基化p16及相关的结果与免疫组织化学表达p16蛋白在89年从肝癌标本,预处理和/或non-neoplastic肝脏疾病,有或没有肝炎病毒感染,和正常肝脏。
材料和方法
组织标本
22个肝癌(平均年龄59.2(标准差9.3)年;19名男性和三名女性;9乙肝病毒阳性的和13丙肝病毒阳性),17肝硬化(58.2(9.7)年;15名男性和两名女性;七个乙肝病毒阳性的和10丙肝病毒阳性),17慢性肝炎(44.0(13.7)年;九个男性和八个女性;七个乙肝病毒阳性的和10丙肝病毒阳性),9个原发性胆汁性肝硬化(PBC)(55.9(11.4)年;一男8雌性)八自身免疫性肝炎(61.9(4.5)年;一男和七个女性),七药物诱导肝脏障碍(45.1(16.2)年;两个男人和五个女人),六个脂肪肝(46.7(15.3)年; two males and four females), and three normal liver (29.0 (14.0) years; two males and one female) tissue specimens were obtained surgically by needle biopsy or at autopsy. HBV and HCV infections were diagnosed by HBs antigen (LPIA-200; Diatron laboratories, Tokyo, Japan) and anti-HCV antibody (Immunocheck-HCV Ab; International Reagent, Kobe, Japan), respectively. All specimens were diagnosed pathologically and frozen at −80°C.
亚硫酸氢盐改性
先前所描述的方法的原则。25化学改性的胞嘧啶尿嘧啶,亚硫酸氢盐处理、胞核嘧啶都转变成尿嘧啶,而甲基化对这一修改,仍是胞嘧啶。可以设计一个聚合酶链反应(PCR)引物区分从unmethylated DNA甲基化亚硫酸氢盐修改DNA,利用序列的差异造成亚硫酸氢盐修改。25从冷冻提取的基因组DNA(2μg)组织的标准苯酚/氯仿过程变性在0.2 M氢氧化钠15分钟。亚硫酸氢钠(σ化学,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到最终浓度为3.1 M,和对苯二酚(σ化学)添加到最后一个0.5毫米的浓度。在50°C反应进行了16个小时。修改DNA然后使用向导纯化DNA纯化树脂(Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)根据制造商的协议和筛选了50μl的水。DNA处理氢氧化钠(最终浓度0.3米)五分钟在室温下,紧随其后的是乙醇沉淀。修改DNA在水和立即使用或储存在resuspended−20°C。
甲基化特异性PCR (MSP)
亚硫酸氢盐修改DNA受到MSP unmethylated使用特定的引物p16(5′-TTATTAGAGGGTGGGGTGGAT TGT-3′, 5′-CAACCCCAAACCACAAC CATAA-3′)或甲基化p16(5′-TTAT TAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3′, 5′-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3′)。25进行了PCR反应在一卷50μl包含1×PCR缓冲,0.25毫米核苷酸,每个引物1毫米和2.5 U的Taq。PCR条件如下:95°C五分钟一个周期;35周期为30秒95°C, 60°C (unmethylated)或65°C(甲基)30秒,30秒和72°C;和一个周期的四分钟72°C。25PCR样本然后在3%琼脂糖凝胶电泳。
免疫组织化学
组织部分(4 - 5μm) deparaffinised和培养目标中检索解决方案(Dako Carpinteria,加州,美国)推荐的稀释和被蒸汽加热15分钟。一夜之间,幻灯片被孵化在4°C小鼠单克隆抗体anti-p16(联盟城市Neomarkers,加州,美国)的最终浓度稀释4μg /毫升。负控制幻灯片处理正常兔免疫球蛋白在相似的条件下。幻灯片是然后用磷酸盐缓冲盐水冲洗和二次抗体孵育使用Dako LSAB 2系统(Dako),开发diaminobenzidine(关东大化工、东京)五分钟,并与苏木精复染色一分钟。
统计分析
甲基化的p16启动子是评估使用χ协会临床病理的特色2或者确切概率法。被认为具有统计显著性p值< 0.05。
结果
p16启动子的甲基化各种肝脏疾病
甲基化的p16启动子中发现72.7%(16/22)的肝细胞癌(无花果1),29.4%(5/17)肝硬化(无花果1B), 23.5%(4/17)的慢性肝炎组织样本(无花果1B,无花果2、表1)。相比之下,没有九PBC,八自身免疫性肝炎,七药物诱导的肝脏疾病,六脂肪肝,或三个正常肝组织p16启动子甲基化(图1C、无花果2)。甲基化阳性组织样本都是阳性乙肝病毒或丙肝病毒(无花果2、表1)。积极为p16启动子甲基化之间没有不同的乙肝病毒和丙肝病毒阳性患者在肝细胞癌(7/9v9/13)、肝硬化(2/7v3/10),或慢性肝炎(1/7v3/10)。Unmethylated乐队也被发现在所有甲基化阳性病例(无花果1一个,1B)的甲基化之间没有显著相关性p16启动子与年龄、类型的病毒感染,肿瘤细胞分化,肿瘤大小,或者在HCC组织学结果(表1)。
甲基化特定聚合酶链反应(PCR)分析和p16基因的表达。(一)肝细胞癌(HCC)样本。(B)肝硬化(LC)和慢性肝炎(CH)样本。(C)原发性胆汁性肝硬化(PBC),自身免疫性肝炎(AIH),药物诱导肝脏疾病(DLD)、脂肪肝(FL)和正常肝(NL)样本。Unmethylated和甲基化表明甲基化特定PCR分析特定Unmethylated和甲基化促进p16,分别。(+),正常的p16的表达;(±),p16表达的部分损失;(−),p16表达的完全丧失。
总结p16的频率启动子甲基化。p16启动子甲基化的频率表示为一个百分比。阳性病例的数量/总病例数也会显示。
p16的表达
所有正常肝组织(无花果3一)和病毒性肝病(无花果3中)显示为p16阳性核染色。相比之下,完全或部分丧失观察p16表达在肝细胞癌90.9%(20/22),47.1%(8/17)的肝硬化,29.4%(5/17)的慢性肝炎病例,所有这一切都与肝炎病毒感染(无花果3外:我)。p16表达(图的部分损失3F,3G)在四,五甲基化阳性慢性肝炎组织但在只有一个13的甲基化-慢性肝炎组织(p = 0.002)(图1一个完整的(图B)3H)和四个部分的损失p16表达观察的五甲基化阳性肝硬化组织只有12甲基化-肝硬化组织中有三个部分损失p16的表达(p = 0.009)(图1B)。完成(图3我)或部分损失p16核染色观察81.8% (18/22;乙肝病毒阳性的8/9和10/13丙肝病毒阳性)和9.1% (2/22;丙肝病毒阳性)分别为肝细胞癌。所有的16个甲基化阳性病例显示完全丧失p16的表达(无花果1一、表1),甲基化和完全丧失之间的显著相关性被发现的表达(p = 0.002)。
使用鼠标anti-p16单克隆抗体免疫组织化学的p16。强核免疫染色检测在正常肝脏(A)、脂肪肝(B),药物诱导肝脏疾病(C),自身免疫性肝炎(D)和原发性胆汁性肝硬化(E)样本。(F)和(G)部分损失p16的表达在慢性肝炎样本。完全丧失p16的表达在肝硬化(H)和肝细胞癌(I)样本。
分析序列样本个体患者甲基化阳性肝癌透露,损失的p16表达启动子甲基化发生在18的20例慢性肝炎阶段没有临床检测癌(数据没有显示)。
讨论
在这项研究中,我们分析了甲基化状态的5′CpG岛p16基因启动子在一系列的肝癌和预处理和/或non-neoplastic肝脏疾病有或没有肝炎病毒感染。甲基化的p16启动子中检测出72.7%的肝癌,肝硬化的29.4%,和23.5%的慢性肝炎组织,所有的阳性乙肝病毒和丙肝病毒感染。相比之下,甲基化并不是任何组织样本中发现病毒性肝脏疾病,包括中国人民银行、自身免疫性肝炎、药物诱发肝病、脂肪肝,表明这种表观遗传变化可能与肝炎病毒感染。
所有的肝癌、肝硬化和慢性肝炎与启动子甲基化样本显示,损失的表达式,以及甲基化表达和损失之间显著相关。因此,甲基化的p16启动子在这项研究中发现似乎功能意义。此外,值得注意的是,大多数患者甲基化阳性肝癌有失去p16表达启动子甲基化阶段的慢性肝炎临床检测癌。我们的研究结果表明,甲基化的p16启动子是一个最早的事件的一个子集hepatocarcinogenesis相关肝炎病毒。我们的研究结果与最近的一些研究的结果一致表明失活p16甲基化是一种肺癌症发展的早期事件,21结肠癌、22食管,23和胰腺。24因此我们的研究结果证实最近报道频繁的甲基化的观察p16启动子在肝癌和扩展观察慢性肝脏疾病与肝炎病毒感染有关。进一步分析,包括许多non-virus关联的情况下,需要澄清的有趣的甲基化之间的关系p16启动子和慢性肝炎病毒感染。
在所有的甲基化阳性病例,unmethylated乐队也被检测到。一个可能的解释是这些unmethylated乐队是由于污染正常组织的肿瘤,如炎症细胞和正常肝细胞。考虑的表情,似乎两个等位基因灭活biallelic甲基化或甲基化与基因改变,如突变,LOH,和纯合缺失,见先前的研究。13几个肝癌、肝硬化和慢性肝炎样品没有甲基化也显示p16的表达,表明上述基因失活的变化中发挥作用p16基因。与我们的结果相比,有更早的研究未能发现甲基化p16启动子在慢性non-tumour肝脏疾病,包括病毒的来源。11,14这些相互矛盾的观察结果可能是由于检测方法的差异甲基化的民族和病原学的背景和/或个人。然而,这些因素在我们的研究类似在松田和他的同事们的研究。14然而,我们的观察是不可能高估的甲基化和甲基化,我们发现了一个很好的相关性损失的表达式。
所有甲基化阳性肝癌显示p16表达的完全丧失,而多数的甲基化阳性肝硬化和慢性肝炎的样本显示,部分损失的表达式。有人建议,积累的甲基化胞嘧啶5′CpG岛p16也许沉默该基因以剂量依赖的方式。26据报道,部分损失p16的表达与低水平的甲基化比完全丧失,这表明甲基化,p16的表达和损失发生在循序渐进的方式。14,27逐渐丧失p16的表达与进步联系在一起p16启动子甲基化也被报道在逃脱的乳腺上皮细胞衰老。28因此,部分损失p16的表达在肝硬化和慢性肝炎的异质性可能是由于肝细胞的甲基化,与甲基化等位基因和细胞的人口可能会增加在发展为肝癌。看起来有趣的推测,细胞失去p16的表达更容易发展成肿瘤的细胞比正常p16的功能。
精确的机制导致肿瘤细胞的异常甲基化CpG岛都不知道。此外,所知甚少的病毒感染和甲基化机械之间的联系。最近,人类免疫缺陷病毒已被证明诱导干扰素γ的甲基化通过增加DNA甲基转移酶的活动。29日有趣的是,太阳等报道DNA甲基转移酶mRNA水平上升相比,从慢性肝炎和肝硬化肝组织与正常肝组织。30.然而,几行之间没有相关性的实验证据表明DNA甲基转移酶活性和内源性基因的异常甲基化。31日因此,异常甲基化的p16启动子可能不是直接由DNA甲基转移酶升高引起hepatocarcinogenesis活动。其他机制,如失去保护从头甲基化可能是异常的甲基化的基础p16在hepatocarcinogenesis。17,18我们的研究结果值得进一步调查。
虽然需要进一步的研究来说明肝炎病毒感染和甲基化之间的联系p16在hepatocarcinogenesis,检测p16启动子甲基化可能是一个有用的分子标记跟踪患者患肝癌的风险很高,比如具有乙肝病毒和丙肝病毒感染。将感兴趣的前瞻性研究是否患者p16甲基化阳性肝硬化或慢性肝炎有更高的比那些没有患肝癌的风险p16甲基化。
确认
这项工作是在援助赠款支持教育部、科学、体育和文化(FI和KI)和卫生部和福利(FI和KI),日本。
略语
- 肝细胞癌
- 肝细胞癌
- 乙型肝炎病毒
- 乙型肝炎病毒
- 丙肝病毒
- 丙型肝炎病毒
- 中国人民银行
- 原发性胆汁性肝硬化
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- MSP
- 甲基化特异性PCR