你在这里

条文本

菜单条

下载PDF

幽门螺杆菌
幽门螺杆菌感染引起人胃细胞基因表达的改变
免费的
  1. 碳碳邱一个，
  2. 碳碳陈b，
  3. D-L许凤一个，
  4. k - t大灭绝陈一个，
  5. y李一个，
  6. 英汉陈一个
  1. 一个台湾桃园长庚大学医学技术学院b台湾国泰总医院内科
  1. 陈英强博士，长庚大学医学技术学院，台湾桃园葵山文华一路259号。chanec在{}mail.cgu.edu.tw

摘要

背景幽门螺杆菌大肠杆菌是一种导致许多消化系统疾病的人类病原体，它会导致受感染组织中基因表达模式的复杂变化。cDNA表达阵列为研究这些复杂现象提供了有用的工具。

目的鉴定基因表达改变后H幽门人胃细胞感染与未感染对照比较。

方法将胃腺癌细胞株AGS与H幽门．用台盼蓝排除法测定感染细胞的生长。衍生的互补DNA探针H幽门将处理过和未处理过的细胞杂交到两个相同的Atlas人cDNA表达阵列中，鉴定出表达水平改变的基因。实时定量逆转录聚合酶链反应实验用于更好地确定这些基因在内镜下胃粘膜活检中有和没有的表达模式H幽门感染。

结果超过24小时，与H幽门抑制AGS细胞生长，但未引起明显的细胞死亡程度。H幽门治疗改变了AGS细胞的基因表达模式。我们从cDNA表达阵列中鉴定出21个过表达基因和17个抑制基因。大多数基因是转录因子，如c-jun，BTEB2,ETR101．其他基因参与信号转导通路，如MAP激酶，白细胞介素5和胰岛素样生长因子。参与细胞周期调控和分化的基因，如CDC25B而且NM23-H2，也被确认。在患有H幽门感染(n=20)，差异有统计学意义ERCC3，id是2,NM23-H2无消化性疾病患者感染胃黏膜与未感染胃黏膜mRNA水平比较(n=20) (ERCC34.75分子/ 104β-肌动蛋白mRNA分子v13.65, p < 0.001;id是216.1v23.4, p < 0.05;NM23-H217.5v45.5, p < 0.001)。两组mRNA水平差异无统计学意义c-jun而且CDC25B在H幽门已感染的胃粘膜和未感染的粘膜

结论我们证明了H幽门感染引起AGS细胞基因表达的改变。Atlas人类cDNA表达阵列的差异杂交技术是一种有效的方法来鉴定参与致病机制的宿主基因H幽门感染。

  • 胃腺癌
  • 幽门螺杆菌
  • 互补脱氧核糖核酸微阵列
  • 基因表达
  • 转录因子
  • 信号转导途径

  • 本文中使用的缩写

    VacA
    空泡毒素
    伊尔
    白介素
    的边后卫
    胎牛血清
    rt - pcr
    逆转录聚合酶链反应
    IL-5R
    白细胞介素5受体
    IGFBP2
    胰岛素样生长因子结合蛋白2

    • http://dx.doi.org/10.1136/gut.48.5.598

    数据来自Altmetric.com

      请求的权限

      如果您希望重用本文的任何或全部内容，请使用下面的链接，该链接将带您到版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和即时许可，以多种不同的方式重用内容。

      幽门螺杆菌它是一种人类病原体，感染胃粘膜，可引起消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌等多种消化系统疾病。1的毒力因子H幽门包括那些允许细菌在胃腔的恶劣环境中生存的因素，如螺旋形和运动性，适应性酶和蛋白质，以及粘附在胃粘膜细胞和粘液上的能力。2，3.被认为是致病机制的其他因素H幽门包括那些引起胃粘膜屏障破坏的物质，如空泡毒素(VacA)，炎症介质和胃酸的贡献者。4 - 6然而，消化性溃疡和胃癌只发生在慢性感染的一小部分人身上H幽门。因此，细菌和宿主因素都被认为是导致这种差异反应的原因。关于宿主细胞反应，体内外研究表明H幽门感染通过增加白细胞介素8 (IL-8)的表达和分泌引起胃上皮细胞炎症。7号到9号H幽门感染还会增加胃蛋白酶原的分泌，并可能导致上皮细胞完整性的损害。10－12最近的研究表明，H幽门引起感染上皮细胞凋亡。13 - 15此外，它们还会在胃粘膜产生氧化应激。16，17

      在消化性溃疡甚至癌症等疾病的病理变化中，研究宿主细胞的基因表达，可能为我们分析消化性溃疡甚至癌症诱导的生物过程提供所需的信息H幽门感染。在之前的研究中，我们证明了这一点H幽门利用mRNA差异显示技术诱导人胃细胞基因表达的改变。18cDNA表达阵列是一种高通量筛选致病细胞中多种基因差异表达的新技术。19该技术基于逆向北方杂交原理。20.数百到数万个DNA片段被固定在尼龙膜或玻璃片等支撑材料上。不同表达水平的基因可以通过比较来自不同样本的cDNA探针杂交的两个或多个重复阵列来识别。到目前为止，cDNA表达阵列已被用于研究几种类型癌症中的差异表达基因。21 - 24日这项技术也有潜力用于研究其他细胞行为，如分化和药物反应。25，26

      在本研究中，我们使用cDNA表达阵列法分析培养后胃上皮细胞基因表达的变化H幽门感染。在这些改变的基因中，只有一小部分以前被鉴定出来，如细胞因子表达、凋亡和信号转导的基因。许多其他基因还没有进行相关研究H幽门诱导反应。在本研究中，讨论了这些基因的可能功能及其与疾病的关系。

      患者与方法

      病人

      20例进行胃活检H幽门阴性患者(男性10例，女性10例)和20例H幽门阳性患者包括16例十二指肠溃疡(男10例，女6例)和4例胃溃疡(男2例，女2例)。活组织切片在使用前被冷冻在液氮中。根据内镜检查、胃活检组织学检查、快速脲酶(CLO)试验诊断。

      细菌和细胞系培养

      的H幽门菌株K8为VacA和CagA阳性，分离自台湾长庚纪念医院一名溃疡患者。细菌在巧克力琼脂板上培养，37°C，在10% CO的微嗜氧气氛中2在95%湿度的空气中。人胃腺癌细胞株AGS (CCRC 60102)来自台湾食品工业研究与发展研究所。AGS细胞在含10%胎牛血清(FBS)的Ham’s F12培养基(GibcoBRL, Grand Island, New York, USA)中培养(Trace Bioscience, Australia)，并在37°C、5% CO的培养箱中培养2在空气中。

      共培养的H幽门和ags细胞

      在实验之前，H幽门从琼脂板上刮取，用磷酸盐缓冲盐水洗涤一次，并在无血清F12培养基中重悬。细菌浓度调整为1×108细胞数/ml，在血球计显微镜下测定，在625 nm分光光度法测定。AGS细胞在加入细菌细胞18小时前接种于100 mm培养皿中。为了确定细胞生长速率，5×105AGS细胞用1×10处理8或2×108细菌细胞在5毫升不含抗生素的培养基中。在24小时和96小时后对细胞进行胰蛋白酶化，在血细胞计上用台锥蓝排除法测量细胞数量及其活力。RNA提取，2×106AGS细胞与2×10共孵育8细菌在10毫升培养基中。用等量无细菌培养基处理的细胞作为对照。24小时后，2×107收集细胞，用磷酸盐缓冲盐水冲洗三次，在TRIzol试剂(GibcoBRL)中裂解。

      的影响H幽门ags细胞凋亡的研究

      与AGS细胞同步共培养H幽门与在无微生物条件下生长的细胞平行分析，以确定对细胞凋亡的影响。同步的AGS细胞被剥夺血清48小时。将粘附细胞和漂浮细胞收集在一起，在70%乙醇中固定。细胞微球悬浮于含0.6% NP40的0.2 mg/ml碘化丙啶(ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, California, USA) 400 μl和相同体积的2 mg/ml RNase (Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri, USA)中，室温下孵育30分钟。细胞悬液经60 μm滤网过滤。数据采集和分析在FACScan仪器(Becton Dickinson, San Jose, California, USA)上进行。凋亡细胞被认为构成亚g1细胞群。所有实验至少进行三次。

      互补DNA探针的制备及人DNA表达阵列的杂交

      对TRIzol裂解的细胞，加入0.2体积的氯仿，离心后收集含RNA的水相。RNA在50%异丙醇中沉淀，颗粒用70%酒精洗涤，干燥，并在经H2利用oligotex mRNA试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从500 μg总RNA中分离出O. Poly A+ mRNA。根据Atalas人类cDNA表达阵列的制造商说明(Clonetech, Palo Alto, California, USA)进行cDNA探针制备和膜杂交。简单地说，在CDS引物混合物和α的存在下，MMLV逆转录酶将1 μg mRNA逆转录为cDNA32P-dATP (3000 Ci/mmol;Amersham Pharmacia，香港)。使用CHROMA SPIN-200色谱柱(Clonetech)从未结合的核苷酸中分离标记的cDNA。将人cDNA表达阵列在68°C的ExpressHyb溶液(Clonetech)中预杂交30分钟，其中加入0.1 mg/ml的鲑鱼精子DNA (GibcoBRL)。cDNA探针在68℃下杂交到阵列中过夜。在所有情况下，用溶液1 (2× SSC和1% SDS)洗涤膜4次，用溶液2 (0.1× SSC和0.5% SDS)洗涤膜2次，在68°C下洗涤30分钟，并暴露在荧光屏上。基因表达水平的图像和定量数据使用PhosphoImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA)进行分析。

      NORTHERN

      对于北方印迹，总RNA (10 μg)来自未处理的AGS和H幽门处理过的AGS细胞在甲醛变性的1%琼脂糖凝胶上分离，转移到尼龙膜上(Schleicher和Schuell, Hahnestrasse, Germany)。紫外交联后，印迹在40℃的1× SSC、1% SDS、1× Denhardt's溶液、200 μg/ml鲑鱼精子DNA和20 mM Tris缓冲液(pH 7.1)中预杂交4小时。在1×10的存在下，在40°C下进行杂交6Cpm /ml随机质数32P标记探针。2× SSC/0.1% SDS室温洗涤后，用1× SSC/0.1% SDS在65℃下洗涤20分钟。冲洗后的膜进行放射自显影6小时。基因表达的时间变化H幽门采用北方杂交方法对处理过和未处理过的AGS细胞株进行研究。对于加载控制，螺栓被剥离，并重新用32P标记人β-肌动蛋白基因探针。利用特异引物，通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)制备基因探针。2 μg总RNA在含有1×逆转录酶反应缓冲液(Promega, Madison, Wisconsin, USA)、200 μM dNTPs、10 ng寡核苷酸(dT)的25 μl反应混合物中合成互补DNA。15引物，8 mM二硫苏硫醇，40 U Rnasin (Promega)， 100 U M-MLV逆转录酶(Promega)。混合物在37°C下孵育50分钟，加热到80°C 10分钟，并在冰上冷却。每个特异基因用2 μl cDNA在含有200 mM dNTPs、0.2 μM正向和反向引物、2.5 U Taq DNA聚合酶和1× Taq反应缓冲液的50 μl扩增液中扩增。对于β-actin，在第一步变性(94°C 2分钟)后进行22个循环(94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 30秒)PCR扩增。其余基因PCR扩增25-30个循环(94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒)。用于PCR的特异性引物为:5 ' -CCGAAGGCTA GTGCGATGTTTC-3 '和5 ' -ACTTGATG CAATCCAAACTTTGAA-3 'c-jun；5 ' - agatttaccctgtggatctgcact -3 '和5 ' -TCATCACAGAGACTTTCAC AAG CAA-3 'EERC3；5 ' -ATATCAGCATCC TGTCCTTGCA-3 '和5 ' -GAAA TCA TG AACACCGCTTATTCA-3 'id是2；5 ' -CTG AACCTTGTGGATTGGAGTTC-3 '和5 ' -AAAAGCTGCAGGATGTCACCA-3 '过去疾病预防控制中心；5 ' -CAGTAGACGGAAAGCACCAAG A-3 '和5 ' -AATCACAAACTTATCCACGAT GTTG-3 'CDC25B；5 ' -ACCTGAAAGA CCGACCATTCTTCC-3 '和5 ' -AGACTGC TGTTGTGTCCACCTC-3 'NM23-H2；和AAGATGACCCAGATCATGTT-3 '和GCGACATAGCACAGCTTCT-3 'β肌动蛋白。扩增后，PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭染色。

      定量聚合酶链反应

      用TRIzol分离方法从冷冻胃粘膜活检样本中分离总RNA。利用上述方法制备cDNA。实时定量RT-PCR之前已经有过描述。-所有PCR反应均在GeneAmp 5700序列检测系统(Applied biosystems, Foster City, California, USA)中热启动，重复三次。反应条件为50℃2分钟，95℃10分钟，95℃循环40次，每次15秒，最后在60℃孵育1分钟，所有模板最后孵育1分钟。

      GeneAmp 5700系统(Applied biosystems, Foster City, California, USA)使用SYBR Green I法检测PCR产物积累。加入SYBR Green I染料结合PCR反应中形成的双染色DNA，结合导致荧光增强。基于SYBR Green I检测化学，荧光的增加与DNA浓度成正比。所有的PCR反应都在特殊的光学管中以96孔的微量滴定板格式进行。将已知输入量的cDNA和“无模板”阴性对照，连续稀释三份cDNA标准物，加入微孔中进行PCR。分析内部和分析间的变异小于3%。以下是β肌动蛋白定量作为内源性RNA对照。然后，目的基因数量除以内源性β肌动蛋白以获得一个归一化的靶基因值。

      统计分析

      学生的t统计学分析采用检验。结果在p<0.05时被认为是显著的。

      结果

      细胞生长与凋亡

      治疗H幽门显著抑制AGS细胞生长。然而，台盼蓝排除试验在24小时内很少或没有检测到细胞死亡。延长潜伏期至72小时后，一半的病毒感染H幽门处理过的细胞变得分离，导致活细胞数量减少。因此，AGS细胞被处理H幽门24小时的研究

      流式细胞仪亚二倍体DNA峰分析显示，24小时孵育后，指数生长的AGS细胞中有2-4%发生了自发凋亡。添加H幽门导致亚g细胞的百分比增加了三倍124小时孵育后，指数分裂细胞的(凋亡)群体(图1)．

      Apoptosis fraction of AGS cells at different times after coculturing with H pylori. Synchronised AGS cells were serum deprived for 48 hours (time 0 hours) and fed with fresh medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) alone or combined with wild-type H pylori at a bacterial concentration of 107cells/ml. The experiments were repeated three times.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
      图1

      与幽门螺旋杆菌共培养后AGS细胞在不同时间的凋亡率。同步的AGS细胞被剥夺血清48小时(时间为0小时)，并以含有10%胎牛血清(FBS)的新鲜培养基单独或联合野生型幽门螺杆菌，细菌浓度为107细胞/毫升。实验重复了三次。

      RNA表达谱H幽门感染的ags细胞

      Atlas人类cDNA表达阵列是一个带正电荷的尼龙膜，上面的DNA片段代表588个基因，9个管家基因和阴性对照序列，在重复的点上被发现。cDNA探针来源于H幽门处理过的AGS细胞杂交成膜。来自未处理细胞的探针被杂交到另一个相同的膜上。从AGS细胞中提取用于cDNA制备的mRNA，采用分光光度法(260 nm/280 nm比值)定量。对于一些基因，表达水平变化后H幽门感染是通过比较两种膜上的杂交模式来确定的2)．我们对cDNA阵列膜进行了至少三次剥离和再杂交，发现了类似的结果。表格1结果表明，与AGS细胞共孵育后，21个基因上调，17个基因下调H幽门．只有那些显示出超过两倍改变的基因才被列出。9个管家基因被用作内部控制来校正mRNA丰度。在这些管家基因中，gapdh，微管蛋白α，β肌动蛋白将两种杂交膜中信号相对强度相似的23 kDa高碱性蛋白基因和核糖体蛋白S9基因，用对照基因信号的平均值归一化靶基因。其他管家基因的信号(产生hprt，磷脂酶A2,MHC)，要么没有被检测到，要么太弱，无法作为有用的参考。M13、λ-DNA和pUC18 DNA位点均未出现可检测信号，为样品DNA污染的阴性对照。

      Gene expression pattern after 24 hours of H pylori cocultured AGS cells appearing on the Atlas human cDNA expression arrays. Upper and lower arrays were hybridised with the cDNA probes derived from untreated and H pylori treated AGS cells, respectively. Some of the differentially expressed genes are marked. Open arrows indicate genes that were overexpressed by H pylori treatment; black arrows indicate downregulated genes. 1, c-jun; 2, BTEB2; 3, MAPk/ERK kinase; 4, α-catenin; 5, fibronectin receptor α subunit; 6, epidermal growth factor; 7, Id-2; 8, p55CDC; 9, nuclease sensitive element DNA binding protein; 10, NM23-H2; and 11, death associated protein 3. Internal controls were: 12, ubiquitin; 13, gapdh; 14, tubulin; 15, β-actin; 16, 23 kDa highly basic protein; and 17, ribosomal protein S9.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
      图2

      在Atlas人cDNA表达阵列上出现幽门螺旋杆菌共培养AGS细胞24小时后的基因表达模式。上层和下层分别与未处理和幽门螺旋杆菌处理的AGS细胞的cDNA探针杂交。一些差异表达的基因被标记出来。开箭头表示幽门螺杆菌处理后过表达的基因;黑色箭头表示下调基因。1、c-jun;2、BTEB2;3、MAPk/ERK激酶;4,α连环蛋白;5、纤维连接蛋白受体α亚基; 6, epidermal growth factor; 7, Id-2; 8, p55CDC; 9, nuclease sensitive element DNA binding protein; 10, NM23-H2; and 11, death associated protein 3. Internal controls were: 12, ubiquitin; 13, gapdh; 14, tubulin; 15, β-actin; 16, 23 kDa highly basic protein; and 17, ribosomal protein S9.

      查看该表:
      表1

      与幽门螺杆菌共培养24小时后AGS细胞基因表达的变化

      Northern blot分析

      为了确认在cDNA表达阵列上识别的基因的差异表达，我们进行了一项独立的实验H幽门重复处理，总rna来源于24小时H幽门分别对处理和未处理的AGS细胞进行RT-PCR制备6个探针(c-jun，CDC25B，ERCC3，id是2，p55CDC,NM23-H2)．Northern blot分析显示c-jun，CDC25B, ERCC3, Id-2，p55CDC,NM23-H2分别约为4.8、4.8、5.6、5.8、4.6和3.7 kb。如图所示3.， northern blotting的时间进程证实了候选基因在AGS细胞中的表达发生了改变H幽门治疗。在未处理的AGS细胞中，c-junmRNA水平在24小时下降。然而，表达c-jun维持了24小时H幽门处理过的AGS细胞。CDC25B对照组AGS细胞的水平在12小时下降，24小时恢复H幽门处理后24小时，AGS细胞基因表达无明显变化。ERCC3而且P55CDC24小时后表达量显著降低H幽门治疗．id是212小时内表达量下降H幽门治疗后24小时痊愈。NM23-H2在12小时内明显下降H幽门治疗和定量为控制水平的250%。

      Northern blot demonstrating changes in expression of ERCC3, Id-2, NM23-H2, c-jun, and p55CDC at specified time intervals after coculturing AGS cells with H pylori at 107 cells/ml for 24 hours. RNAs were purified at the indicated times, and 10 μg of total cellular RNA was loaded into each lane. The same blot was hybridised to one probe, retrieved, and rehybridised sequentially with the other probes. Three independent experiments were performed and similar result were obtained.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
      图3

      Northern blot检测AGS细胞与幽门螺旋杆菌共培养后，ERCC3、Id-2、NM23-H2、c-jun和p55CDC在指定时间间隔的表达变化7细胞/ml 24小时。在指定时间纯化RNA，每个通道装载10 μg总细胞RNA。将相同的印迹杂交到一个探针上，提取，并按顺序与其他探针重新杂交。进行了三个独立的实验，得到了相似的结果。

      候选基因的定量rt-pcr分析H幽门感染和未感染的胃粘膜

      的显著下降ERCC3mRNA水平观察组的患者H幽门感染胃粘膜活检(平均4.75 mRNA分子/104β-肌动蛋白mRNA分子;与未感染黏膜相比(平均13.65 mRNA分子/10)4β-肌动蛋白mRNA分子;范围8.4-25.9)(p<0.001)(图4)．的显著下降id是2mRNA水平也观察到H幽门感染胃粘膜活检(平均16.1个mRNA分子/104β-肌动蛋白mRNA分子;范围10.4-19.3)，与正常黏膜(平均23.4个mRNA分子/104β-肌动蛋白mRNA分子;范围20.1-35.6)(p<0.05)。的表达NM23-H2显著降低了H幽门感染胃粘膜活检(平均17.5 mRNA分子/104β-肌动蛋白mRNA分子;范围10.4-19.3)，与正常黏膜(平均45.5 mRNA分子/104β-肌动蛋白mRNA分子;范围30.1-60.6)(p<0.001)。虽然在H幽门殖民粘膜CDC25B而且c-junmRNA水平改变，感染和未感染黏膜基因表达无明显差异(图2)4)．

      mRNA levels of ERCC3, Id-2, NM23-H2, c-jun, and p55CDC in human gastric mucosal biopsies. mRNA amounts were quantified using a real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction technique, as described in patients and methods. For each group data were summarised using the box plot technique. The bottom and top symbols indicated minimum and maximal values, respectively (lower or higher than 10% and 90% percentiles); the filled square in the box indicates the mean; and the bottom of the box, median line, and top of the box indicate 25%, 50%, and 75% percentiles, respectively. + and − indicate H pylori infected and uninfected biopsies, respectively.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
      图4

      人胃粘膜活检中ERCC3、Id-2、NM23-H2、c-jun和p55CDC的mRNA水平如患者和方法所述，使用实时定量逆转录-聚合酶链反应技术定量mRNA数量。每组数据均采用箱形图技术进行汇总。底部和顶部符号分别表示最小值和最大值(低于或高于10%和90%百分位数);方框中填满的方格表示平均值;方框底部、中位数线和方框顶部分别表示25%、50%和75%的百分位数。+和−分别表示幽门螺旋杆菌感染和未感染的活检。

      讨论

      与细菌共孵育或用细菌成分处理的细胞系或原代培养物常被用作研究该病致病机制的模型H幽门相关的疾病。这种治疗引起的细胞反应包括生长抑制、空泡化、细胞凋亡、细胞因子分泌和细胞骨架重排。7，30 -然而，仍难以与之建立直接联系H幽门不能排除这些作用诱发疾病，以及其他机制可能导致疾病的可能性。因此，全面调查细胞的反应H幽门是必要的。

      在本研究中，我们使用cDNA表达阵列监测了AGS细胞中数百个基因的表达H幽门并发现有38个基因的表达水平发生了变化。大多数基因为转录因子或推测转录因子。在他们中间c-jun，fra-1，PAX3，BTEB2，TTP，DB1，ETR101,ETR103是过度表达的Id2下，TFIID，TFIIH-p89，NM23-H2，Ini1，HSF1， CCAAT置换蛋白基因下调。转录因子的差异表达可能是一种早期反应H幽门感染，因为这些因素影响其他基因的表达，然后改变细胞行为。在表达升高的转录因子中，C-JUN和fr -1是转录因子AP-1的两个组分。AP-1在的启动子区有一个结合位点引发，和表示引发可能部分受到AP-1的影响33一些证据已经证明细胞产生IL-8是受H幽门治疗。7号到9号此外，AP-1活性的升高是细胞凋亡的早期事件。34由于延长了AGS细胞的孵育时间H幽门(超过96小时)引起细胞死亡，AP-1活性可能在其中起作用H幽门诱导细胞死亡。有趣的是，一些H幽门诱导转录因子，如c-jun，TTP，ETR101,ETR103，也是有丝分裂原诱导的，35-38这说明至少有一部分H幽门诱导反应与丝裂原机制共享。相比之下,TFIID而且ERCC3这些与基础转录相关的基因被下调H幽门．这种现象可能是由于之后细胞的生长受到抑制H幽门治疗。

      一些信号转导途径可以改变转录因子的活性及其表达。虽然在本研究中没有直接观察到信号机制，但我们从相关基因的差异表达中发现了线索。例如，我们的结果表明MLK-3，MAPKK3，MAPKK4，ERK激酶1,c-jun细胞处理后增加H幽门，表明MAP激酶通路在H幽门诱导反应。相反，白细胞介素5受体(IL-5R)和胰岛素样生长因子结合蛋白2 (IGFBP2)，它们分别调节IL-5和胰岛素样生长因子的作用，被细菌抑制。虽然IL-5R和IGFBP2的生理推断尚不清楚，但细胞可能通过改变参与信号通路的因素数量来改变其对刺激的敏感性。

      两个与细胞周期相关的基因，CDC25B而且p55CDC，被下调了H幽门感染。CDC25B是一种酪氨酸磷酸酶，是细胞周期进展到有丝分裂所必需的。39据报道，12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯抑制CDC25B并导致内皮细胞G2阻滞。40我们的研究结果表明H幽门在共孵育24小时内，抑制细胞生长，但未引起细胞死亡。这种生长抑制可能与蛋白的下调有关CDC25B， AGS细胞与H幽门导致G2被捕(未发表的观察)。

      微管关联蛋白p55CDC是细胞分裂所必需的。41通过抗体注射导致p55CDC在中期停止或延迟，并损害晚期有丝分裂事件的进展。42Downregulation的CDC25B而且p55CDC表明,H幽门扰乱细胞周期。先前的研究已经证实，在细胞凋亡之前，紫外线处理的细胞会发生细胞周期停滞。43这就提出了一个问题:是否H幽门通过类似的机制诱导细胞凋亡。降低的水平NM23-H2，一种转移抑制基因H幽门处理过的AGS细胞。越来越多的证据表明NM23在某些癌症类型中，基因最初被记录为侵袭性表型的抑制因子，参与控制正常的发育和分化。44

      H幽门抑制了两个应激诱导基因，热休克蛋白27和热休克因子蛋白1，以及解毒相关基因，谷胱甘肽s -转移酶T1。正如所料,H幽门能产生活性氧分子吗16，17这可能会在细胞中造成应激环境，并诱导应激基因。然而，本研究未观察到应激基因的诱导。这可能是氧化应激在我们的细胞培养条件下没有产生，或者是细胞对氧化应激的反应H幽门侮辱不是由测试的应激蛋白介导的。

      利用cDNA表达阵列研究基因表达，我们发现AGS细胞中几个基因的表达水平在处理后发生了变化H幽门．这清楚地表明，发病需要多种基因变化和基因产物H幽门感染。利用基因特异性定量RT-PCR技术，我们证实了该基因的表达模式ERCC3，id是2,NM23-H2在人胃粘膜活检中分析的基因与使用cDNA表达阵列分析的基因相同。的表达c-jun而且p55CDC在H幽门感染和未感染的人胃粘膜有差异，但不显著。可能的原因是cDNA表达阵列试验的假阳性结果或胃粘膜中存在的这些基因数量稀少。我们目前正在分析使用该技术筛选的其余靶基因的表达模式H幽门殖民人类胃粘膜。

      我们的结论是，人类cDNA表达阵列的差异杂交可以是一个有用的工具，以确定潜在的基因参与的致病机制H幽门．

      致谢

      本研究由中华民国台湾国家科学委员会“NSC 89-2320-B-182-019”资助。

      本文中使用的缩写

      VacA
      空泡毒素
      伊尔
      白介素
      的边后卫
      胎牛血清
      rt - pcr
      逆转录聚合酶链反应
      IL-5R
      白细胞介素5受体
      IGFBP2
      胰岛素样生长因子结合蛋白2

      参考文献

      1. ↵
        1. 索尔尼克合资企业，
        2. 汤普金斯LS
        （1992）幽门螺杆菌和胃十二指肠疾病:发病机制和宿主-寄生虫相互作用。感染剂1：284- - - - - -309．
        OpenUrl
      2. ↵
        1. 巴索乔丹
        （1993）幽门螺杆菌:“缓慢”细菌感染的微生物学。趋势Microbiol1：255- - - - - -260．
        OpenUrl CrossRef PubMed
      3. ↵
        1. 黑兹尔SL，
        2. MendzGL
        （1993）的代谢和酶幽门螺杆菌:功能和潜在的毒性作用。在幽门螺杆菌:生物学与临床实践。eds古德温CS，WorsleyBW（CRC的新闻，波卡拉顿),页115- - - - - -141．
      4. ↵
        1. 封面TL，
        2. 杜利CP，
        3. 巴索乔丹
        （1990）蛋白质的特征和人的血清学反应幽门螺杆菌具有空泡细胞毒素活性的肉汤培养上清液。感染Immun58：603- - - - - -609．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      5. ↵
        1. PiotrowskiJ
        （1998）脂多糖是一种毒力因子幽门螺杆菌:抗溃疡药的作用。J Physiol Pharmacol49：3.- - - - - -24．
        OpenUrl PubMed
      6. ↵
        1. Censini年代，
        2. 兰格C，
        3. 香Z，
        4. et al。
        （1996）Cag，一种致病性岛幽门螺杆菌，编码i型特异性和疾病相关的毒力因子。美国国家科学研究院93：14648- - - - - -14653．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      7. ↵
        1. OguraK，
        2. 高桥米，
        3. Maeda年代，
        4. et al。
        （1998）白介素8在人胃上皮细胞原代培养中的产生幽门螺杆菌。挖掘科学43：2738- - - - - -2743．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      8. ↵
        1. 什T，
        2. Terano一个
        （1998）趋化因子在幽门螺杆菌-被感染的胃粘膜杂志33：613- - - - - -617．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      9. ↵
        1. GionchettiP，
        2. VairaD，
        3. Campieri米，
        4. et al。
        （1994）黏膜白介素-6和-8 in增强幽门螺杆菌-阳性消化不良患者。是胃肠醇吗89：883- - - - - -887．
        OpenUrl PubMed 科学网
      10. ↵
        1. 拉默斯先生CB
        （1992）十二指肠溃疡的胃分泌异常:原发性或继发性幽门螺杆菌感染?Scand J胃肠醇补充剂194：99- - - - - -103．
        OpenUrl PubMed
      11. ↵
        1. 瓦莱J，
        2. PikkarainenP，
        3. Vuoristo米，
        4. et al。
        （1991）幽门螺杆菌还有十二指肠溃疡。十二指肠溃疡患者及其一级亲属的研究。Scand J胃肠醇补充剂186：45- - - - - -51．
        OpenUrl PubMed
      12. ↵
        1. 洞穴TR，
        2. 洞穴博士
        （1991）幽门螺杆菌刺激离体兔胃腺分泌胃蛋白酶。Scand J胃肠醇补充剂181：9- - - - - -14．
        OpenUrl PubMed
      13. ↵
        1. 鲁迪J，
        2. KuckD，
        3. 链年代，
        4. et al。
        （1998）CD95 (APO-1/Fas)受体和配体系统的参与幽门螺杆菌-诱导胃上皮细胞凋亡。J临床投资102：1506- - - - - -1514．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      14. ↵
        1. 琼斯问，
        2. 香农PT，
        3. CutzE，
        4. et al。
        （1997）胃上皮细胞增殖和凋亡的早期自然历史幽门螺杆菌感染。Am J Pathol151：1695- - - - - -1703．
        OpenUrl PubMed 科学网
      15. ↵
        1. 陈G，
        2. Sordillo新兴市场，
        3. Ramey工作组，
        4. et al。
        （1997）诱导胃上皮细胞凋亡幽门螺杆菌并伴有BAK表达增加。生物化学生物物理Res公社239：626- - - - - -632．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      16. ↵
        1. PignatelliB，
        2. BancelB，
        3. 埃J，
        4. et al。
        （1998）诱导型一氧化氮合酶，抗氧化酶和幽门螺杆菌人类胃炎感染和胃癌前病变。预防癌症7：439- - - - - -447．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      17. ↵
        1. 德雷克即时通讯，
        2. MapstoneNP，
        3. SchorahCJ，
        4. et al。
        （1998）幽门螺杆菌相关性胃炎中活性氧活性和脂质过氧化:与胃粘膜抗坏血酸浓度和抗坏血酸作用的关系幽门螺旋杆菌根除。肠道42：768- - - - - -771．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      18. ↵
        1. 黄l，
        2. 卢我的，
        3. 常CA，
        4. et al。
        （1996）幽门螺杆菌诱导人胃细胞的基因表达，通过mRNA差异显示鉴定。生物化学生物物理Res公社228：484- - - - - -488．
        OpenUrl CrossRef PubMed
      19. ↵
        1. DeRisiJ，
        2. Penlandl，
        3. 棕色（的）阿宝，
        4. et al。
        （1996）利用cDNA微阵列分析人类癌症中的基因表达模式。Nat麝猫14：457- - - - - -460．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      20. ↵
        1. 马丁KJ，
        2. 关颖珊CP，
        3. 塞奇R
        （1997)分子生物学的方法。eds凌P，Pardee一个（胡玛纳出版社，纽约),页77- - - - - -85．
      21. ↵
        1. 垫片C，
        2. 张W，
        3. RheeCH，
        4. et al。
        （1998）互补DNA表达阵列对人原发性宫颈癌差异表达基因的分析。临床癌症研究4：3045- - - - - -3050．
        OpenUrl 摘要
      22. ↵
        1. Sehgal一个，
        2. 博因顿艾尔，
        3. 年轻的射频，
        4. et al。
        （1998）Atlas人表达阵列差异杂交技术在人多形性胶质母细胞瘤肿瘤组织差异表达基因鉴定中的应用。外科医生67：234- - - - - -241．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      23. ↵
        1. Bubendorfl，
        2. KononenJ，
        3. KoivistoP，
        4. et al。
        （1999）组织微阵列上高通量荧光原位杂交研究前列腺癌进展过程中的基因扩增。癌症Res59：803- - - - - -806．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      24. ↵
        1. 汗J，
        2. 西蒙R，
        3. Bittner米，
        4. et al。
        （1998）用cDNA微阵列分析肺泡横纹肌肉瘤的基因表达。癌症Res58：5009- - - - - -5013．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      25. ↵
        1. HilsenbeckSG，
        2. 弗里德里希我们，
        3. 希夫R，
        4. et al。
        （1999）应用于他莫昔芬耐药问题的阵列表达数据的统计分析。中华泌尿外科肿瘤研究所91：453- - - - - -459．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      26. ↵
        1. DebouckC，
        2. 格拉汉姆·古德费勒PN
        （1999）DNA微阵列在药物研发中的应用。Nat麝猫21：48- - - - - -50．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      27. ↵
        1. Bieche我，
        2. Laurendeau我，
        3. Tozlu年代，
        4. et al。
        （1999）实时逆转录pcr定量乳腺散发性肿瘤MYC基因表达。癌症Res59：2757- - - - - -2765．
        OpenUrl
      28. ↵
        1. 吉布森UEM，
        2. HeidCA，
        3. 威廉姆斯点
        （1996）一种实时定量RT-PCR的新方法。基因组的方法6：995- - - - - -1001．
        OpenUrl
      29. ↵
        1. 克鲁斯N，
        2. Pette米，
        3. ToykaK，
        4. et al。
        （1997）RT-PCR定量冷冻血液中细胞因子mRNA的表达。J免疫方法210：195- - - - - -203．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      30. ↵
        1. 瓦格纳年代，
        2. 胆汁酸的W，
        3. 科·J，
        4. et al。
        （1997）幽门螺杆菌对胃上皮细胞生长的调节:细胞凋亡的主要作用。胃肠病学113：1836- - - - - -1847．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      31. ↵
        1. 封面TL，
        2. 缰绳SA，
        3. 巴索乔丹
        （1992）幽门螺杆菌肉汤培养上清诱导HeLa细胞空泡的研究。哼分册23：1004- - - - - -1010．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
      32. ↵
        1. 西格尔艾德，
        2. Falkow年代，
        3. 汤普金斯LS
        （1996）幽门螺杆菌附着胃细胞诱导细胞骨架重排和酪氨酸磷酸化宿主细胞蛋白质。美国国家科学研究院93：1259- - - - - -1264．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      33. ↵
        1. Aihara米，
        2. TsuchimotoD，
        3. TakizawaH，
        4. et al。
        （1997）胃癌细胞系MKN45参与幽门螺杆菌诱导的白介素-8生产的机制。感染Immun65：3218- - - - - -3224．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      34. ↵
        1. JehnBM，
        2. 奥斯本英航
        （1997）与凋亡相关的基因调控。Crit Rev真核基因表达7：179- - - - - -193．
        OpenUrl
      35. ↵
        1. Chiarieollo米，
        2. Marinissen乔丹，
        3. 为研究JS
        （2000）多个丝裂原激活蛋白激酶信号通路连接cot癌蛋白与c-jun启动子和细胞转化。Mol细胞生物学20.：1747- - - - - -1758．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      36. ↵
        1. 泰勒遗传算法，
        2. 汤普森乔丹，
        3. 赖WS，
        4. et al。
        （1995）在完整细胞中通过丝裂原刺激和丝裂原活化蛋白激酶磷酸化曲曲丙氨酸，一种潜在的锌指转录因子体外。生物化学270：13341- - - - - -13347．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      37. ↵
        1. 清水正孝N，
        2. 太米，
        3. 藤原C，
        4. et al。
        （1991）在12- o - 14 -乙酸酯诱导HL-60细胞巨噬细胞分化过程中新的直接早期基因的表达。生物化学266：12157- - - - - -12161．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      38. ↵
        1. 清水正孝N，
        2. 太米，
        3. 藤原C，
        4. et al。
        （1992）一个编码锌指蛋白的基因在12- o -十四紫果酸-13-乙酸刺激的HL-60细胞分化过程中诱导。J物化学111：272- - - - - -277．
        OpenUrl PubMed
      39. ↵
        1. 林C，
        2. 赌年代，
        3. SaffrichR，
        4. et al。
        （1998）cdc25B磷酸酶是人类细胞G2/M相变所必需的。细胞科学111：2445- - - - - -2453．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      40. ↵
        1. 小坂C，
        2. SasaguriT，
        3. 石田一个，
        4. et al。
        （1996）佛波酯和二酰基甘油诱导血管内皮细胞G2期细胞周期阻滞。Am J Physiol270：C170- - - - - -C178．
        OpenUrl PubMed 科学网
      41. ↵
        1. 温斯坦J，
        2. 雅各布森弗兰克-威廉姆斯，
        3. Hsu-ChenJ，
        4. et al。
        （1994）一种新的哺乳动物蛋白，p55CDC，存在于分裂细胞中，与蛋白激酶活性相关，并与酿酒酵母细胞分裂周期蛋白Cdc20和Cdc4同源。Mol细胞生物学14：3350- - - - - -3363．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      42. ↵
        1. 的基础米，
        2. 温斯坦J，
        3. 韩国门户网站小，
        4. et al。
        （1998）哺乳动物p55CDC介导纺锤体检查点蛋白Mad2与环体/后期促进复合物的关联，并参与调节后期发作和晚期有丝分裂事件。细胞生物学141：1393- - - - - -1406．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      43. ↵
        1. OrrenDK，
        2. 彼得森LN，
        3. 波尔弗吉尼亚州
        （1997）持续的DNA损伤抑制s期和G2的进展，并导致细胞凋亡。Mol生物细胞8：1129- - - - - -1142．
        OpenUrl 摘要/免费的全文
      44. ↵
        1. LombardiD，
        2. 拉康姆猪毫升
        （2000）Paggi毫克。NM23:阐明其在细胞分化中的生物学功能。细胞物理182：144- - - - - -149．
        OpenUrl CrossRef PubMed 科学网