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背景和目的慢性丙型肝炎是一种慢性疾病,最终导致许多患者肝细胞癌。虽然干扰素(IFN)疗法已经用于根除病毒,其成功率只有30%。在病人谁失败了(无),有几种模式的血清丙氨酸转氨酶(ALT)值,并检测血清HCV-RNA期间和之后干扰素治疗和改善长期预后是在病人的血清ALT值报告是由干扰素治疗即使正常化丙肝病毒病毒血症持续。本研究试图阐明病毒学特征导致这些差异。
方法完全或部分长度占主导地位的丙型肝炎病毒基因型序列1 b (HCV-1b)是由直接测序。首先,完成HCV-1b基因组序列测定6个无;三个显示血清ALT正常化值在IFN-α疗法和其他三个没有。随后,不同的氨基酸残基的两组在另一个82例进一步分析了回顾性分析。
结果比较序列提出一个协会的HCV-1b氨基酸2154 - 2172之间,血清ALT正常化。回顾性分析82例表明氨基酸替换的数量在这个地区是唯一的显著变量与ALT正常化(优势比31.0;95%置信区间-286 - 5.0)在多变量分析。
结论丙肝病毒基因组区域,与ALT回应似乎出现在例病毒学干扰素干扰素治疗无效的患者。
- 丙型肝炎病毒
- 丙氨酸转氨酶
- 生化反应
- 瞬态响应器
- NS5A蛋白
略语
- 干扰素
- 干扰素
- ALT
- 丙氨酸转氨酶
- 丙肝病毒
- 丙型肝炎病毒
- HCV-1b
- HCV基因型1 b
- 肝细胞癌
- 肝细胞癌
- CR
- 完整的应答器
- NR
- 的人
- BR
- 生化反应
- TR
- 瞬态响应器
- ISDR
- 干扰素敏感决定地区
- NCR
- 非编码区
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- 是
- ALT响应相关的元素
- HCV-2a
- 丙肝病毒基因型2
- HCV-2b
- 丙肝病毒基因型2 b
- 细胞毒性t淋巴细胞
- 细胞毒性T淋巴细胞
来自Altmetric.com的统计
丙型肝炎病毒(HCV)是一种单链RNA病毒组成的约9500个核苷酸。1 - 3持久的丙肝病毒感染导致慢性丙型肝炎,可能发展成肝硬化和肝细胞癌(HCC) 20 - 30年来在一些病人。4到目前为止,干扰素(IFN)单独或结合利巴韦林是唯一治疗慢性丙型肝炎的治疗。5然而,它的功效是低至30%患者感染HCV基因型1 b,在日本的主要基因型,即使足够多的干扰素是管理。6丙肝病毒血症在超过一半的HCV-1b不清除感染的病人,他们继续疾病进展的风险。临床和病毒学的分析结果,针对这些患者是很重要的。
完整的回答者(CR)干扰素治疗被定义为一个病人为阴性血清HCV-RNA,化验的逆转录-聚合酶链反应在六个月后,最后的干扰素。5病人不符合这一标准被定义为一个人(NR)。然而,关系可分为子组根据血清丙氨酸转氨酶(ALT)值和/或HCV-RNA的存在。图1示意图显示了ALT值的关系。在图1,ALT值持续异常整个疗程。这组被定义为生化无(浅层)在这项研究。在图1B, ALT值是暂时性的正常化在干扰素治疗(通常在八周内),他们回到正常水平后六个月内停止干扰素管理。这组被定义为生化瞬态反应(bTRs)。在图1在干扰素治疗C, ALT值正常化,持续超过六个月后治疗。这个群体是一个特殊的子群的bTR bTR可以包含,但我们这个病人组定义为生化反应(BRs)。这些不同的课程似乎bTR - BR临床相关性。笠原等患者报告说,图中所示的临床过程1B或1C患肝癌的风险较低7相比之下,那些显示在无花果1答:Nishiguchi等还报导说,降低ALT值由于干扰素治疗导致肝癌的发病率下降。8也被报道,肝癌的发病率下降BR的病人。6这肝癌发病率降低意味着更好的这些患者的长期预后。
原理图的典型临床课程的血清丙氨酸转氨酶(ALT)值期间和之后干扰素(IFN)治疗。(一)病人没有ALT正常化(生化人(方向));(B)患者ALT正常化和随后爆发(生化瞬态响应(bTR));和(C)患者ALT正常化和干扰素治疗后持续正常的ALT值(生化响应(BR))。
我们最近报道,病人显示瞬时血清HCV-RNA失踪期间和之后不久(少于6个月)干扰素治疗(我们定义等病人病毒学瞬态反应(录像机))显示降低肝癌的发生率与患者没有经验HCV-RNA失踪期间和干扰素治疗后(病毒学无(vNRs)) (N和泉等未发表的观察)。作为一个可能的解释这些观察,Poynard等表明,干扰素治疗显著降低纤维化的炎症活动的级别和阶段,9导致的降低患肝癌的风险。在这项研究中,我们试图阐明病毒(s)与行列式bTRs因为它可能与干扰素治疗的预后更好。
在我们先前的研究已经表明,抗干扰素的病人可以通过替换数量预测IFN灵敏度确定地区(ISDR)10,11但病毒学因素有关模式的差异ALT波动关系尚未确定。因此我们分析了丙肝病毒的完整基因组阐明任何病毒学因素可能与ALT波动的不同模式。
患者和方法
病人
我们研究了88例慢性HCV-1b感染。都是阳性血清anti-HCV抗体(第三代试验)和血清HCV-RNA genotype-1b。12,13血清HCV-RNA水平由支链DNA分析14(Quantiplex HCV-RNA凯龙星,维尔,加利福尼亚,美国)。试验的检测极限是050万基因组等价物/毫升。患者为阴性血清HBs抗原,anti-HBc抗体,抗核抗体,和没有其他肝炎的原因,包括过度饮酒或肝毒素的药物。肝活检是在所有的病人,慢性活动性肝炎的存在是组织学检查证实。书面知情同意了从每个病人肝脏活组织检查,和研究协议符合伦理指南1975年赫尔辛基宣言。机构获得批准。
最初,完整的丙肝病毒序列测定六个病人。所有六个接受干扰素治疗,但被发现是关系。每个血清样本获得之前干扰素治疗的开始。其中,三个显示干扰素治疗期间及之后持续升高血清ALT值(类似于图中所示的临床过程1)(ALT升高组),和其他三个,血清ALT值正常化后八周内开始干扰素治疗,类似于图中所示的临床过程1B(正常化ALT组)。病人的临床背景如表所示1。六个全长序列对齐,氨基酸(编码区)或核苷酸(对于非编码区域(NCR))使用两组之间的比较。只有残留的氨基酸或核苷酸用法是完全不同的被视为可能与不同的临床相关课程。
随后,选定的残留测定的序列在另一个28个病人,只有区域的氨基酸使用不同显著升高和正常化ALT组进一步分析。最后,氨基酸序列之间的关系和临床课程在82例回顾性分析。
RNA提取
进行了实验方法如前所述。15,16血清acid-guanidium-phenol-chloroform提取RNA的方法。短暂,150μl血清混合700μl等基因(Wako纯化学工业,日本大阪),和水相140μl氯仿提取一次。RNA是异丙醇沉淀与20μg糖原(勃林格曼海姆,美瀚,德国)作为载体。与乙醇合成RNA是洗一次,终于在10μl溶解水和储存在−70°C到使用。
互补脱氧核糖核酸的合成
5μl反应体积包含1μl RNA溶液,50 U逆转录酶(M-MLV逆转录酶;美国生命技术公司,马里兰州)及其伴随的缓冲区,10个单位的核糖核酸酶抑制剂(Promega Corp .,麦迪逊,威斯康辛州,美国),和50 pg随机五个一(豆类,京都,日本)。混合物在37°C孵化了40分钟。
聚合酶链反应(PCR)
丙肝病毒完整基因组被嵌套PCR扩增与20部分重叠引物组。10,15我们使用热启动PCR技术用蜡(Ampliwax PCR宝石50;豆类)。较低的解决方案包含1.5毫米MgCl2,400海里的PCR引物,200μM脱氧核苷三磷酸。上的解决方案,1μl cDNA解决方案是溶解在50μl PCR混合物包含10毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(8.3),0.01%的明胶,和0.5 U的Taq (AmpliTaq;Promega corp .)。
序列测定
每个PCR产物纯化和过度引物被排除在外的列(Suprec 02;豆类)根据制造商的指示。此后,两股PCR产品周期的测序与棱镜染料终止工具包(应用生物系统公司、千叶、日本)根据制造商的指示。测序引物是M13正向引物链和一个M13反向反义链引物。列产品纯化(Quickspin列;勃林格曼海姆,印第安纳波利斯,印第安纳州,美国)并使用一个自动测序DNA测序仪(型号373年代;应用生物系统公司)。的核苷酸序列和推导的氨基酸序列比较使用HCV-J17作为参考。
统计分析
的χ2测试或确切概率法用于氨基酸的使用,比较合适(Statview-J v . 4.5;日本东京,Hulinks Inc .)。统计分析临床参数和氨基酸序列之间的关系是由逻辑回归分析(单变量或多个)无条件转移指令程序(3.1 v, SAS研究所卡里,北卡罗莱纳,美国)。
结果
比较完整的丙肝病毒序列
编码氨基酸的密码子是完全不同的两组之间图所示2。完整的氨基酸使用差异中观察到只有五残留。丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸和亮氨酸被用于氨基酸1087年,2024年,2155年,2169年和2466年,分别在ALT升高组;这些都是在HCV-J相同。然而,丙氨酸,缬氨酸,脯氨酸,苏氨酸和谷氨酰胺,分别用于正常的ALT。没有在协助核苷酸的差异使用。
编码氨基酸的密码子之间是不同的两组。上面列显示丙型肝炎病毒(HCV)的体系结构多蛋白和较低的列显示了氨基酸残基的分布。每组氨基酸用法和HCV-J最低表所示。氨基酸是描述的单字母代码。
随后,氨基酸序列在这五个残留测定28评分。其中,16属于ALT升高组(方向)和12正常化ALT集团(bTR)。氨基酸用法明显不同的两组之间的氨基酸通过χ2155 (p = 0.0222bTR测试中,脯氨酸和亮氨酸方向)和2169年(p = 0.050确切概率法,bTR苏氨酸和丙氨酸方向)。然而,没有显著差异在氨基酸1087 (p > 0.99确切概率法,bTR丙氨酸和丝氨酸方向),2024 (p = 0.11确切概率法,bTR缬氨酸和异亮氨酸方向),或2466年通过χ(p = 0.132测试中,谷氨酰胺bTR和亮氨酸方向)。除了这些残留物、氨基酸用法也不同氨基酸2171 (p = 0.044确切概率法,non-leucine bTR和亮氨酸方向)。因此,氨基酸序列预测氨基酸在该地区从2154年到2172年显示相关的血清ALT值在干扰素治疗。我们建议名称这一地区ALT响应相关的元素(是)。丙肝病毒的正常化ALT组相比,这个地区有更多的氨基酸替换HCV-J而丙肝病毒的ALT升高组有更少。从这些初步结果,我们之间的关系探讨干扰素治疗期间及之后的ALT值的序列是在大量的病人。
ALT响应之间的关系,分析
总共82名患者被纳入分析。所有患者接受干扰素治疗和被认为是关系。82例患者中,25属于ALT升高组(方向)和57正常化ALT组(bTR)。在正常组,23岁符合BR的标准;干扰素治疗期间所有BR患者显示ALT正常化。临床背景的病人在每一组列于表2。图3演示了ALT响应的序列之间的关系。氨基酸替换似乎只允许在氨基酸2154,2155,2169,2171。在氨基酸的数量不同于HCV-1b(定义为“替换”)的增加,更可能是一个ALT响应。图4显示了ALT正常化率之间的关系和替换的数量。替换数量范围从0到4。显然,ALT响应率与替换的数量呈正相关(p = 0.004简单的χ2测试)。
氨基酸序列之间的关系在丙氨酸转氨酶(ALT)响应相关的元素(82年)的病人。氨基酸残基从2154年到2172年。相同的氨基酸残基HCV-J显示为“-”。满圈(•)表明,血清ALT值正常化在干扰素治疗。*生化反应。
替换数量之间的关系的丙氨酸转氨酶(ALT)响应相关的元素(是)和患者ALT正常化的比例。每组的患者数量显示在括号中。
此外,替换的数量之间的关系和vTR-that,消失的血清HCV-RNA-was分析。虽然经常bTR恰逢录像机(p < 0.0001,χ2测试),两者之间的分离现象也观察到(表3在一些病人)。特别是bTR之前BR在所有23 BR患者(根据定义),而之前录像机BR只有17岁的病人。
因素可能与ALT正常化进行分析通过单变量分析替代的数量,数量替换ISDR,血清HCV-RNA滴定度,年龄,F因子(根据国际标准18),预处理血清ALT值作为自变量(表4)。使用这种分析,只提取替换数量统计上显著的因素(p = 0.0003)。随后的多元逻辑回归分析显示,替换的数量是唯一ALT正常化的独立因素(p = 0.0007)(表4B)。上述变量,只有数量替换ISDR与替换的数量(p = 0.003)。替换的数量之间的关系和BR没有达到统计学意义。
最后,替换数量确定在11患者接受干扰素治疗,CRs。然而,没有发现血清ALT值之间的关系在干扰素治疗和替代的数量。替换的数量也在这群范围从0到4。的氨基酸序列在HCV-2a(对应氨基酸HC-J6 2158 - 2176;五个氨基酸替换存在而HCV-J)和HCV-2b(对应氨基酸2158到2176 HC-J8;六个氨基酸替换存在而HCV-J)也决定在六HCV-2a感染患者和10 HCV-2b,所有人接受干扰素治疗和关系,但在干扰素治疗,TRs ALT正常化。然而,只有一个氨基酸替换在HCV-2a (T2176M)在5 6个病人,也没有氨基酸HCV-2b多态性观察在这个地区。
讨论
在这项研究中,ALT的模式之间的关系对干扰素治疗和丙肝病毒序列进行了分析。我们发现氨基酸替换NS5A(氨基酸2154 - 2172,一个地区我们有叫ALT响应相关的元素())与原型HCV-1b不同序列,是与ALT正常化在干扰素治疗密切相关。
病毒基因组序列的变化和临床表现与一些RNA病毒,如pestiviridae(包括丙肝病毒)和黄。encephalitogenic黄病毒,如黄热病病毒、乙型脑炎病毒,或者虱传播脑炎病毒,衰减通道病毒一直与氨基酸蛋白E的变化有关,和一个氨基酸的变化的一个关键决定因素蛋白E可以满足neuroinvasiveness的损失。19然而,研究解决这个问题在丙肝病毒是罕见的。我们以前所示慢性丙型肝炎的自然时间相关的氨基酸替换NS5A / NS5B丙肝病毒的蛋白质与肝炎活动的变化相关联15;我们都知道这是唯一的报告将丙肝病毒基因组序列与肝炎的活动。同样,目前的研究显示了丙肝病毒序列之间的关系,血清ALT水平,反映在干扰素治疗肝炎活动。迄今为止,肝炎活动的差异在不同患者的慢性丙型肝炎的自然从的角度分析主要宿主的遗传背景。例如,HLA-DR5报道与anti-HCV阳性症状有关个人自由,20.和TAP2 * 0103(抗原处理相关转运子2)与患者有关持续正常的ALT值。21然而,我们的研究结果表明,病毒序列可能也很重要。
我们以前国际减灾战略系统特征序列位置2209 - 2248 NS5A蛋白的丙肝病毒的病毒学行列式预测干扰素治疗的疗效。10,11虽然基因组区域的不同于ISDR, ISDR序列在丙肝病毒与慢性丙型肝炎的临床表现在日本病人,ISDR序列是有用的预测一个完整的反应是否会实现11虽然似乎有一些争议。同样,可用于预测序列ALT正常化是否会发生,尽管未来的研究有必要建立。
国际减灾战略系统位于大约60个氨基酸序列的下游,和氨基酸替换的数量在这两个地区是相关的。虽然不能从这项研究中得出的结论有任何功能之间的关系,国际减灾战略系统,它是可能的,他们可能会一起操作。虽然Duverlie等最近建议替换2169氨基酸对干扰素治疗的敏感性有关,22我们无法证实这个发现在目前的研究中,因为没有替换的数量之间的关系和CRs ALT反应被发现。可能会有一些差异在日本和欧洲之间的丙肝病毒株,23并将需要进一步的研究来确定之间的任何关系,国际减灾战略系统。
迄今为止,编码的肽的功能和邻近地区尚未完全阐明。是序列位于酸性域1,这对于NS5A的反式激活因子活动是很重要的。24 - 26日尽管氨基酸替换的功能意义在序列等待进一步的体外研究中,L2155P替换可能对反式激活因子有影响的活动,因为它改变了极性的氨基酸。事实上,我们已经表明,氨基酸突变酸性减弱NS5A的反式激活因子的活动领域。24另一项研究表明,有一个可能的替代方法处理网站2172年NS5A蛋白的氨基酸27NS3蛋白酶。处理这个网站产生截断NS5A蛋白,可以把到核反式激活因子和展览活动。氨基酸替换在2169、2171和2172年可能会改变这个假定的NS5A函数处理效率和影响力。
bTR之间有很强的相关性在干扰素治疗和录像机,尽管不一致的情况下也被观察到。在替换的关系以及bTR似乎比录像机更直接,bTR和录像机的共线性多变量分析困难的歧视;更大数量的样品需要解决这一点。
另外,深刻的抑制HCV-RNA复制在肝组织中干扰素执政期间可能会导致抑制肝细胞损伤导致降低ALT水平。如果是这样,可能确定在干扰素治疗丙肝病毒复制的功效。在慢性丙型肝炎被认为是肝细胞损伤引起的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对病毒衍生肽在肝细胞表面HLA分子。因此,深刻的抑制丙肝病毒复制的干扰素可能导致此类病毒抗原表位的消失导致减少肝细胞损伤。另外,可以直接确定的活动在干扰素治疗肝炎。例如,一个特定的序列可以调节HLA表达式或肽的演讲中,这通常是由干扰素提升,导致肝细胞损伤降低了CTL。事实上,最近的一份报告表明,多态性在肽转运体参与抗原表达与肝炎有关活动。22
有人建议,长期预后可能改善,即使在患者没有成为CRs干扰素治疗。笠原等显示在一个队列研究的1022例肝细胞癌的累积发病率明显高于在患者持续异常ALT值。7跟踪研究大量的病人6证明可以降低肝癌的发生率。最近,我们发现患者录像机也患肝癌低概率的前瞻性分析。这些发现表明,干扰素治疗的好处可能不会观察到只有在br(那些ALT课程像无花果1C),而且在bTRs不满足标准BR(那些ALT课程像无花果1B)。这种干扰素治疗的长期效应可能继发于降低肝病的进展通过减少炎症活动的品位和纤维化阶段8,28或直接烧蚀anti-oncogenic癌前细胞的干扰素引起的干扰素调节因子1的效果。28
尽管re-biopsy干扰素治疗后并没有表现在这项研究中,它是合理的假设,减少炎症活动也发生在我们的主题显示正常干扰素治疗后血清ALT值。因此,病毒学标志来识别一组患者有一个更好的长期预后干扰素治疗后建议在这项研究中,它是有效的,即使在那些血清丙肝病毒通过干扰素不能根除。
总之,(是)一个序列元素HCV-1b NS5A蛋白的鉴定,明显与血清ALT正常化或短暂HCV-RNA消失在干扰素治疗那些没有成为CRs。替换在患者的可能性可能会提出一个更好的长期预后,并表明,序列可能是一个有用的标志选择候选人干扰素治疗。虽然突变的生物学意义是目前未知,一个解释可能有助于我们理解底层机制导致慢性丙型肝炎肝细胞损伤。
确认
这部分工作是支持项目推广的基本健康科学研究组织药物ADR救援,日本研发推广和产品评论和补助金(08457164)日本教育部、科学、文化、体育运动。
略语
- 干扰素
- 干扰素
- ALT
- 丙氨酸转氨酶
- 丙肝病毒
- 丙型肝炎病毒
- HCV-1b
- HCV基因型1 b
- 肝细胞癌
- 肝细胞癌
- CR
- 完整的应答器
- NR
- 的人
- BR
- 生化反应
- TR
- 瞬态响应器
- ISDR
- 干扰素敏感决定地区
- NCR
- 非编码区
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- 是
- ALT响应相关的元素
- HCV-2a
- 丙肝病毒基因型2
- HCV-2b
- 丙肝病毒基因型2 b
- 细胞毒性t淋巴细胞
- 细胞毒性T淋巴细胞