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肝脏疾病
基因表达的白介素18如果酒精性肝硬变患者的外周血单核细胞
免费的
  1. C Hanck一个,d,
  2. T Manigoldd,
  3. U薄满乐d,
  4. M Kurimotob,
  5. C B Kolbelc,
  6. mv歌手d,
  7. 年代Rossold
  1. 一个医学系的,市区的医院,随处可见/ Coira,瑞士,b藤崎研究所、日本冈山日本,c美因茨大学胃肠病学部门医院在特里尔,德国,d医学系的IV(胃肠病学和肝脏病学)、德国海德堡在曼海姆大学医院
  1. 医学系的C Hanck博士市区的医院,7000 / Coira随处可见,瑞士。christoph.hanck在{}ksc.gr.ch

文摘

背景大多数患者酒精诱导肝硬化(AC)和慢性endotoxinaemia不患有临床明显的系统性炎症反应。这可能是由于改变了细胞因子的基因表达,可能与内毒素(例如,宽容和敏化作用)。白介素18(地震;白介素γ)诱导因素调节局部细胞因子的生产对内毒素(脂多糖(LPS))。

目的探讨系统性免疫反应的患者交流,看看如果患者外周血单核细胞(PBMC)从AC和地震导致基因表达激活。

方法等离子体水平的内毒素(LPS)和血清水平的地震测量酶联免疫测定和变形细胞溶解产物测试74年节制患者交流的不同阶段(儿童阶段,n = 18;B、n = 22;C, n = 34)并与健康对照组(n = 43)。基因表达的地震评估半定量逆转录-聚合酶链反应在新鲜分离,如果患者PBMC的子群14 AC与五个健康对照组相比。

结果地震-特定的信使rna的基因表达如果患者PBMC显著增强先进AC(儿童阶段C)和血清与血浆LPS和CD14水平(斯皮尔曼等级相关的因素r= 0.76,r= 0.72)。地震的血清浓度也升高较健康对照组(p < 0.001),但与血清水平的相关性CD14和等离子体水平的有限合伙人与信使rna中的弱数据(斯皮尔曼等级相关的因素r= 0.47,r= 0.26)。

结论我们体内的数据显示的“如果”PBMC presensitisation AC患者的循环内毒素。“如果”这个词可能是患者的交流不足。还需要进一步的调查来定义PBMC的敏化作用的确切机制和本地化体内。

  • 肝硬化
  • 外周血单核细胞
  • 白介素18
  • 脂多糖

  • 略语

    PBMC
    外周血单核细胞
    交流
    酒精诱发肝硬化
    TNF-α
    肿瘤坏死因子
    地震-
    白介素18
    有限合伙人
    脂多糖
    美国公共电视台
    磷酸缓冲盐
    rt - pcr
    逆转录-聚合酶链反应
    G3PDH
    甘油醛3磷酸脱氢酶

    • http://dx.doi.org/10.1136/gut.49.1.106

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      木糖醇是生理上出现在门户静脉血。1,2如果肝脏清除受损,系统性endotoxinaemia可能结果(由于门体静脉的分流、功能缺陷在肝脏网状内皮系统的吞噬能力,和减少内毒素结合全血的能力2 - 5)。

      尽管血清细胞因子和血浆内毒素水平升高,2,3,6 - 9大多数患者酒精诱导肝硬化(AC)和慢性endotoxinaemia不患有临床明显的系统性炎症反应。这可能是由于改变了细胞因子的基因表达,可能与内毒素(例如,宽容和敏化作用)。10

      我们最近报道增强mRNA的表达促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)如果患者外周血单核细胞(PBMC)先进的交流但没有阐明潜在的机制(下降)调节免疫反应的交流。11

      白介素18(地震;白介素γ诱导因素)是最近描述肽调节因子在主机对细菌内毒素(脂多糖(LPS))导致在PBMC TNF-α生产。12,13基因表达在体外,地震最初认为是监管结构上没有增加或减少与LPS刺激。14,15然而,最近的数据显示,地震的表情显然是有限合伙人治疗后检测。16,17此外,地震-调节局部细胞因子生产反应有限合伙人。18,19地震是一个关键因素在急性系统性炎症反应(大肠杆菌诱导)endotoxaemia-inflammatory反应,这可能是下调是否中和地震。20.这不仅表明地震可能发挥作用作为一个标记患者的疾病活动的交流,但也可能潜在影响交流的治疗策略。

      因此本研究的目的是调查如果地震是参与免疫反应的患者的交流(临床上没有明显迹象的系统性炎症反应)和测试假设如果从AC患者PBMC被激活和地震导致基因表达。

      患者和方法

      病人

      74例患者确认的研究小组由AC(儿童阶段,n = 18;儿童阶段B, n = 22;儿童阶段C, n = 34)。21四十三个年龄和性别匹配的健康个体没有酒精滥用的历史和正常肝脏功能测试作为控制(表1)。

      把这个表:
      表1

      74酒精诱导肝硬化患者和43的控制

      诊断为交流确认组织学(n = 55)或临床(n = 19)如果活检是不可用(例如,由于凝血障碍)。建立了临床诊断的病人展示儿童硬化指数> 6和门静脉高压的迹象(内窥镜证明是食管静脉曲张;transjugular-portocaval分流)。以前历史的日常摄入乙醇⩾80克/天的男性和女性⩾30克/天请求超过五年。

      排除标准的存在是酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肾功能不全(血清肌酐> 115μmol / l),或恶性肿瘤。禁欲一段时间不到6个月的患者(即超过一些比较研究与禁欲时间1 - 2个月8)被排除在外(例如,标记患者最近的酒精abuse-namely,碳水化合物不足血清转铁蛋白水平升高的存在和/或早期降低γ谷酰基转肽酶,如前所述22,23),以避免酒精性肝炎患者24如果活检是不可用的。没有明显的病人患有活动性消化道出血或者感染的迹象(发热、白细胞计数升高)。

      mRNA表达地震的评估如果PBMC在14(74)的一组中患者组织学证实稳定的交流(儿童阶段,n = 4;儿童阶段B、n = 5;儿童阶段C, n = 5)。21这项研究是由大学医院伦理委员会批准。

      分离外周血单核细胞(PBMC)

      外周静脉血液(10 - 20毫升)从患者和健康志愿者获得了静脉穿刺和收集到heparinised,无菌,热原质免费一次性注射器与内毒素肝素(10 U /毫升)。

      PBMC标准密度梯度离心法分离(Ficoll-Paque方法;Biochrom,柏林253×10)和调整6细胞/毫升缓冲RPMI 1640补充10% (v / v)热灭活胎牛血清。RNA提取,细胞在1200 rpm并存储在4 M GTC提取缓冲−80°C。

      免疫测定的地震

      血清浓度的地震在重复测定特定夹心酶联免疫分析法(ELISA);藤崎研究所冈山林原生化实验室,Inc .)、冈山、日本)和一些细微的修改。26,27短暂,96年microtitre板块(Nunc Maxisorp,丹麦)被涂上一层100μl主单克隆抗体对地震(2.5μg /毫升在磷酸缓冲盐(PBS)和三个小时在室温下孵化。涂覆盘子洗在PBS /渐变20缓冲区和阻塞250μl 1%牛血清白蛋白在PBS一夜之间在4°C。样本、1:5稀释和连续稀释的重组的地震标准,被添加到盘子和孵化了两个小时在20°C。

      洗后用PBS /渐变20缓冲区,100μl过氧化物酶共轭单克隆抗体检测(工作浓度0.05μg /毫升)在室温下被添加了三个小时。的酶反应是使用100μl开发10更易与l tetramethylbenzidine 80更易与l H2O2,30 l更易与柠檬酸钾(pH值4.1)。孵化在室温15 - 20分钟后,反应终止了50μl 2 N H2所以4和光学密度在450 nm (Emax读者,MWG、Ebersberg、德国;参考650海里)。值测定的标准曲线(8 - 500 pg / ml),使用串行稀释重组的地震构造标准,基于纯化兔多克隆anti-IL-18结合辣根过氧化物酶。4-Amino-antipyrine磷酸钾缓冲作为底物,和颜色强度为492 nm。这个ELISA检测极限是7.8 pg / ml, interassay内方差为5.8(2.1)和8.2 (2.4)。特定于地震- ELISA显示没有交叉反应性(例如,与其他重组细胞因子或细胞因子受体(白介素- 2,干扰素γ,il - 4, TNF-α,和重组TNF受体))在一个广泛的浓度(0.1 pg / ml 1μg /毫升)。

      RNA隔离和地震-逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)分析

      如果从15节制肝硬化患者PBMC新鲜分离后直接聚蔗糖梯度分离。从分离PBMC细胞总RNA提取使用酸phenol-chloroform提取方法,如前所述。28RNA浓度是量化spectrophotometrically, RNA降解和纯度由1.5%琼脂糖凝胶上电泳评估含有甲醛。

      互补脱氧核糖核酸的PBMC使用1μg RNA通过RT和低聚糖d (T)引物。地震- PCR和甘油醛3 -磷酸脱氢酶(G3PDH)进行最后的25μl热循环使用5μl cDNA(珀金埃尔默鲸鱼座)35周期,每个组成94°C一分钟,一分钟55°C,进一步扩展为一分钟72°C。25组件的PCR反应10×PCR缓冲(200毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(8.4),500毫米氯化钾)和10毫米混合核苷酸(每个dATP 10毫米,dCTP dGTP, dTTP;Boehringer-Mannheim,德国曼海姆)。细胞因子对引物设计跨越exon-exon连词,因此mRNA / cDNA特定的和无电抗基因组DNA。

      使用下面的寡核苷酸引物序列:地震(放大产品342个基点)5′GCT TGA ATC TAA ATT ATC AGT C,下来3′棉酚得到柠檬酸AAT TGC ATC TTA T;G3PDH(放大产品983个基点;美国帕洛阿尔托Clontech实验室Inc .) 5′TGA gg TCG GAG柠檬酸ACG手枪TTG GT,下来3′猫GTG GGC猫呕吐GTC CAC CAC。15

      放大产品被在2%琼脂糖凝胶电泳分离,得到由紫外线光照明使用溴化乙锭染色。

      100个基点DNA梯是并行运行作为一个分子标记大小。光密度的评估PCR产品使用简单+ 3.2执行软件(Herolab, Wiesloch,德国)。

      半定量PCR结果生成的评分之间的比例微目标细胞因子和管家酶的结果(例如,地震mRNA的比率除以G3PDH)。

      内毒素测定

      血浆内毒素水平测定使用一个自动化的动能turbodimetric鲎变形细胞溶解产物microtitre测试与个别内部标准化(如前所述)。29日,30.内毒素参考曲线飙升50μl成立于每个样本的每个样本(1:5稀释和加热在80°C) 25μl有限合伙人获得的2500年,500年,50岁,5,0.5,0.05,0 pg / ml的有限合伙人。有限合伙人NP 3 (Novo Pyrexal,怀德,华尔道夫酒店,德国;100 pg NP3 = 1欧盟EC-5 FDA)使用。然后25μl溶解产物被添加(怀德)。增加光密度测量在37°C每隔30秒100分钟405海里。试验的敏感性为0.1 pg / ml。30.

      可溶性CD14化验

      血清浓度的可溶性CD14使用商用ELISA测定根据制造商的规格(IBL,汉堡,德国)。

      统计分析

      非参数测试被用来分析地震的结果。特别是,Mann-Whitney U测试是用来比较两组之间的数据和克鲁斯卡尔-沃利斯检验三个和更多的组之间比较数据。所有的值表示为中值(范围)。箱形图提供值中位数(95%置信区间)。一个p值< 0.05被认为是显著的。

      结果

      血清的地震水平(ELISA)在交流

      患者的血清水平的地震- AC的儿童阶段B (n = 22)和C (n = 34)明显升高而患有儿童阶段(n = 18)或健康对照组(n = 43) (p < 0.001)(图1)。

      Interleukin 18 (IL-18) serum levels (ELISA) were significantly increased in patients with alcohol induced cirrhosis with Child-Pugh stage C disease (n=34; median 456.15 pg/ml; range 163.1–1643.0) compared with healthy controls (n=43; median 135.5 pg/ml; range 62.9–476.1) and patients with Child-Pugh stage A (n=18; median 195.25 pg/ml; range 59.8–598.9). Moreover, significant differences were found between healthy controls and Child-Pugh stage B (n=22; median 355.15 pg/ml; range 119.8–792.9). Box plots indicate the median and 95% confidence intervals (CI). Individual data points are mean serum levels above or below the 95% CI. ***p<0.001.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
      图1

      白介素18(地震)血清(ELISA)在酒精诱导肝硬化患者显著增加儿童阶段C疾病(n = 34;中位数456.15 pg / ml;范围163.1 - -1643.0)与健康对照组(n = 43;中位数135.5 pg / ml;范围62.9 - -476.1)和儿童患者阶段(n = 18;中位数195.25 pg / ml;范围59.8 - -598.9)。此外,健康对照组之间的显著差异被发现和儿童阶段B (n = 22;中位数355.15 pg / ml;范围119.8 - -792.9)。 Box plots indicate the median and 95% confidence intervals (CI). Individual data points are mean serum levels above or below the 95% CI. ***p<0.001.

      此外,CD14的血清水平(无花果2)和等离子体水平的有限合伙人(无花果3)AC患者在儿童阶段B和C显著升高(p < 0.001),与健康对照组相比(p < 0.001)。

      CD14 serum levels (ELISA) were significantly increased in patients with alcohol induced cirrhosis with Child-Pugh stage C disease (n=34; median 5.95 μg/ml; range 2.62–7.71) compared with healthy controls (n=43; median 2.98 μg/ml; range 2.19–5.9) and patients with Child-Pugh stage A (n=18; median 4.0 μg/ml; range 1–6.18). Moreover, significant differences were found between healthy controls and Child-Pugh stage B (n=22; median 4.8 μg/ml; range 2.86–6.54). Box plots show median and 95% confidence intervals (CI). Individual data points are mean serum levels above or below the 95% CI. ***p<0.001.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
      图2

      CD14血清(ELISA)显著增加酒精诱导肝硬化患者和儿童阶段C疾病(n = 34;中位数5.95μg /毫升;范围2.62 - -7.71)与健康对照组(n = 43;中位数2.98μg /毫升;范围2.19 - -5.9)和儿童患者阶段(n = 18;中位数4.0μg /毫升;范围1 - 6.18)。此外,健康对照组之间的显著差异被发现和儿童阶段B (n = 22;中位数4.8μg /毫升;范围2.86 - -6.54)。 Box plots show median and 95% confidence intervals (CI). Individual data points are mean serum levels above or below the 95% CI. ***p<0.001.

      Lipopolysaccharide (LPS) plasma levels were significantly increased in patients with alcohol induced cirrhosis with Child-Pugh stage C disease (n=34; median 1.4 pg/ml; range 0–63) compared with healthy controls (n=43; median 0 pg/ml; range 0–0) and patients with Child-Pugh stage A (n=18; median 0 pg/ml; range 0–0.7). Moreover, significant differences were found between healthy controls and Child-Pugh stage B (n=22; median 0 pg/ml; range 0–6.7). Box plots show median and 95% confidence intervals (CI). Individual data points are mean serum levels above or below the 95% CI. ***p<0.001.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
      图3

      脂多糖(LPS)等离子体水平显著增加酒精诱导肝硬化患者和儿童阶段C疾病(n = 34;中位数1.4 pg / ml;范围0 - 63)与健康对照组(n = 43;值0 pg / ml;范围0 - 0)和儿童患者阶段(n = 18;值0 pg / ml;范围0 - 0.7)。此外,健康对照组之间的显著差异被发现和儿童阶段B (n = 22;值0 pg / ml;范围0 - 6.7)。 Box plots show median and 95% confidence intervals (CI). Individual data points are mean serum levels above or below the 95% CI. ***p<0.001.

      斯皮尔曼等级相关分析显示血清水平的地震和CD14之间显著相关(r= 0.47,p < 0.001)(图4)和一个与相应的等离子体水平的有限合伙人(弱相关r= 0.26;p < 0.05;数据未显示)。

      Spearman rank analysis reveals a significant correlation between serum levels of interleukin 18 (IL-18) and CD14 (r= 0.47, p<0.001).
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
      图4

      斯皮尔曼秩分析显示血清白介素18水平之间的显著相关性(地震)和CD14 (r = 0.47, p < 0.001)。

      表达人类的地震- rt - pcr检测

      半定量rt - pcr显示,如果没有区别mRNA表达地震的患者PBMC AC (n = 14)的儿童阶段(n = 4)和B (n = 5)与五个健康对照。相比之下,增强mRNA的表达的地震中被发现如果患者PBMC交流儿童阶段C (n = 5)与健康对照组(n = 5;p < 0.01),儿童阶段(n = 4;p < 0.01)(图5A、B)。

      (A) mRNA expression of human interleukin 18 (IL-18) in unstimulated freshly isolated peripheral blood mononuclear cells of patients with alcohol induced cirrhosis (Child's stage A–C; n=14) compared with healthy controls (n=5). One patient with Child-Pugh stage A was retrospectively excluded as this patient did not fulfill the inclusion criteria (for example, a single drink/alcohol intake shortly before liver biopsy and venous puncture; histologically no alcoholic hepatitis; no blood parameters of chronic alcohol consumption either at the time of venous puncture or at previous examinations in the outpatient department for more than two years). GPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. (B) Semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) (ratio of mRNA of IL-18/GPDH) revealed that significantly more RT mRNA was expressed in Child's stages B/C than in stage A. Median (range) for Child's stage A, 0.02 (0.01–0.15); for Child's stage B, 0.21 (0.09–0.38); and for Child's stage C, 0.39 (0.32–1.69). Box plots show median and 95% confidence intervals (CI). Individual data points are mean serum levels above or below the 95% CI. *p<0.05.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
      图5

      (A) mRNA的表达人类白介素18(地震),如果新孤立酒精诱导肝硬化患者外周血单核细胞(孩子的A - c阶段;n = 14)与健康对照组(n = 5)。一个儿童阶段患者回顾性排除是这个病人不满足入选标准(例如,一个喝/饮酒前不久肝活检和静脉穿刺;组织学检查没有酒精性肝炎;没有血液参数慢性饮酒的静脉穿刺的时候或者在门诊部门之前的考试两年多)。甘油醛3磷酸脱氢酶GPDH。(B)半定量逆转录-聚合酶链反应(RT - pcr)的mRNA(比地震/ GPDH)透露,更多RT mRNA表达孩子的阶段B / C比阶段A值(范围),一个孩子的阶段,0.02 (0.01 - -0.15);孩子的阶段B, 0.21 (0.09 - -0.38);和孩子的阶段C, 0.39 (0.32 - -1.69)。箱形图显示值和95%可信区间(CI)。 Individual data points are mean serum levels above or below the 95% CI. *p<0.05.

      斯皮尔曼等级相关分析的结果表明之间的显著相关性mRNA的表达地震-如果血液中单核细胞的患者交流(n = 14)和sCD14 (r= 0.72;p < 0.01)(图6一)和血浆LPS (r= 0.76;p < 0.01)(图6B)。

      (A) Spearman rank analysis demonstrated a significant correlation between mRNA expression of interleukin 18 (IL-18) in unstimulated peripheral blood mononuclear cells of patients with alcohol induced cirrhosis and sCD14 (r= 0.72; p < 0.01). (B) Spearman rank analysis demonstrated a significant correlation between mRNA expression of IL-18 and lipopolysaccharide (LPS) (r=0.76; p<0.01). GPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
      图6

      (A)斯皮尔曼秩分析表明之间的显著相关性mRNA的表达白介素18(地震)如果患者外周血单核细胞酒精诱导肝硬化和sCD14 (r = 0.72;p < 0.01)。(B)斯皮尔曼秩mRNA的表达相关性分析表明显著地震和脂多糖(LPS) (r = 0.76;p < 0.01)。甘油醛3磷酸脱氢酶GPDH。

      讨论

      我们的结果表明增强基因表达地震的新孤立如果严重患者PBMC AC(儿童阶段C) PBMC与健康对照组相比(组成型表达地震-特定的信使rna)。

      最近在体外数据显示,内毒素(LPS)刺激的地震PBMC的mRNA表达。16,20.,31日,32我们体内的数据证明内毒素(LPS)等离子体之间的显著相关性(和CD14血清)水平和地震mRNA的表达如果PBMC。这些强烈的正相关性表明presensitisation循环的AC患者PBMC的内毒素。“如果”一词可能会因此被误导患者交流。

      最近在体外数据显示1μg /毫升的纯有限合伙人(没有CD14)刺激的地震在老鼠macrophage-like细胞信使rna表达。17体外刺激血液单核细胞CD14依赖有限合伙人被证明发生在LPS浓度更低(1 ng / ml有限合伙人)。33这些也可能出现在门户静脉血内毒素浓度(内毒素浓度的100 pg / ml 1 ng / ml1),使敏感PBMC体内。还需要进一步的调查来定义PBMC的敏化作用的确切机制和本地化体内血液(例如,门户v低浓度内毒素AC患者的外周血中遇到儿童阶段C (5.0 (1.8) pg / ml;范围0 - 63))和可能的额外增强或抑制因素。34

      初步数据基于mRNA表达的地震-如果患者PBMC六丙型肝炎病毒诱导肝硬化(n = 6;儿童阶段= 3;C = 3)表明,内毒素依赖PBMC的敏化作用可能更特定于肝硬化本身和降低肝间隙比疾病的病因学(未公开的数据)。

      乙醇TNF-α等影响促炎细胞因子的生产。35,36为了避免直接乙醇的影响,我们排除了禁欲一段时间不到6个月的患者和组织学或生物标记的酒精性肝炎(因此超过可比研究与禁欲时间1 - 2个月)。37

      先前的研究多次报道之间的密切关系循环血浆促炎细胞因子水平升高(例如,TNF-α)和AC的严重程度。7,38我们有了第一次亲密关系升高血浆水平的地震和儿童阶段的疾病。即使地震侦测的血清水平可能应该反映受损肝脏清除率为其他细胞因子(正如前面所讨论的那样6,39)增加血清细胞因子水平周围静脉血中遇到被认为是至少部分来自PBMC。然而,ELISA初步数据基于22丙型肝炎病毒引起的肝硬化患者(儿童阶段,n = 11;儿童阶段B、n = 4;儿童阶段C, n = 7)使我们得出的结论是,在严重的地震血清水平升高交流本身更特定于肝硬化疾病的病因学。

      浓度的有限合伙人以AC患者比得上细胞自由血浆内毒素水平的文献报道。7,9,29日,30.,40而弱等离子有限合伙人之间的相关性和血清蛋白质含量的地震并不令人惊讶的原因至少有两个:首先,门体静脉的分流是已知的导致重复峰值高endotoxinaemia endotoxinaemia而不是一个常数。其次,地震-蛋白的生产主要是监管结构上(不是诱导)。

      总之,增强表达的地震-如果PBMC支持假设地震-参与炎症反应的患者PBMC AC。最近的体外数据一起在人类PBMC从健康个体,它可能表明肠道派生细菌内毒素是地震的参与增强基因表达。16,31日虽然半定量rt - pcr被认为是适合分析细胞因子mRNA,13,41-44数据应该定量PCR证实了。

      确认

      我们感谢任何人Gundt专家执行ELISA技术援助。这项工作是支持格兰特(CH)临床医学教师的,海德堡大学,德国曼海姆。

      略语

      PBMC
      外周血单核细胞
      交流
      酒精诱发肝硬化
      TNF-α
      肿瘤坏死因子
      地震-
      白介素18
      有限合伙人
      脂多糖
      美国公共电视台
      磷酸缓冲盐
      rt - pcr
      逆转录-聚合酶链反应
      G3PDH
      甘油醛3磷酸脱氢酶

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