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背景肠上皮化生是一个风险因素的发展发现胃肠型腺癌和大约20%的胃活组织检查。只常规组织学检测肠上皮化生的高级阶段。
的目标是研究特定于肠上皮细胞粘附分子的表达liver-intestinal(李)钙粘着蛋白在胃癌、肠上皮化生及并评估其作为诊断标记分子。
病人胃活检(n = 77)从30个病人(n = 30;28 - 90岁)以及手术切除组织样本(n = 24)的所有类型的胃癌癌进行分析。
方法单引号和双标签免疫荧光检测cryosections胃活组织检查;碱性磷酸酶antialkaline磷酸酶方法石蜡包埋癌组织部分。
结果77活检(30例),12(从10位病人)LI-cadherin呈阳性。LI-cadherin染色与肠上皮化生的存在。然而常规组织学诊断未能发现细微的胃肠上皮化生(三个10位病人)。相比之下,只有LI-cadherin和villin是积极的在这些情况下而sucrase-isomaltase也未能发现四10个病人肠上皮化生。高度分化的胃癌显示强烈的染色LI-cadherin而未分化癌显示只有弱散射细胞质染色。
结论检测早期化生的胃粘膜的变化,LI-cadherin有敏感性优于sucrase-isomaltase villin和常规组织学和可比性。其特异性villin超过。因此LI-cadherin代表了一个新的、可靠和强大的标记分子的早期检测胃肠上皮化生和高度分化的腺癌。
- 胃
- 肠上皮化生
- 钙粘蛋白
- 致癌作用
略语
- BSA
- 牛血清白蛋白
- 免疫球蛋白
- 免疫球蛋白G
- LI-cadherin
- liver-intestinal钙粘蛋白
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐
- TBS
- 三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐
来自Altmetric.com的统计
胃肠癌跻身全球最常见的恶性疾病。在胃肠癌的发病率保持不变在中国,日本,东欧,南美,其发病率有所下降在西欧和美国,可能由于营养和环境因素的影响。1大多数胃癌癌(97%)属于一个四子组的腺癌(粘液性乳头状,管状,和图章戒指程控)。其余3%的胃adenosquamous癌,鳞状或未分化未分化癌。像大多数胃癌癌(80%)诊断处于高级阶段导致的五年生存率仅为17%,1重要的是识别早期指标和粘膜病变与癌的发展有关。
化生的上皮细胞在胃里被认为是一个风险因素发展的胃肠胃型的腺癌。从肠上皮化生Morson描述可能转变胃癌早在1955年。2,3自那时以来,许多研究已经证明,化生的上皮细胞和胃癌都表现出相似的表达模式一般用于各种蛋白质和黏蛋白不表达的腹部。4 - 7相信正常胃上皮细胞发展先后通过慢性萎缩性胃炎腺癌,肠上皮化生,发育不良。8
肠上皮化生胃代表一个变更的胃粘膜的上皮细胞形态和肠的生物学特性。9肠上皮化生中发现大约20%的胃活检检查10和更频繁的在老年患者。11
虽然各种细胞骨架蛋白的表达模式,酶在肠上皮化生和黏蛋白都被记录在案,钙粘蛋白的作用重要类的细胞粘附分子化生的过渡过程中迄今为止还没有被研究过。钙粘着蛋白起着关键作用的细胞结构和功能组织在多细胞生物组织和器官。他们代表一个大家庭的跨膜糖蛋白负责Ca2 +依赖细胞间粘附和互动。动物形态发生钙粘蛋白是必不可少的,12 - 14细胞间连接的形成,15细胞极性和信号转导。12,16
钙最著名的经典钙粘蛋白的成员,代表最集中研究了钙粘着蛋白对癌症。减少功能钙粘蛋白表达被认为是一个关键事件的功能障碍和信息粘附系统,触发入侵细胞行为和转移的形成。因此,正常的钙粘蛋白表达被认为作为“肿瘤抑制入侵系统”。17日至19日关于分析肿瘤诱导机制,钙粘着蛋白在医学研究的前沿。因此癌症相关的形态学变化的相关性与调制钙粘蛋白的表达模式是非常重要的。所描述的许多其他上皮肿瘤,减少细胞粘附分子钙粘蛋白也被与胃的腺癌有关。至24除了良好的文档记录肿瘤体细胞钙粘着蛋白功能的改变有关,吉尔福德和同事25最近报道钙粘蛋白遗传突变引起家族性胃癌。
LI-cadherin发现作为一个结构不同的钙粘着蛋白在两极分化上皮细胞特异表达的老鼠的肝脏和小肠。26与经典钙粘着蛋白相比,LI-cadherin由七个而不是5细胞外钙粘蛋白重复。此外,高度保守的经典钙粘蛋白的胞质区域含有150 - 160个氨基酸替换在LI-cadherin更短的域名只有21个氨基酸组成。这个领域并不与连环蛋白和肌动蛋白细胞骨架不是LI-cadherin的粘附功能的必要条件。然而,LI-cadherin介导同型的Ca2 +相关信息在L细胞粘附时表示。27人类LI-cadherin只发现在肠道上皮细胞而不是在肝脏(Zitt等,提交)。胃也对LI-cadherin不利。在人类肠道粘膜,LI-cadherin集中在质膜的横向域居住相邻肠上皮细胞但免于而钙粘蛋白粘合连接处并且集中在这些结构。
自肠villin等特定的标记,sucrase-isomaltase,氨肽酶N被表达在肠化生细胞和胃腺癌28正常胃粘膜而失踪,我们研究肠特定的细胞粘附分子的表达LI-cadherin胃上皮发生肿瘤的转换。
材料和方法
胃活组织检查和组织病理学
获取知情同意后,新鲜的胃活检是从随机选择在常规胃镜检查患者上消化道症状。几个英国部门参与了这项研究。活检标本一般从腔获得,语料库,眼底。样本的数量从每个病人不同从两到六。所有内窥镜切除活检都是从胃粘膜出现宏观上正常。组织病理学,样本在福尔马林固定,石蜡包埋。免疫荧光显微镜,相应的样本首先固定在9%蔗糖在4°C一个小时,然后在15%蔗糖在4°C了四个小时,终于提前冻在异戊烷在液态氮冷却到−196°C。几个部分准备冰冻活检石蜡包埋和冲击。组织病理学评价,部分与haematoxylin-eosin染色。被诊断为肠上皮化生基于存在的孔穴的上皮内杯状细胞和偶尔的肠上皮细胞。29日
抗体
LI-cadherin检测使用一个多克隆抗血清在兔子长大与过表达和纯化细胞外人类LI-cadherin (Zitt的碎片等,提交)。多克隆抗体β-catenin是购自σ(Deisenhofen,德国)。钙粘蛋白单克隆抗体是从转导实验室(德国汉堡)和单克隆antivillin ID2C3获得Coulter-Immunodiagnostics (Krefeld,德国)。sucrase-isomaltase单克隆抗体是一种来自惠普豪瑞博士的礼物(瑞士巴塞尔生物)。适当的抗体稀释测定系列稀释的积极的和消极的控制。最终稀释疣状如下:anti-LI-cadherin 1:50 0;anti-β-catenin 1:1000;anti-E-cadherin 1:400;antivillin 1:50;和antisucrase-isomaltase 1:1000。 As secondary antibodies, affinity purified Texas Red conjugated goat antirabbit IgG (Dianova, Hamburg, Germany) and Cy2 conjugated goat antimouse IgG (Dako, Hamburg, Germany) were used at a 1:200 dilution.
免疫印迹分析,anti-LI-cadherin抗血清稀释1:200和辣根过氧化物酶共轭猪antirabbit抗体(Dako,汉堡,德国)被用作二次抗体1:20 00稀释。
凝胶电泳
冲击冷冻活检是单一化的蛋白酶抑制剂和分离标准8%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶。
免疫印迹
蛋白质在凝胶分离被electrophoretically到Hybond C硝化纤维素膜(Amersham-Pharmacia,弗莱堡,德国)。与三羟甲基氨基甲烷缓冲液膜是孵化30分钟盐水(TBS)包含5%的脱脂牛奶和0.1%的渐变20。膜与渐变20 0.1%洗四次TBS每隔10分钟左右,孵化一小时与主抗体(稀释在TBS包含5%的脱脂牛奶和0.1%的渐变20)。膜又洗了如上所述,在相同的条件下二次抗体孵育。最后洗步骤之后,结合抗体检测到化学发光(ECL-kit;Amersham-Pharmacia)。
免疫荧光显微镜
间接免疫荧光法,胃活检是嵌入在最佳切削温度,(4μm)和冷冻部分被剪掉了低温恒温器,安装在poly-D-lysine-coated幻灯片。两个部分的每个标本沾haematoxylin-eosin并行组织学评价。部分是后缀在不同试剂(60%乙醇、30%氯仿,10%乙酸)20分钟和96%乙醇洗10分钟。为了避免非特异性结合的抗体,部分使用磷酸缓冲盐2%的脱脂牛奶(PBS) 20分钟。与PBS广泛的洗涤后,幻灯片是孵化主要抗体(PBS稀释含0.1%牛血清白蛋白(BSA)在4°C调湿室过夜。部分冲洗在PBS和孵化二级抗体(PBS稀释)在室温下45分钟。在PBS的部分第一次洗,然后在蒸馏水五分钟,和96%的乙醇在安装之前Elvanol脱水。双标免疫荧光显微镜,初级和二级抗体同时应用。消极的控制,主要抗体是PBS代替了。应用样本进行分析使用蔡司Axiophot荧光显微镜和蔡司LSM 410共焦激光扫描显微镜。 For detection of positively stained cells, the whole section was carefully screened at least five times.
免疫组织化学
腺癌石蜡包埋标本的胃(n = 25)进行分析。25例,一被分级为G1, G2六,和大多数G3 (n = 18),按照1990年世界卫生组织分类。组织病理学子分类包括papillotubular增长模式,管状癌,印戒细胞变异。部分(5μm)被安装在幻灯片和干至少12小时40°C。部分deparaffinised二甲苯和随后被淹没两次五分钟在100%和50%乙醇在TBS的两倍。最后,幻灯片是孵化30分钟在10毫米柠檬酸钠100°C, pH值6.0。使用过氧化物酶染色法进行原子能委员会/兔子/鼠标Dako ChemMate检测设备(Dako,汉堡,德国)。这涉及到一个温和的10分钟的蛋白酶K消化之后,与主要的多克隆抗体anti-LI-cadherin 30分钟的孵化项目,二级链霉亲和素结合antirabbit免疫球蛋白抗体,过氧化物酶阻断方案,和生物素化的过氧化物酶。与提供的显色底物和苏木精染色了。
结果
LI-CADHERIN表达在人类胃活组织检查
胃肠道的健康个体,LI-cadherin表达在小型和大型肠但完全缺席食管和胃(无花果1)。表达式的其他肠道蛋白质(例如,villin和sucrase-isomaltase)是诱导的胃粘膜病理条件下,如化生和恶性转化,我们推测LI-cadherin也可能表示在这种情况下。为了验证这个假设,我们分析了77个胃活检从30个病人,年龄在28 - 90年。至少两个独立样本histopathologist每个病人进行评估。常规组织学分析导致诊断肠上皮化生的30个病人(表71)。
免疫印迹分析在上消化道LI-cadherin表达式。蛋白质提取活检(食管、胃、十二指肠、回肠、空肠)和人类结肠癌细胞系Caco-2隔开钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳免疫印迹和对人类LI-cadherin多克隆抗血清。
所有胃活检随后分析表达式LI-cadherin的免疫荧光显微镜。77活检(30例),12(从10位病人)LI-cadherin呈阳性。其中包括所有样本病人诊断组织病理学影响肠上皮化生和活检从三个更多的病人最初认为负面的。
染色的LI-cadherin总是局限于单一腺或腺体和从未发现组在整个黏膜(无花果2)。评价LI-cadherin表达促进了低背景的负面区域和阳性细胞的强烈信号。而在大多数病人只有少数胃腺体LI-cadherin呈阳性,有些病人显示更频繁的染色和一个病人有超过70%的腺体LI-cadherin表达。对亚细胞分布、LI-cadherin局部优先于质膜的横向域。顶端质膜和细胞质呈阴性。
免疫荧光显微镜的胃活检沾多克隆抗体对LI-cadherin: (a)的荧光信号LI-cadherin, (B)相衬。注意不同的杯状细胞在一个腺LI-cadherin染色而周围的腺体是负面的。
的COLOCALISATION LI-CADHERIN SUCRASE-ISOMALTASE和VILLIN胃活检
免疫反应性LI-cadherin与钙粘蛋白和β-catenin相比。而钙粘蛋白和β-catenin(未显示)观察预期所有上皮细胞(无花果3B), LI-cadherin只检测到的分组人口胃腺体(无花果3A)。对于colocalisation LI-cadherin与钙粘蛋白(无花果3C、黄色)和β-catenin(未显示),几乎完全重叠在等离子体基底外侧膜被观察到。Non-epithelial细胞(例如,血管内皮细胞、神经纤维和结缔组织)显示没有免疫反应性,表明高特异性的抗体申请上皮细胞。
双重免疫荧光共焦激光显微镜记录的胃活检沾多克隆抗血清对LI-cadherin (a)和单克隆抗体对钙粘蛋白(B)。(C)结合图像的蛋白质。同一地区的相衬形象(D)显示区域的正常粘膜(1)旁边那些显示肠上皮化生的特点(2)。注意colocalisation高度的细胞表达LI-cadherin和钙粘蛋白。
Sucrase-isomaltase和villin代表建立特定标记为正常肠道而不是正常胃上皮细胞。因此,免疫反应性LI-cadherin与疣状sucrase-isomaltase和villin在小肠粘膜的(积极的控制,未显示)和胃粘膜(无花果4,5)。活检的患者没有肠上皮化生,LI-cadherin以及villin sucrase-isomaltase没有检测到(没有显示)。然而,在胃的情况下肠上皮化生诊断的常规组织学,免疫反应性对所有三个肠上皮标记分子(LI-cadherin, sucrase-isomaltase和villin)观察(表1;无花果4,5)。
双重免疫荧光记录通过激光共焦显微镜胃活检的多克隆抗血清对LI-cadherin (a)和单克隆抗体sucrase-isomaltase (B)。(C)的蛋白质结合图像。(D)相衬同一地区的形象。而LI-cadherin表达式是局限于基底外侧质膜区域,专门找到sucrase-isomaltase顶端区域,不与LI-cadherin colocalise。
免疫荧光共焦激光显微镜记录的胃活检与多克隆抗血清对LI-cadherin (a)和单克隆抗体villin (B)。(C)的蛋白质结合图像。(D)相衬同一地区的形象。而LI-cadherin non-metaplastic地区背景很低(1),villin染色结果通常在高背景染色(1 B)。结缔组织在腺体之间是完全负面的蛋白质(中心)。
有趣的是,传统的组织学诊断未能发现胃10三个患者的肠上皮化生。相比之下,只有LI-cadherin和villin是积极的在所有的情况下,而sucrase-isomaltase甚至未能发现肠上皮化生的四个病人(表101)。在亚细胞层面,LI-cadherin没有colocalise sucrase-isomaltase。而sucrase-isomaltase仅限于顶端质膜领域,LI-cadherin只检测到在基底外侧表面(图4C)。Villin在顶端膜检测也显示了一些与LI-cadherin重叠但不是基底膜外侧区域(图5)。
LI-CADHERIN表达在人类胃癌
评估LI-cadherin在胃肠癌的表达,通过免疫组织化学方法分析了部分25胃癌标本(无花果6)。只有一个胃的癌表现出激烈的LI-cadherin免疫染色。然而,染色强度在同一肿瘤的不同区域之间的差异很大。然而,LI-cadherin疣状促进肿瘤细胞和间充质组织之间的歧视和炎症浸润。
免疫反应性的LI-cadherin胃癌。免疫组织化学染色的LI-cadherin粘液(A),管状(B),图章戒指(C)腺癌和未分化癌的胃(D)。注意信息接触区域的强烈的染色在分化良好区域(1)分化腺癌由弱对比染色的区域(2),未分化癌(D)展品LI-cadherin只有微弱的胞质染色。
在胃粘液癌,强烈的染色LI-cadherin一直被发现之间的横向联系区域分化肿瘤细胞(图结合起来6),顶端的细胞保持清白的。类似的本地化LI-cadherin在管状腺癌(图显示6B)。而在命令区域对齐的肿瘤细胞表现出充分的表达LI-cadherin沿着细胞接触区域(1),单一和不连贯的肿瘤细胞表达LI-cadherin出现在一个较小的程度上(2)。在比较不同部分显然LI-cadherin染色是最强烈的胃癌分化良好的肠道类型。在图章细胞癌,LI-cadherin也主要在质膜发现,但染色有点弱于肠道腺癌的类型(无花果6C)。同样的适用于广泛渗透和未分化癌胃。特别是弱和分散染色,有时出现在这些肿瘤部分,显示在无花果6d .减少或缺失LI-cadherin染色也观察到肿瘤坏死区域。
讨论
这项研究首次表明,LI-cadherin,一个肠特定细胞粘附分子,是化生的ectopically表达了胃的粘膜和胃肠型腺癌。
所有患者的活检诊断histopathologist积极的作为LI-cadherin肠上皮化生还显示强烈的免疫反应性。此外,从病人错过了常规组织学活检仍LI-cadherin免疫荧光鉴定为肠上皮化生。这些样本也呈阳性建立肠道villin标志。28这一发现最好的解释是更高的免疫荧光检测灵敏度与传统光学显微镜。
LI-cadherin和villin总抗体染色相同的胃腺体和相同的细胞内,这两个蛋白似乎是最敏感的检测metaplasia-that的早期阶段,当只有少数腺活检或几个细胞的影响。相比之下,常规组织病理学检查的标准haematoxylin-eosin部分似乎微妙形式的肠上皮化生,小姐一样使用sucrase-isomaltase抗体免疫荧光检测,至少在某些情况下。
LI-cadherin证明是优于villin有两个原因。首先,它比villin显示更强的特异性免疫反应。这是最好的解释事实LI-cadherin驻留在较大的基底膜隔间比水更容易接近进行免疫组织化学分析位于抗原表位。其次,villin似乎表达了在低水平在正常胃上皮细胞30 -导致背景染色。相比之下,LI-cadherin并不表示在正常胃上皮细胞导致更高的信噪比LI-cadherin与villin相比。
大多数的活检阳性LI-cadherin显示只有一个焦点在某些腺体染色模式。这个发现解释为是,肠上皮化生的外观是一个过程,开始独立疫源地内粘膜在后期合并。11化生的腺体内,LI-cadherin集中在相邻细胞之间的横向联系地区一直在观察其表达在肠道粘膜。26事实上,化生的上皮衬里的腺体非常类似于正常肠道隐窝的细长细胞形状和杯状细胞的存在。22钙粘蛋白被表达在大多数上皮细胞和诱导的形成,从而粘合连接处并且细胞分化,几乎完全colocalises LI-cadherin化生的腺体。观察到缺乏表达的差异和化生的上皮和β-catenin之间正常的胃黏膜符合Shino和同事的结果23和Jawhari和他的同事们33报道称,钙粘蛋白的表达模式,β-catenin, plakoglobin,胃炎和α-catenin没有改变,肠上皮化生或胃萎缩。
对villin抗体,95 kDa的蛋白质存在于微绒毛核心,被用作刷状缘的标志。34与摩尔和他的同事们在协议30.我们发现只有一个弱鲁米那villin信号正常窦的粘膜和更少的语料库和眼底。使用villin抗体,摩尔和他的同事们30.和奥斯本和他的同事们28相关的报道明显顶端微绒毛染色在肠上皮化生和胃腺癌。强大的胃粘膜中表达villin因此被认为是化生的标记或肿瘤胃上皮细胞的变化。在目前的研究中,正是这些上皮LI-cadherin焦点是积极的,也显示增加了villin染色。
Sucrase-isomaltase-a hydrolyase有限的刷状缘膜吸收肠道细胞35,36曾作为第二个标记蛋白肠道分化上皮和显示与LI-cadherin积极的双标免疫荧光染色。子群的活检阳性LI-cadherin, sucrase-isomaltase不能检测到。这一发现表明潜在的后期甚至缺失的感应sucrase-isomaltase表达式与LI-cadherin和villin在某些化生细胞。
是有趣的推测,LI-cadherin villin,两种典型的肠道蛋白质,似乎表达了化生的早期阶段的过渡,是伴随着细微变化在细胞形态向肠道细胞类型。钙粘素是已知morphoregulatory蛋白质,14可想而知,LI-cadherin甚至可能积极参与这些细胞转变。感应LI-cadherin表达在肠上皮化生是P-cadherin平行的观察,显示几乎没有在正常胃粘膜免疫反应性,成为在高度分化的诱导胃腺癌。20.,37作者推测,诱导表达P-cadherin可能参与高度分化的腺癌的形态发生。37
化生细胞相似,胃的LI-cadherin癌也表现出强烈的表达和信息联系的地区。如果LI-cadherin表达式实际上应该与肿瘤细胞的形态发生作为P-cadherin提出,其诱导细胞重编程的第一步应该是化生是视为一个病变有可能慢慢多年发展成胃癌。
LI-cadherin表情似乎在低分化腺癌和在未分化胃癌仍然较弱。这个观察符合P -钙粘蛋白的表达降低低分化癌具有侵袭性生长。21,37此外,Jawhari和同事33观察到胃上皮的进步上皮化生发育不良和最后胃癌与部分或全部损失的E-cadherin-catenin复杂。
总之,LI-cadherin代表了一个新的分子标记对胃化生的和胃肿瘤。LI-cadherin染色产生较低的背景和歧视性的权力高于villin,肠上皮化生的良好标志。最后,LI-cadherin显示灵敏度高于sucrase-isomaltase并可能因此成为一个重要的额外标记胃化生和肿瘤。
略语
- BSA
- 牛血清白蛋白
- 免疫球蛋白
- 免疫球蛋白G
- LI-cadherin
- liver-intestinal钙粘蛋白
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐
- TBS
- 三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐
引用
脚注
↵__两位作者的贡献同样这项工作。
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