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胃肠道癌症
细胞氧化还原平衡的影响在HT29细胞凋亡的诱导二十碳五烯酸结直肠腺癌细胞和老鼠体内结肠
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  1. P莱瑟姆,
  2. E K隆德,
  3. J C布朗,
  4. 我T约翰逊
  1. 食品研究所,诺维奇研究公园,科尔尼,英国诺里奇NR4 7 ua
  1. E K隆德。liz.lund在{}bbsrc.ac.uk

文摘

背景和目的流行病学证据表明n - 3多不饱和脂质可能预防结直肠肿瘤。人类食用鱼油调节地穴cytokinetics,和隐窝细胞凋亡在动物模型。探索这些影响,我们研究了半胱天冬酶的参与酶和细胞氧化还原平衡的二十碳五烯酸(EPA)诱导细胞凋亡HT29细胞,而在老鼠体内结肠。

方法生存HT29细胞生长与环保局的半胱天冬酶抑制剂,抗氧化剂,或buthionine sulphoximine,谷胱甘肽neosynthesis的抑制剂,决心。EPA浓缩鱼油和谷胱甘肽耗竭的影响在大鼠结肠癌细胞凋亡是评估使用microdissected隐窝。

结果HT29细胞治疗与EPA减少活细胞数量和激活半胱天冬酶3,之前细胞分离。抗氧化剂和半胱天冬酶抑制剂阻止HT29细胞死亡而增加谷胱甘肽耗竭。老鼠喂食鱼油有更高比美联储玉米油,隐窝细胞凋亡和谷胱甘肽耗竭增强这种效果。

结论EPA进入结肠上皮细胞脂质增加细胞凋亡。这项研究的结果,用一个动物和细胞系模型,支持这种效应是通过细胞氧化还原介导的假设语气,和对谷胱甘肽代谢很敏感。数据显示机制多不饱和脂肪酸可能影响大肠癌易感性的隐窝细胞诱导或肿瘤的发展。

  • 二十碳五烯酸
  • 细胞凋亡
  • 谷胱甘肽
  • 半胱天冬酶
  • 氧化还原
  • 结肠直肠癌
  • 老鼠

  • 略语

    非甾体抗炎药
    非甾体抗炎药物
    PUFA
    多不饱和脂肪酸
    环境保护署
    二十碳五烯酸
    DMH
    1、2、二甲基肼盐酸盐
    DMEM
    杜尔贝科修改鹰的媒介
    饥饿
    脂肪酸甲基酯
    美国公共电视台
    磷酸缓冲盐
    谷胱甘肽
    减少谷胱甘肽
    GSSG
    氧化谷胱甘肽
    GSX
    细胞内谷胱甘肽
    BSO
    buthionine sulphoximine
    BAF
    Boc-Asp -FMK(当地)
    机构
    p-nitroanilide
    南汽
    N乙酰半胱氨酸
    有限公司
    玉米油
    佛
    鱼油

    • http://dx.doi.org/10.1136/gut.49.1.97

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      结肠粘膜快速增生组织中,细胞生产平衡从黏膜表面剥落,并由更小的组件通过隐窝内细胞凋亡的细胞损失。尽管后者相对罕见,但它可能扮演重要的角色在肿瘤的预防,因为它提供了一个途径消除干细胞携带潜在procarcinogenic突变。这其中的意义机制预防结肠直肠癌的非甾体抗炎药(非甾体抗炎药)所示苏灵大在结直肠癌细胞体外凋亡,1导致异常的地穴疫源地的回归人类,2和减少息肉患者家族性腺瘤息肉病的增长。3饮食的组件产生类似的效果可能是价值的结直肠肿瘤的控制。共同点与苏灵大及其他非甾体抗炎药,某些多不饱和脂肪酸(PUFA)杀死肿瘤细胞在体外,4和抑制肿瘤的生长在动物模型。5,6海洋油富含PUFA也发挥潜在的有益影响地下室cytokinetics的结直肠粘膜腺瘤息肉患者。7我们之前和其他人表明鱼油增加细胞的数量进行细胞凋亡在大鼠结肠隐窝。8,9这种效应是增强老鼠致癌物质1,2,二甲基肼盐酸盐(DMH),和在这些条件下高水平的隐窝细胞凋亡与减少数量的异常的地穴疫源地。8海洋油的活性成分被认为是n - 3 PUFA二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸,但其对细胞分裂的影响的机制尚不清楚。

      在结肠上皮细胞凋亡的分子基础不是特征但在其他组织中,细胞凋亡引起的各种不同的刺激,包括丁酸盐,10拓扑异构酶抑制剂,11从基础和超然,12还存在需要激活。这种特定的半胱氨酸蛋白酶家族被认为执行细胞死亡的乳沟的目标基板,包括细胞骨架和相关的蛋白激酶和DNA酶有关。13HT29细胞我们在早前的研究表明,EPA整合之后,增加细胞粘附的损失。14分离的细胞外基质是结肠上皮细胞的特征线进行体外细胞凋亡15和体内。16在我们的体外模型,整合至关重要的染料中性红是用来量化可行的贴壁细胞的数量的细胞培养系统。细胞分离后暴露在EPA表现出特征的凋亡细胞死亡如凝聚染色质和DNA梯法,但没有这样的表型标记检测细胞附着。14在目前的研究中我们展示了第一次的作用还存在诱导细胞死亡的长链PUFA之前,表明该系统的激活开始分离的细胞基础。

      先前的研究表明,细胞脂质过氧化反应和自由基的产生可能是细胞凋亡的主要发起者的系统。16霍金斯和他的同事们17最近表明,PUFA诱导细胞凋亡在胰腺和进展期细胞系,细胞毒性的程度是成正比的数量组成脂肪酸双键。同样,口头管理已被证明欧米抑制人类乳房癌的增长在裸鼠模型中,在某种程度上,与脂质过氧化的生产产品。18活性氧也涉及凋亡对压力的反应19和细胞衰老20.在小肠。另一方面,最近Chinery和同事的工作21,22表明抗氧化剂治疗可以在结直肠癌细胞体外诱导细胞凋亡,并加强抑制肿瘤生长的细胞毒性药物在体内。在目前的研究中我们观察到相反的效果,半胱天冬酶介导的细胞死亡的起始结肠上皮细胞是体外抗氧化剂预防的。我们这些研究扩展到老鼠体内结肠,表明,在培养的肿瘤细胞,有放大后隐窝细胞凋亡的EPA食用鱼油为上皮细胞磷脂,这影响是增强减少细胞谷胱甘肽的水平。

      材料和方法

      细胞培养

      结肠细胞腺癌行HT29得到欧洲的细胞培养(英国索尔兹伯里)。HT29细胞生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;σ)补充5%热灭活胎牛血清(σ),2毫米谷氨酰胺,50单位/毫升青霉素,链霉素50μg /毫升(所有从帝国实验室,安多弗,英国)。细胞生长在37°C,在5% /卷卷有限公司2在湿润的气氛中,收获使用磷酸缓冲盐(PBS)含0.05% wt / wt /卷卷胰蛋白酶和0.02% EDTA(帝国理工实验室)。美国环境保护署(独联体、5、8、11、14、17)在密封的安瓶从σ购买包含25毫克。内容是溶解在乙醇给25毫克/毫升股票的解决方案,和卷曲密封在一个琥珀在氮气瓶。EPA-ethanol组合DMEM给最终的浓度进一步稀释15日30和45μM。环保署曾被我们所导致HT29细胞凋亡在这些浓度14比得上水平的大约65μM观察unsupplemented人类被试的等离子体,和大大低于浓度约400μM实现3 g的主题补充鱼油每天18周。23卷最终乙醇的浓度大约是0.06%,这一水平被发现在控制细胞表型的实验没有影响。

      细胞生存能力分析

      EPA和其他治疗的影响生存和增殖HT29细胞被测量的相对数字量化可行的贴壁细胞后用中性红文化整合分析应用于96孔板。24细胞被播种到Nunclon 96孔板(费舍尔、拉夫堡、英国)23密度×103每口井的细胞,允许24小时坚持,和对待媒体包含15日30日和45μM EPA 24或48小时,有或没有抗氧化剂或半胱天冬酶抑制剂,如下所述。至少16复制井被用于每个治疗。可行的贴壁细胞的相对数量确定在每个实验通过孵化了三个小时50μM中性红(3-amino-7-dimethylamine-2-methylphenozine盐酸盐;在DMEMσ)稀释。盘子被排干,固定在40%(卷/期)甲醛/ 10% (wt /卷)氯化钙六水合物(BDH,普尔,英国)30秒,洗了三次PBS和风干。中性红被添加水溶性固定细胞200μl乙醇(50%)/每口井的醋酸(1%),和吸光度测量550海里使用Dynatech MR5000自动化板读者(Dynatech实验室公司、维吉尼亚州亚历山大市,美国)。由于中性红在不同实验吸光度被发现的数量成线性正比附着HT29细胞/范围1×103-50×103每口井的细胞(r2= 0.98;数据未显示)。结果表示为一个百分比的吸光度值获得控制文化。

      细胞脂质成分

      总脂质提取从107HT29细胞或从孤立的粘膜隐窝(见下文)据布莱和戴尔的方法。25氯仿提取物干在N2在40°C (g)和存储在玻璃小瓶−20°C。极地磷脂提取部分使用Sep-Pak列(水公司,米尔福德,马萨诸塞州,美国)根据制造商的指示。包含收集极磷脂的甲醇洗,和干下N2在50°C (g)存储。转换提取总脂和磷脂脂肪酸甲基酯(饥饿)是由一个寒冷的甲基化过程。26整个细胞脂肪酸组成的变化与EPA和磷脂分数与治疗是通过气相色谱分析评估使用惠普6890气相色谱仪,配备火焰电离检测器和注射器。个人比较发现饥饿的保留时间与标准包括所有主要的脂肪酸从C12 C24 (Nu-Check预科Inc .,快乐的,明尼苏达州,美国)。

      还存在的激活和抑制

      半胱天冬酶存在蛋白酶活动(DEVD特定)评估在附着HT29细胞种植在80厘米2烧瓶与0、15、30、45μM EPA 24或48小时。DEVDase活动是细胞颗粒(2×10化验6细胞)使用一个比色工具包(英国贝辛斯托克Clontech)检测劈理的发色团p-nitroanilide(机构)从一个共识DEVD四肽序列。DEVDase抑制剂Z-DEVD-FMK (Calbiochem,诺丁汉,英国)被添加到一个治疗样本作为一个负控制确认解放DEVDase特定机构。积极控制细胞治疗25μM C2神经酰胺三个小时(Calbiochem)或紫外线30分钟(12000 J /厘米2);负控制细胞培养在环保署的缺失。EPA和DEVD-pNA也在一起孵化反应(1、12、24、48小时)单独确认环保局没有能力坚持机构从DEVD四肽。

      半胱天冬酶抑制研究细胞孵化30μM EPA在96孔板的细胞渗透性半胱天冬酶抑制剂24或48小时。半胱天冬酶抑制剂(Calbiochem)包括Z-DEVD-FMK(半胱天冬酶3),IETD-CHO(半胱天冬酶8),Z-VAD-FMK(广谱)和Boc-D(当地)-FMK (BAF;广谱)。细胞生存能力评估如上所述。

      抗氧化研究

      建立如果氧化过程参与环保署诱导减少细胞生存能力,HT29细胞培养48小时和EPA(30 0, 15日,或45μM)在96孔板的抗氧化剂N乙酰半胱氨酸(Nac 1毫米;Calbiochem)、ebselen(40μM;Calbiochem)或U74389G(5μM;Calbiochem)。媒体与EPA和抗氧化剂24小时后刷新和细胞生存能力是决定如上所述。

      细胞内谷胱甘肽的耗竭

      的影响减少谷胱甘肽(GSH)损耗与EPA HT29细胞治疗的反应了戴斯。莱纳姆:-buthionine sulphoximine (BSO),特定γ-glutamyl-cysteine合成酶抑制剂抑制谷胱甘肽neosynthesis。确定BSO对细胞谷胱甘肽水平的影响,HT29细胞种植在80厘米2水瓶(107细胞/瓶)30μM EPA + 100μM BSO 48小时,与PBS洗两次,收集到microfuge管10的球团矿7细胞。总谷胱甘肽(减少谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽(GSSG))化验是细胞内谷胱甘肽(GSX)单位根据酶的回收方法,贝克和他的同事们27这是用于自动生化分析仪的内部(Cobas苧藁增二;罗氏,韦林,英国)。可行性研究在96孔板的细胞培养24或48小时媒体包含EPA(0-45μM), EPA + 100μM BSO或EPA + BSO + ebselen(40μM) 24或48小时,和细胞生存能力化验如前所述。

      体内研究

      探讨谷胱甘肽代谢的作用由n - 3脂肪酸体内诱导细胞凋亡,72名男性Wistar鼠(125 - 150 g)分别被安置在聚丙烯容器用铁丝底部和顶部温度(21°C)和湿度控制动物单位每天12小时光暗周期。实验开始之前,老鼠被允许使用半合成粉饮食随意(克/公斤:280年淀粉;蔗糖380;酪蛋白200;玉米油80;平衡的矿物质和维生素混合60)。四个星期后老鼠被随机分配到四个治疗组18。两组继续接收基底的饮食含有玉米油(CO)和两个收到了类似的饮食玉米油是完全取代鱼油(FO: 96.7%甘油三酯C22:6 C20:5 18.7%和8.0%;Callanish Breasclete、英国)。一个公司和一个佛组蒸馏水随意实验的持续时间和其余组(CO-BSO; FO-BSO) received distilled water supplemented with BSO (Sigma) at a final concentration of 5 mM. Weight gain and food and water intake were measured every 24 or 48 hours. After 24 hours, 48 hours, and one week, six rats from each group were killed by intraperitoneal injection of pentabarbitone sodium (1.0 ml) followed by cervical dislocation under deep anaesthesia. The entire colon was removed via a midline abdominal incision and tissues were processed as described below.

      确定试验治疗粘膜的影响脂质,进一步进行平行实验使用20雄性Wistar鼠分配给四个五组,和美联储或佛,有或没有5毫米BSO饮用水,为七天。然后他们被杀,和完整的结肠隐窝是孤立的对HT29细胞脂质分析描述。

      分析隐窝细胞增殖和细胞凋亡

      孤立的结肠翻转在3毫米直径的金属杆和减少一半。全厚度组织样本(约5毫米)的远端固定在乙醇:醋酸(25)和储存在4°C 2 dram的玻璃小瓶。分析凋亡的数量和空间分布和有丝分裂隐窝细胞,组织样本在蒸馏水制成冻干,盐酸水解在1米7分钟60°C,并与Fuelgen试剂染色。组织在低功率microdissected显微镜屈服细条轻轻压扁的隐窝盖玻片,在光学显微镜下(×400)。每个墓穴的长度是由比较校准线性目镜格(尼康英国有限公司),凋亡和有丝分裂细胞通过形态学特征如前所述,8和他们的立场是记录和分配在五等距的纵向隔间。总共20隐窝进行分析对每个老鼠和数据表示为有丝分裂和凋亡细胞核总数/地下室或隐窝室。样品的起源是未知组织学家在分析。

      测量的上皮细胞谷胱甘肽的水平

      完整的结肠隐窝是隔离段刚切除结肠(约4.0厘米)。段轻轻搅拌30分钟在PBS (pH值7.4;0°C)包含EDTA(3毫米;BDH)和dithiothrietol(1.0毫米;σ),转移到新的缓冲区在聚乙烯管(25.0毫升),隐窝和手工动摇化解。裸露的肌肉组织被丢弃,地穴悬架是由离心(1000 rpm),颗粒状和颗粒(500μl)被冻结在液体N2。冻丸后来解冻和探针用15秒前分析。一子样品(50μl)是化验血清总蛋白(Micro-BCA蛋白质化验设备;σ)和第二个(200μl)总谷胱甘肽(减少和氧化:谷胱甘肽+ GSSG = GSX),对HT29细胞如上所述。

      统计分析

      各治疗组之间的差异的重要性在这个研究是评估通过单向方差分析加上Dunnet的测试比较的方法治疗与未经处理的文化或图基的测试比较个人的意思。在一些实验中,双向方差分析使用一般线性模型也被使用。概率的值小于5% (p < 0.05)被认为是重要的。所有分析都使用一款统计软件统计软件包(美国宾夕法尼亚州州立大学)。

      结果

      环保局对HT29细胞的生存能力和脂质成分

      接触细胞EPA(15、30、45μM)引起显著减少细胞生存能力与未经处理的细胞在24和48小时后初始接触(图1)。细胞生存能力呈负相关浓度增加EPA从15到45μM在两个时间点(p < 0.05)。双向方差分析揭示了一个重要的治疗之间的交互与EPA和曝光时间(24或48小时)。EPA的百分比(C20:5)的磷脂分数HT29细胞治疗15μM EPA 24小时从一个初始值上升0.91% (n = 2;范围0.02%)到18.2% (n = 2;范围1.76%)。没有进一步的治疗后48小时。

      Adherent cell viability of HT29 cells following treatment with increasing concentrations of eicosapetaenoic acid (EPA 15–45 μM) for 24 or 48 hours. Cell viability was assessed using the neutral red assay, and data are expressed as per cent of the optical density (OD)550nm of untreated control cultures (mean (SEM)). A minimum of 16 OD550nm readings were taken for each treatment. EPA significantly reduced cell viability after 24 and 48 hours at all concentrations tested (p<0.05) compared with untreated cells. Reduction in viable cell number was significantly associated with EPA treatment and time (p<0.001).
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
      图1

      粘附细胞的可行性HT29细胞治疗后eicosapetaenoic酸浓度增加(EPA 15-45μM) 24或48小时。使用中性红测定细胞生存能力评估,和数据表示为百分数的光密度(OD)550海里未经处理的控制文化(平均(SEM))。至少16 OD550海里阅读是每个治疗。EPA显著降低细胞生存能力在24和48小时浓度测试比未经处理的细胞(p < 0.05)。活细胞数明显减少与环保局相关治疗和时间(p < 0.001)。

      诱导半胱天冬酶的活动

      接触细胞EPA在15日30日和45μM诱导显著增加DEVDase活动表示为每10 nmol机构/ h6细胞与未经处理的文化接触(图24和48小时后2)。DEVDase活动也显著增加(p < 0.05),增加EPA的浓度范围0-45μM之间有一个重要的交互与EPA和治疗时间。DEVDase活动被发现特定的半胱天冬酶存在蛋白酶作为机构的解放在暴露于EPA 45μM (10.8 (1.2) DEVDase单位)被添加DEVD共识半胱天冬酶抑制剂的反应(3.0 (0.1)DEVDase单位;p < 0.05)。

      Activity of DEVDase caspases (chiefly caspase 3) in HT29 cells following treatment with increasing concentrations of eicosapetaenoic acid (EPA 15–45 μM) for 24 or 48 hours. Positive control cells were also treated with 25 μM C2 ceramide (three hours) or 12 000 J/cm2 (UV, 30 minutes). Data are expressed as mean (SEM) pNA liberated from a DEVDase consensus cleavage site per hour per 106 cells of four samples per treatment group. Caspase activity was significantly higher in all EPA treated cells than in untreated cells after 24 and 48 hours (p<0.05).
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
      图2

      活动还存在DEVDase HT29细胞(主要是半胱天冬酶3)治疗后eicosapetaenoic酸浓度增加(EPA 15-45μM) 24或48小时。积极控制细胞也接受25μM C2神经酰胺(3个小时)或12 000 J /厘米2(UV, 30分钟)。数据表示为意味着(SEM)机构摆脱DEVDase共识裂解位点每小时106每个治疗组细胞的四个样品。半胱天冬酶活性明显高于细胞比未经处理的细胞治疗的所有的EPA(美国环保署24和48小时后(p < 0.05)。

      半胱天冬酶抑制

      EPA的副作用HT29细胞生存能力被封锁或大大降低细胞渗透半胱天冬酶抑制剂。添加30μM EPA HT29文化显著降低细胞生存与未经处理的文化在48小时(p < 0.05)但当细胞接受环保局和广泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK或BAF,细胞生存能力明显高于治疗后与EPA(表1)。半胱天冬酶3抑制剂Z-DEVD-FMK 8和半胱天冬酶抑制剂IETD-CHO也显著增加细胞生存能力在48小时后30μM EPA的存在。没有明显影响的半胱天冬酶抑制剂在缺乏文化EPA控制细胞的可行性。

      把这个表:
      表1

      生存HT29细胞治疗后48小时二十碳五烯酸(EPA)和/或一系列半胱天冬酶的抑制剂之一

      抗氧化剂对细胞活力的影响在环保署的存在

      Ebselen仅对HT29细胞的生存能力没有显著影响,但被证明是高度有效地阻止减少细胞生存能力由环保局治疗引起的。事实上没有明显差异的可行性的细胞培养48小时没有环保局或与EPA(15-45μM)在ebselen(表的存在2)。同样,U74389G没有影响细胞生存能力缺乏EPA但在48小时内细胞数目在文化co-treated U74389G环保局在15和30μM没有显著不同于控制值(表2)。Nac仅造成一个近似的活细胞数减少10%相比,未经处理的细胞(p < 0.05),在屏蔽效果低于ebselen EPA减少细胞生存能力(表相关联2)。然而,在所有文化中活细胞数显著高于co-treated与南汽和EPA 48小时后比相应的EPA对待文化(p < 0.05)。

      把这个表:
      表2

      影响的三种抗氧化剂ebselen(40μM),防治(Nac 1毫米),和U74389G(5μM)对细胞生存能力细胞处理二十碳五烯酸(EPA 15-45μM)

      谷胱甘肽耗竭对细胞活力的影响在环保署的存在

      暴露在EPA单独造成的GSX水平减少20% HT29细胞48小时(p < 0.05),而治疗BSO GSX细胞含量减少了约90% (p < 0.05)。在第一个24小时的EPA + BSO曝光,细胞生存能力独自相似文化对待EPA(数据未显示),但有一个近似减少95%(图48小时后活细胞数3)。主要减少细胞生存能力发生在大约五个小时的窗口初始接触)(45 - 50小时后迅速广泛的细胞死亡发生在整个人口。添加抗氧化剂ebselen EPA + BSO处理细胞恢复细胞活力EPA测试浓度(p < 0.05)。然而,广泛Z-VAD-FMK半胱天冬酶抑制剂,抑制还存在1,3,4,7,无法阻止EPA诱导细胞死亡的BSO,表明这个总细胞毒性并不依赖于这些还存在,因此可能是坏死而非凋亡。

      Adherent HT29 cell viability following treatment with eicosapetaenoic acid (EPA) (15–45 μM), EPA+100 μM buthionine sulphoximine (BSO), or EPA+BSO+40 μM ebselen for 48 hours. Cell viability was assessed using the neutral red assay, and data are expressed as mean (SEM) per cent of the optical density (OD)550nm of untreated control cultures. A minimum of eight OD550nm readings were taken for each treatment. EPA significantly reduced cell viability after 48 hours at all concentrations tested (p<0.05) compared with untreated cells. BSO alone did not significantly affect cell viability. Exposure to EPA (15–30 μM)+BSO significantly reduced cell viability (p<0.05) but addition of ebselen to EPA+BSO cultures significantly increased cell viability (p<0.05).
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
      图3

      附着HT29细胞生存能力与eicosapetaenoic酸治疗后(EPA)(15-45μM), EPA + 100μM buthionine sulphoximine (BSO),或者EPA + BSO + 40μM ebselen 48小时。使用中性红测定细胞生存能力评估,和数据表示为每分意味着(SEM)的光密度(OD)550海里未经处理的控制文化。至少八个OD550海里阅读是每个治疗。EPA浓度显著降低48小时后细胞生存能力的测试与未经处理的细胞相比(p < 0.05)。BSO独自没有明显影响细胞的生存能力。暴露在环境保护署(15 - 30μM) + BSO显著降低细胞活力(p < 0.05),但增加ebselen EPA + BSO文化显著增加细胞活力(p < 0.05)。

      鱼油和BSO对隐窝细胞脂质和体内谷胱甘肽含量

      FO饮食的消费水平显著提高的有关C20:5隐窝细胞磷脂,和减少C18:2 C20:4 FO和FO-BSO动物(p < 0.05),而与美联储(表3)。磷脂的C20:3内容也减少FO喂养动物(p < 0.05)。没有显著影响BSO隐窝细胞内脂质饮食组。24小时后总谷胱甘肽水平隔离结肠隐窝从动物美联储有限公司(0.20(0.04)谷胱甘肽/毫克蛋白)和FO (0.18 mg谷胱甘肽(0.02)/毫克蛋白)没有显著不同,但都明显不同(p < 0.05)从动物BSO处理(CO-BSO 0.08 (0.01);FO-BSO 0.07(0.02)毫克谷胱甘肽/毫克蛋白)。在48小时内,一个星期没有进一步的治疗对隐窝的谷胱甘肽水平的影响。

      把这个表:
      表3

      慢性影响细胞内谷胱甘肽(GSX)枯竭和膳食脂质(玉米油(CO)和鱼油(FO))的磷脂成分隔离一周后结肠隐窝

      影响脂质和BSO隐窝细胞有丝分裂和细胞凋亡

      每个墓穴的有丝分裂细胞总数下降了大约30%的远端结肠动物喂FO饮食与美联储有限公司24小时后,48小时内,一个星期(p < 0.001)(图4)。理智的看待这个问题,应该注意的是,在有丝分裂频率的大小相当于一个差异有丝分裂率大约三隐窝细胞分裂/每小时。28假设一个地下室的密度大约300隐窝/毫米2,这将导致赤字FO喂养的大鼠在隐窝细胞生产约900细胞分裂/毫米2每小时的黏膜表面。

      Mitotic cells per crypt expressed as mean (SEM) in crypts isolated from the distal colon of rats given corn oil (CO) or fish oil (FO) in the diet with or without 5 mM buthionine sulphoximine (BSO) in drinking water. There was a significant reduction in mitotic cells/crypt associated with FO consumption at all time points (p<0.001) but no significant effect of BSO in the drinking water.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
      图4

      每个墓穴有丝分裂细胞表达为意味着在隐窝(SEM)分离大鼠远端结肠的玉米油(CO)或鱼油(FO)饮食有或没有5毫米buthionine sulphoximine (BSO)饮用水。在有丝分裂细胞/地下室有显著减少在各个时间点上均与佛有关消费(p < 0.001),但没有明显效果的BSO饮用水。

      没有明显的附加影响BSO治疗水平的有丝分裂有限公司或FO喂老鼠。在所有治疗组,隐窝细胞有丝分裂中的最大基底区,拒绝在区域2和3,完全没有在浅区4和5(数据没有显示)。之间没有显著差异在地下室长度有限公司和FO美联储组织在24小时。然而,七天之后意味着地穴长度在FO美联储老鼠(243μM)明显低于公司喂老鼠(262μM;p < 0.05),两BSO处理组明显短隐窝比各自控制在这个时候(约3%;p < 0.05)。地窖当数据为有丝分裂细胞/正常使用crypt长度作为一个索引的细胞数量,重新和有丝分裂细胞每单位长度的洞口,组间差异的分布基本上保持不变,单向方差分析证实,水平显著降低的有丝分裂FO和FO-BSO比在公司或CO-BSO老鼠,老鼠分别(p < 0.05)。

      凋亡细胞核罕见(< 0.05每地穴凋亡细胞)的远端结肠组织动物喂饮食有限公司(图5)。治疗公司喂老鼠水平BSO显著增加的隐窝细胞凋亡与美联储只有有限公司(p < 0.05),但有一个更大的增加与消费的FO饮食(p < 0.001)。在每个时间点,更高水平的细胞凋亡被发现结肠隐窝的FO喂动物比在公司或CO-BSO动物(p < 0.05)。治疗5毫米BSO FO喂养动物的饮用水(FO-BSO)进一步提高水平的隐窝细胞凋亡与佛组(p < 0.05),有一个趋势BSO之间的交互和FO饮食,和细胞凋亡水平(p < 0.08)。整个地下室凋亡细胞核被发现。当数据是正常使用crypt长度作为一个索引的细胞数量,并重新凋亡细胞核每单位长度的洞口,组间差异的分布基本上保持不变。

      Apoptotic cells per crypt expressed as mean (SEM) in crypts isolated from the distal colon of rats given corn oil (CO) or fish oil (FO) in the diet with or without 5 mM buthionine sulphoximine (BSO) in the drinking water. The total number of apoptotic cells is represented by total column height; the number in the top 40% of the crypt is represented in black and in the bottom 60% as the shaded region. Both FO and BSO significantly increased the total number of apoptotic cells/crypt at all time points (p<0.001).
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
      图5

      凋亡细胞/地下室表示为意味着在隐窝(SEM)分离大鼠远端结肠的玉米油(CO)或鱼油(FO)饮食有或没有5毫米buthionine sulphoximine (BSO)饮用水。凋亡细胞的总数是由总列高度;前40%的墓穴中的数字表示黑色和底部60%阴影区域。佛和BSO显著增加凋亡细胞的总数/地下室所有时间点(p < 0.001)。

      Discussion

      与其他非特异性的细胞死亡形式,细胞凋亡是维护组织内稳态的基础。29日最近的工作表明,凋亡机制的失败会导致突变的频率增加,体外和体内粘膜上皮,与单独使用这种效应倾向于恶性肿瘤细胞的生存。30.相反,我们以前观察到的隐窝细胞凋亡率增加后食用鱼油与减少化学诱导异常地穴疫源地。8现在都承认x射线和化疗药物诱导细胞自杀的行为。其他较为温和的手段操纵细胞凋亡复制地区的实用价值的墓穴可能是大肠癌的预防或治疗疾病。31日

      在目前的研究中我们首先使用一个体外模型系统研究n - 3 PUFA的影响生长和存活的人类结肠癌细胞系。将EPA HT29细胞的细胞脂质与粘附细胞数目的减少和增加剂量依赖半胱天冬酶3活动贴壁细胞。的重要性还在发作引起的细胞死亡EPA的事实证实了广泛半胱天冬酶抑制剂和特定的半胱天冬酶抑制剂8和半胱天冬酶3消除了粘附细胞数量的减少。半胱天冬酶活动是细胞凋亡的一个重要特征。精确的角色和相互作用不同的半胱天冬酶家族成员仍在定义,但人们普遍认为半胱天冬酶3是主要的下游效应器半胱天冬酶裂解主要细胞在细胞凋亡。半胱天冬酶8另一方面是发起者半胱天冬酶形成的一部分肿瘤坏死因子α/ Fas TRADD或FADD通路相关。32化疗药物已被证明加强Fas和Fas受体配体表达的肿瘤细胞。的贡献这个途径诱导细胞凋亡,这些药物仍然是有争议的到三十五但目前的数据表明,EPA进入细胞膜脂质池可以通过Fas相关启动细胞凋亡机制涉及半胱天冬酶8。

      已经表明,诱导细胞死亡在HT29细胞通过EPA发生半胱天冬酶依赖性凋亡我们还建立了,它开始通过一个机制涉及活性氧。被选出的三种抗氧化剂具有不同特性的探索细胞凋亡和细胞的氧化还原条件之间的关系。Ebselen的活动,这取决于其能力模仿谷胱甘肽过氧化物酶活性催化地降低H2O2或脂质氢过氧化物的硫醇,如谷胱甘肽,36,37被发现是最有效的阻止EPA诱导贴壁细胞数量的减少。添加lazaroidU74389或Nac介质也保护HT29细胞的凋亡诱导效应环保局,虽然规模较小。U74389G是一个强有力的脂溶性膜脂质过氧化作用的抑制剂38,39而南汽的抗氧化性能源于其水解后并入细胞形成半胱氨酸,从而增加的可用性这对谷胱甘肽neosynthesis氨基酸。也有证据表明,Nac可以施加直接细胞质内的自由基清除活性。40综合这些数据有力地表明,脂质过氧化作用的细胞的氧化还原状态变化中发挥重要作用在EPA诱导HT29细胞的死亡。我们的数据是一致的其他一些PUFA所诱导的细胞凋亡的研究在人类癌症细胞17但他们的发现提供了一种有趣的对比Chinery和同事21显示,在其他两个人类结肠癌细胞系,细胞凋亡增加了减少细胞内过氧化氢水平接触引起的抗氧化剂。

      建立了抗氧化剂的能力来调节细胞凋亡在结肠癌细胞中,我们继续探讨内源性抗氧化剂的作用机制通过谷胱甘肽代谢介导。单独治疗30μM EPA HT29细胞谷胱甘肽含量的减少了大约20%后48小时。背后的机制并没有解决,但这种效应可能是由于脂质过氧化作用的增加导致谷胱甘肽的速度利用率超过neosynthesis。治疗的细胞γ-glutamylcysteine合成酶抑制剂BSO 48小时没有环保局的谷胱甘肽含量减少了大约90%,但对活细胞数无显著影响。相反,当细胞生长与EPA相对低浓度的15μM暴露在BSO,可行的粘附细胞相对于控制人数减少了约95%。这个急剧下滑的细胞生存能力在很大程度上是通过增加ebselen包含EPA和BSO孵化项目,和细胞数量回到大约85%的未经处理的控制文化。这些研究结果与假设一致,虽然EPA的存在有利于细胞脂质池提供了助氧化剂的条件下,细胞凋亡,减少细胞谷胱甘肽大大增加的脆弱性细胞,导致弗兰克细胞毒性和坏死。41从其他系统有证据表明细胞死亡谷胱甘肽耗竭条件下开关从细胞凋亡坏死。42

      与体外细胞暴露于EPA,老鼠导致消费FO提示合并EPA的隐窝细胞磷脂和亚油酸的含量下降(C18:2 n-6)和花生四烯酸(C20:4;n-6)与老鼠相比美联储有限公司这些变化与减少有关隐窝细胞增殖和细胞凋亡的增加远端结肠与动物相比,美联储的饮食含有有限公司这是符合我们自己的以前的工作和别人的杯里,这表明n PUFA调节隐窝细胞动力学在动物模型。43,44FO饮食的消费没有BSO没有显著影响粘膜谷胱甘肽水平但治疗BSO隐窝的谷胱甘肽含量减少了60 - 70%。没有统计上显著的BSO处理对隐窝细胞有丝分裂的影响,没有总粘膜损害的证据。然而,隐窝细胞凋亡的频率显著增加公司和FO喂老鼠BSO处理,观察和最高水平的细胞凋亡在BSO FO喂养的大鼠治疗。这些发现出现与体外研究一致。显然,助氧化剂条件支持隐窝细胞体内细胞凋亡和EPA和谷胱甘肽耗竭的影响可以结合提供更强的隐窝上皮pro-apoptotic信号。但是,与体外模型体系,没有证据表明坏死总值的谷胱甘肽耗竭结肠粘膜的变化。

      凋亡细胞核是罕见的在任何位置仅在动物的结肠隐窝美联储公司但有一个大幅增加细胞死亡动物对待DMH的有害致癌物质。公司和FO喂老鼠,DMH诱导的凋亡细胞核是几乎完全局限于基底地穴的一半8而凋亡事件与佛的关联和BSO整个隐窝(图分布更均匀5)。相似的凋亡细胞核分布报道最近在家族性腺瘤息肉病的患者在治疗后苏灵大,这是与息肉数目显著减少。45

      我们的研究结果建立了,据我们所知,第一次将一个n - 3 PUFA诱导半胱天冬酶活动在人类腺癌通过半胱天冬酶相关的细胞,促进细胞死亡机制开始之前细胞凋亡的形态学证据。机制似乎是依赖于细胞氧化还原平衡调制后的EPA细胞脂质。至关重要的是,我们已经获得的证据表明,体外模型的直接相关性的影响膳食脂质在动物模型的完整结直肠粘膜。EPA进入隐窝上皮细胞脂质鼠通过一个机制,导致细胞凋亡也敏感的氧化还原平衡。有大量感兴趣的潜在病理影响peroxidised脂质和其他来源的氧化应激在肠道。46然而,目前的研究,再加上先前的研究显示,食用鱼油抑制肿瘤的外观变化与DMH治疗后,8,44进一步增加了重量,越来越多的证据表明,操纵细胞脂质有潜在好处在大肠癌的预防和治疗。31日

      确认

      作者希望感谢西蒙•迪肯和瓦莱丽·拉塞尔的技术援助。这项工作是在生物技术和生物科学研究委员会的支持下,英国。

      略语

      非甾体抗炎药
      非甾体抗炎药物
      PUFA
      多不饱和脂肪酸
      环境保护署
      二十碳五烯酸
      DMH
      1、2、二甲基肼盐酸盐
      DMEM
      杜尔贝科修改鹰的媒介
      饥饿
      脂肪酸甲基酯
      美国公共电视台
      磷酸缓冲盐
      谷胱甘肽
      减少谷胱甘肽
      GSSG
      氧化谷胱甘肽
      GSX
      细胞内谷胱甘肽
      BSO
      buthionine sulphoximine
      BAF
      Boc-Asp -FMK(当地)
      机构
      p-nitroanilide
      南汽
      N乙酰半胱氨酸
      有限公司
      玉米油
      佛
      鱼油

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