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背景有人建议,血清学筛查腹腔疾病(CD)在慢性原因不明的hypertransaminasaemia患者应该执行。
的目标是评估CD诊断的特异性血清IgA antitissue转谷氨酰胺酶(tTG)连续测定在慢性hypertransaminasaemia患者使用最广泛利用ELISA基于tTG从天竺鼠抗原。
患者和方法我们研究了98例慢性hypertransaminasaemia,首次评估肝脏病学诊所。血清anti-tTG和antiendomysial (EmA)进行了分析。患者阳性EmA和/或anti-tTG提出了肠活检。最后,所有血清reassayed anti-tTG使用一个基于人类重组tTG ELISA抗原。
结果共有94/98 hypertransaminasaemic患者肝炎病毒阳性标记,82/98 (83%)anti-hepatitis C阳性病毒。肝脏组织学显示,大多数患者有轻度或中度慢性肝炎严重纤维化或公开的肝硬化时被发现在20/98。CD筛选表明,15/98 (16%)hypertransaminasaemic受试者anti-tTG值在CD患者一样的范围;然而,IgA EmA是积极的在只有2/98 (2%)。远端十二指肠活检,表现在9个病人,显示不完全的两个教育津贴+ / anti-tTG +绒毛萎缩患者,但在7/7正常EmA−/ anti-tTG +主题。EmA−病人anti-tTG +的存在价值是与特定的胃肠道症状,其他相关疾病、严重肝组织学,或病毒性肝炎标志物的分布。有一个积极的频率明显高于血清自身抗体(抗核,抗线粒体、antismooth肌肉和anti-liver-kidney微粒体抗体)在anti-tTG + / EmA−病人比其他科目(9/13v10/83;p < 0.003)。此外,之间的相关性被发现血清丙种球蛋白和anti-tTG值(p < 0.01)。当血清与ELISA检测基于人类tTG作为抗原,没有假阳性结果观察到:只有两个教育津贴+肠道粘膜萎缩患者阳性anti-tTG而其他人都是负的,包括那些假阳性的基于豚鼠tTG作为抗原ELISA。
结论转氨酶升高和慢性肝病患者有一个高频的假阳性anti-tTG结果使用ELISA基于tTG豚鼠作为抗原。的确,anti-tTG的存在并不与EmA的存在或CD。这些假阳性取决于肝脏蛋白质的存在在商业tTG获得豚鼠肝和消失当人类tTG用作抗原ELISA系统。我们建议常用的基于豚鼠tTG ELISA抗原不应作为筛查工具用于CD在慢性肝病患者。
- 肝脏疾病
- 腹腔疾病
- antitissue转谷氨酰胺酶抗体
- antiendomysial抗体
- 自身免疫
- 肠道组织学
来自Altmetric.com的统计
肝损伤是一个频繁发现腹腔疾病患者(CD)含谷蛋白饮食;事实上,hypertransaminasaemia已经发表在10 - 54%的患者在CD的诊断。1 - 4因此,有人建议,血清学筛查CD在慢性原因不明的hypertransaminasaemia患者应该执行。5在这方面,以前的研究显示,血清antiendomysial抗体(EmA)分析预测最优测试CD在慢性肝病患者6但这间接免疫荧光试验并不容易适用于大规模筛查。然而,组织转谷氨酰胺酶(tTG)最近被认定为主要或唯一的自身抗原被EmA在CD患者7这允许使用ELISA试验,基于商业豚鼠组织转谷氨酰胺酶,检测存在anti-tTG血清自身抗体,具体诊断的CD。7 - 11先前的研究的临床效用anti-tTG决心报道没有或很少CD诊断,假阳性结果7 - 11当积极的结果在肠道组织学正常的患者,发现了潜在的CD已经先进的假说。8,9然而,正如在慢性肝病患者中(原发性胆汁性肝硬化),假阳性的发生anti-tTG抗体被发现的结果。12
在目前的研究中,我们评估血清anti-tTG和EmA在连续慢性hypertransaminasaemia患者由于各种原因。
患者和方法
研究包括98名连续对象(66男性;年龄18 - 64岁,中位数36)慢性hypertransaminasaemia(血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)水平> 40 IU / l超过两个月)参加了为肝病门诊内科巴勒莫大学医院的第一次1998年9月至1999年5月。以前住院病人在我们的部门或在我们的门诊检查肝脏或胃肠疾病被排除在外;我们也排除受试者与已知的CD和那些在过去经历了完整的血清学诊断评估CD。
饮酒,所有患者使用的药物,暴露于潜在的肝毒素了。实验室调查包括常规肝脏和肾脏功能测试。排除缺IgA免疫球蛋白水平评估。此外,所有的受试者都接受血清学筛查病毒性肝炎B和C (HCV);anti-HCV免疫反应性也得到了第三代免疫印迹试验(瑞芭3;美国加利佛尼亚凯龙星公司,维尔,邻位的诊断系统)。血清也使用商业ELISA检测乙型肝炎表面抗原(雅培诊断、北芝加哥,伊利诺斯州,美国)。在所有科目的反核(ANA),抗线粒体(AMA) antismooth肌肉(ASMA)和anti-liver-kidney微粒体(anti-LKM)抗体也评估了使用商业套装间接免疫荧光法。
所有患者接受经皮肝脏穿刺活检Menghini针按照前文所述的程序和措施。13肝脏组织学评价根据Desmet和他的同事们了。14
血清学筛查CD在所有患者进行血清EmA和anti-tTG化验测试基于来自几内亚猪作为抗原,按照下面描述的方法。主题与阳性血清EmA和/或anti-tTG被要求接受肠活检和面筋免费饮食开始确认疑似CD诊断。
在这项研究的第二部分,我们重新评估所有血清anti-tTG新ELISA抗体基于人类重组tTG (h-tTG)作为抗原,根据下面描述的方法。
控制血清评价anti-tTG抗体是来自两个不同的组:第一组包括20 EmA积极腹腔患者含麸质饮食总或全肠道绒毛萎缩,根据诊断标准的欧洲社会儿科胃肠病学和营养15;第二组的控制血清得到从35 EmA -健康受试者的成员我们诊所的医疗和实验室人员。在这些对照组的受试者与hypertransaminasaemic患者性别和年龄匹配。
所有受试者知情同意和协议是我们医院伦理委员会批准。
血清ANTIENDOMYSIAL抗体测定
如前所述,16IgA类EmA值测定使用商用间接免疫荧光技术(Anti-endomisio;Eurospital制药,意大利的里雅斯特)。
从豚鼠血清ANTI-tTG ELISA测定使用tTG抗原
这个实验是由一个自身的ELISA依照Troncone和他的同事描述的方法,9添加5 l CaCl更易2根据Sulkanen U microtitre触底板块和同事。8值被表示为一个百分比的积极参考血清,获得治疗腹腔患者诊断根据标准的欧洲社会儿科胃肠病学和营养,15显示在所有情况下EmA的存在。Anti-tTG值大于对照组的95,包括超过100名健康对照组阴性血清EmA,被认为是积极的(参考血清的8%)。intra-assay系数变化的IgA t-TG自身抗体ELISA (n = 22) 8.7%,和inter-assay变异系数为10.3% (n = 18)。
人类重组转谷氨酰胺酶
h-tTG基因是放大的肠活检乳糜泻患者治疗使用特定的引物基因的编码区,如前所述。17简而言之,cDNA克隆到表达载体(pET28b;Novagen,麦迪逊,威斯康辛州,美国)表示在细菌和纯化non-denaturing条件下使用IMAC试剂盒,瓦伦西亚,加州,美国。纯度的重组蛋白进行钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳。
血清ANTI-tTG使用人类重组tTG抗原ELISA测定
这个试验是在实验室进行的的里雅斯特大学医院儿科部门,对血清样本已经被冷冻在−80°C;控制测试中执行实验室20日anti-tTG抗体的血清样本第一次化验新鲜血清,然后冻结后八个月后−80°C显示,保存并没有明显改变的结果(interassay变异系数为9.6%)。
血清IgA anti-h-tTG抗体测定最近报道,用细微的修改。17人类重组抗原稀释在磷酸缓冲盐(PBS)收益率10μg /毫升的蛋白质浓度。0.1毫升整除的解决方案是放置在每个平面的触底板块(EIA / RIA 2580;配角,剑桥,麻萨诸塞州,美国)。在4°C一夜孵化后,盘子洗了三次在pbs 20 - 0.05%的渐变和阻塞pbs 20 - 0.1%的渐变在室温下20分钟。血清样本在pbs稀释1:10 0 - 0.1%渐变20孵化了一小时在室温下。盘子洗,孵化一小时在室温下与1:4000磷酸酶共轭反人类的IgA(σ- 3062)在pbs稀释- 1%牛血清白蛋白- 4%的聚乙二醇。免疫反应是由添加底物溶液,吸附量是阅读在405海里,直到标积极控制血清达成光学密度值为1.9。结果表示为一个百分比的积极控制血清。正常的值作为代表值< 16% > 2 SD高于500名健康受试者的意思。intra-assay系数变化的IgA h-tTG自身抗体ELISA是4% (n = 10)和inter-assay变异系数为9% (n = 10)。 This ELISA method has a sensitivity of 97% and a specificity of 99%.
肠道组织学
活检标本获得面向,如前所述。18,19嵌入在石蜡标本。幻灯片是苏木精和伊红染色和常规组织学分级的正常,部分绒毛萎缩,小计绒毛萎缩。此外,上皮内淋巴细胞(IEL)统计的人口及其执行每个数量的计算数量肠上皮细胞(正常值< 35 IEL每100人肠上皮细胞)。组织学所描述的是一个考官不知道实验室的测试结果。
统计分析
anti-tTG和EmA积极结果的百分比计算。使用χ频率进行了分析2测试。斯皮尔曼的r相关系数是用来评估协会血清anti-tTG结果与肝脏组织学或实验室测试结果。多元线性回归分析来评估之间的联系anti-tTG积极性和血清ALT和AST、血清白蛋白、血清胆红素、碱性磷酸酶,血清丙种球蛋白、血清γ谷酰基转移酶,和自身抗体的存在(ASMA安娜,AMA anti-LKM1)在慢性肝病患者。
结果
表1总结肝脏组织学结果和病毒性肝炎标志物结果所有患者进行了研究。
关于血清学筛查CD,无花果1显示anti-tTG值获得与基于tTG从天竺鼠抗原ELISA与慢性肝病学科与两对照组相比;所有已知CD患者EmA积极性(CD控制,组2)anti-tTG值高于正常上限(范围10-40 AU)而所有健康EmA -控制(组3)值在正常范围内。hypertransaminasaemic患者(组1),我们发现15/98(16%)的主题与anti-tTG值高于正常;这些值在同一个范围CD患者中。然而,IgA EmA化验时,只有2/98(2%)例慢性肝病患者积极;事实上,EmA -在所有anti-tTG - hypertransaminasaemic病人还在13/15病人阳性血清IgA anti-tTG。
血清IgA类组织转谷氨酰胺酶抗体(anti-tTG)滴定度由ELISA进行利用豚鼠的σtTG抗原。结果表示为非盟的价值观。以下组进行了研究:组1,hypertransaminasaemia病人(n = 98);组2,腹腔疾病患者(EmA积极)含麸质饮食(n = 20);组3,健康对照组(EmA -) (n = 35)。任意切断水平积极(折线)是一个非盟的8。
九15 hypertransaminasaemic anti-tTG阳性患者,包括两个EmA阳性患者,同意肠活检组织学研究。肠道组织学显示小计粘膜萎缩在两个病人积极EmA和anti-tTG(绒毛/隐窝比0.8 - -1.1)IELs显著增加。然而,没有其他的七个科目阳性血清IgA anti-tTG(但EmA -)肠粘膜异常:都有一个正常的绒毛/隐窝比率(范围2.9 - 4)和所有IEL数量低于正常限度为我们的实验室。
表2显示了临床数据、肝脏和肠道组织学和实验室特点的两个教育津贴+ / anti-tTG +,另13 EmA−/ anti-tTG +病人。EmA−/ anti-tTG + 13的病人没有不同于其他83 anti-tTG−hypertransaminasaemic主体的存在胃肠道症状或疾病相关:没有明显的吸收不良综合症和身体质量指数观察的病例中没有区别。肝脏疾病的严重程度从肝脏组织学评估是相同的两组,和病毒性肝炎标志物的分布也是相似的。然而,有一个更高频率的阳性患者血清自身抗体(ANA、AMA ASMA anti-LKM) anti-tTG +组比其他科目(9/13v10/84;χ2= 9.82,p < 0.003)和血清ANA滴定度与anti-tTG值(枪兵的r相关系数0.78;p < 0.0001)。之间没有相关血清anti-tTG价值观和大多数其他的实验室参数评估(血清白蛋白、血清ALT和AST,血清胆红素、碱性磷酸酶,凝血酶原活性,血清γ谷酰基转移酶,和血小板)之间发现了一个显著正相关血清丙种球蛋白和anti-tTG值(枪兵的r相关系数0.33;p < 0.01)。最后,我们进行了多元线性回归分析,描述一个因变量之间的关系,如积极的血清anti-tTG ELISA基于tTG从豚鼠作为抗原,以及各种独立实验室变量;这种分析证实了重大关联血清anti-tTG积极性和两个独立的变量examined-serum自身抗体积极性(β值0.566,p < 0.0004)和血清丙种球蛋白(β值0.465,p < 0.008)。没有anti-tTG积极性和其他独立变量之间的相关性研究(r2= 0.46)。
八个月结束后的第一部分的研究中,我们进行了IgA的ELISA anti-tTG使用h-tTG作为抗原,抗体和血清的重新评估所有患者纳入本研究。在病人组与慢性肝病,只有这两个科目与肠道粘膜萎缩和血清EmA +目前的诊断anti-tTG抗体升高:它们的值是在CD患者中观察到的范围(分别为19%和32.1%)。所有其他慢性肝病患者anti-tTG值在正常限制(范围1 - 13.1 %),包括13个主题与假阳性anti-tTG值评估ELISA基于tTG从天竺鼠抗原。最后,我们在这些13个病人的血清重复anti-tTG ELISA基于tTG来自几内亚猪作为抗原:在所有情况下假阳性结果的证实。患者为对照组,所有CD已知EmA +阳性血清IgA anti-tTG(范围17 - 116%)而没有健康对照组阳性(范围1 - 12.3%)
两个小结患者肠道粘膜萎缩面筋免费饮食开始,经过4 - 5个月的这个减肥法显示阴性血清IgA EmA和anti-tTG;在这些患者中,谁是anti-HCV积极hypertransaminasaemia持续面筋免费饮食。在其他病人,为病毒性肝炎标志物阴性,hypertransaminasaemia消失了三个月后面筋免费饮食。没有患者阳性anti-tTG但EmA−开始面筋免费饮食。
讨论
众所周知,CD可引起慢性hypertransaminasaemia在成人3,5和孩子们2,4,20.和相对风险CD患者中慢性原因不明hypertransaminasaemia与普通人群相比被估计为18.6。21一项研究表明,在慢性肝病患者,血清EmA决心CD诊断非常有用。6然而,EmA化验有几个限制:免疫荧光模式的解释是主观的,它需要猴食道或人体组织作为衬底,而且不容易使用大规模筛选。因此,最近的自身抗原识别蛋白质tTG CD7使可能的大规模使用ELISA试验,基于tTG从豚鼠肝抗原,检测IgA类anti-tTG抗体。
先前的研究在IgA anti-tTG决心表示非常高特异性的ELISA检测CD诊断,并有人建议,假阳性结果可能是潜在的CD盒7号到9号;因此使用ELISA基于这种蛋白质已被提升为屏幕上庞大的人口。11然而,没有一个先前的研究包括不同的原因和慢性肝病患者,在本研究之前,我们没有数据的使用anti-TG抗体试验在这些病人。我们的数据清楚地表明,血清IgA anti-TG ELISA测定基于tTG从豚鼠肝抗原不用于筛查慢性肝病患者CD。事实上,我们发现所有患者积极anti-tTG抗体和消极教育津贴,他们同意接受肠活检(7/13科目),肠道组织学正常,与正常绒毛和隐窝在IELs没有增加,这被认为是一个潜在的CD的标志。22因此很明显,当前基于豚鼠tTG ELISA用于CD时不具体的诊断慢性肝病患者。
关于这些“假阳性”的原因anti-tTG测试中,我们表明,这种现象显然与当前使用的抗原的纯度建议anti-tTG ELISA。事实上,这种广泛应用ELISA测试是基于从豚鼠肝是粗提物;通过验证,σtTG由至少14个不同的组件23它是合理的假设,在慢性肝病患者的血清可以从肝脏对蛋白质抗原的抗体矩阵,可能普遍(或交叉反应)人类和其他哺乳动物。事实上,在第二部分的研究当我们能够测试血清使用纯人类重组tTG anti-tTG,我们没有观察到任何假阳性结果:所有13个主题与假阳性anti-tTG价值评估时基于tTG从天竺鼠抗原的ELISA与新的ELISA系统导致负值。这证实了人类tTG ELISA诊断准确性更高CD诊断比常用的基于豚鼠anti-tTG ELISA抗原。然而,我们必须记住,所有gastroenterogical研究出版日期7 - 11报道一个很高的特异性anti-tTG决心CD诊断进行相同的ELISA用于本研究的第一部分(基于tTG从豚鼠肝),这种方法已经提出了大规模CD筛查。8,10,11我们的发现似乎与慢性肝病的存在和/或hyperglobulinaemia我们强调,如此高频率的假阳性anti-tTG结果不能外推到一般人群。
总之,我们发现了一个高频率的假阳性anti-tTG测试结果在慢性肝病患者使用常用anti-tTG ELISA基于tTG从豚鼠肝抗原。anti-tTG的存在并没有与教育津贴或CD的存在。我们证明了这些假阳性结果的“自然”中使用的抗原ELISA系统,他们消失了,如果新ELISA,基于人类重组tTG作为抗原,采用。因此anti-human-tTG ELISA,而不是anti-tTG分析基于tTG从豚鼠作为抗原,必须作为筛查工具用于CD在慢性肝病患者。
确认
这项工作是由G Montalto格兰特,60%来自MURST,由格兰特12/99 IRCCS“Burlo Garofalo”。
引用
略语
- CD
- 腹腔疾病
- 教育津贴
- antiendomysial抗体
- 测试
- 组织转谷氨酰胺酶
- AST
- 天冬氨酸转氨酶
- ALT
- 丙氨酸转氨酶
- 丙肝病毒
- 丙型肝炎病毒
- 安娜
- 抗核抗体
- AMA
- 抗线粒体抗体
- ASMA
- antismooth肌肉抗体
- anti-LKM
- anti-liver-kidney微粒体抗体
- h-tTG
- 重组人组织转谷氨酰胺酶
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐
- IEL
- 上皮内淋巴细胞