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背景胃感染人类病原体幽门螺杆菌结果在大型IgA的积累和IgM分泌细胞在胃粘膜。的分子机制导致B细胞迁移的胃粘膜H幽门感染但不清楚。
的目标是检查黏膜归巢受体整合素的表达α4β7和归巢受体次级淋巴组织,l-selectin,淋巴细胞激活胃、肠道或系统性的抗原。此外,检查胃粘膜addressin细胞黏附分子1的表达(MAdCAM-1),整合素的内皮counter-receptorα4β7。
对象和方法接种了H螺杆菌感染者胃(n = 8)或肠(n = 8)交付的灭活的霍乱疫苗。由此产生的循环疫苗是否排序根据α4β7和特定的B细胞l-selectin表达式和化验IgA的生产和使用酶联immunospot测定免疫球蛋白。此外,从7个循环CD4 + T细胞H幽门感染者是分级根据α4β7和l-selectin表达式。由此产生的T细胞分数然后化验为特定的扩散H幽门或系统性抗原破伤风类毒素。最后,胃MAdCAM-1表达式是由免疫组织化学H幽门(n = 16)感染和未感染(n = 8)人。
结果几乎所有的B细胞诱导胃和肠道抗原表达α4β7交付而然后coexpressed一半还少l-selectin。此外,H幽门反应性T细胞主要是α4β7 +中找到l-selectin + T细胞比例而破伤风特异性T细胞主要是α4β7−l-selectin +。MAdCAM-1出现在类似的数量在胃粘膜H幽门感染和未感染的个体。
结论B细胞和T细胞激活抗原传递到胃粘膜表达粘膜归巢受体整合素α4β7,细胞激活肠道。一起观察到胃内皮细胞表达MAdCAM-1,这可能部分解释了归航的淋巴细胞激活胃和小肠胃粘膜。
- 淋巴细胞贩运
- 整合素α4β7
- l-selectin
- 胃
- 幽门螺杆菌
略语
- ASC
- 抗体分泌细胞
- ELISPOT
- 酶联immunospot测定
- 施
- 霍乱毒素B亚基
- MAdCAM-1
- 粘膜addressin细胞粘附分子1
- 跨国公司
- 单核细胞
- 国会议员
- 膜蛋白
- PNAd
- 外周淋巴结addressin
- TT
- 破伤风类毒素
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐
- 如果
- 刺激指数
- cpm
- 每分钟计数
来自Altmetric.com的统计
幽门螺杆菌感染人类的胃慢性胃炎导致活跃在几乎所有受感染的受试者,渗透特征的大量淋巴细胞和中性粒细胞,和有组织的淋巴滤泡形成离散B和T细胞区域。1 - 3在先前的研究中,我们还注意到一个非常大的频率增加IgA, IgM分泌的胃粘膜细胞H幽门感染者与未感染的科目。4此外,在粘膜免疫灭活霍乱疫苗,疫苗中的特定IgA的反应只能检测到胃粘膜H幽门感染对象,而不是在未受感染的受试者,尽管两组志愿者类似频率的IgA肠道粘膜分泌细胞。5综上所述,这些观察结果强烈表明H幽门感染增加胃粘膜招募淋巴细胞的能力。
组织招募白细胞的循环被认为是一个多步过程包括几个不同的阶段。松散整合蛋白和碳水化合物配体之间的相互作用导致滚动沿着血管壁和特点,结合化学引诱物信号的组织,激活整合蛋白带来强大的约束力的内皮细胞的配体和逮捕,其次是压扁和外渗。6,7据推测,这个过程可以在任何这些步骤控制。迄今为止,粘附分子的表达白细胞和内皮细胞迁移的靶器官已经收到了大部分的注意力,和一些组织特定的淋巴细胞贩运可以解释某些粘附分子的表达。因此归航的次级淋巴组织依赖于表达周围淋巴结addressin (PNAd)内皮结合l-selectin表达了对循环细胞。此外,粘膜在肠道粘膜addressin表达内皮细胞粘附分子1 (MAdCAM-1)与整合素结合α4β7循环淋巴细胞。8循环B和T细胞诱导肠道免疫或感染所有携带α4β7而l-selectin只是表达等少数细胞。卖地最近,它也被显示,循环淋巴细胞与不同的归航承诺对趋化因子的反应不同14,15这可能是一个组织特定的淋巴细胞迁移的重要组成部分。
归巢受体细胞归巢到胃组织的使用但是仍然未知。它最近被证明在人类胃粘膜表达MAdCAM-1小静脉,16淋巴滤泡,发展以应对H幽门感染内皮细胞表达PNAd和MAdCAM。16,17这个表达式在多大程度上与招聘相关的循环淋巴细胞还没有检查。更好地定义分子识别事件导致淋巴细胞贩运到H幽门胃粘膜感染,我们采取了不同的方法。归巢受体表达在胃癌免疫诱导B细胞由immunomagnetic细胞排序紧随其后的是酶联immunospot测定有关酶联免疫斑点)(化验。归巢受体的表达H幽门特定循环CD4 + T细胞是由磁排序之后,还研究了体外刺激。此外,MAdCAM-1胃内皮细胞上的表达H幽门感染和未感染的个人使用免疫组织化学检查。
材料和方法
志愿者和免疫工作
志愿者
本研究是人类研究伦理委员会的批准后执行的医学院,Goteborg大学,所有的志愿者给了知情同意参加。二十个三H幽门感染者中招募病人参加卡大学医院胃肠病学单位,Goteborg,或者通过血清学筛查献血者的健康。18在报名之前,H幽门感染被积极的血清学或尿素呼气试验证明。18没有感染志愿者积极溃疡或服用任何药物至少一个星期前。
十六岁H幽门感染志愿者收到两个剂量的口服霍乱疫苗(Dukoral;SBL菌苗,斯德哥尔摩,瑞典)19两个星期。每一剂量的霍乱疫苗由1011杀了霍乱弧菌生物和1毫克的重组霍乱毒素B亚基(施),鉴于在胃粘膜或小肠。八的志愿者(36 - 61岁;六个男人和两个女人;四个无症状携带者,三个有消化不良的症状,一个十二指肠溃疡病人)intragastrically接种两次,如我们所述附纸的这个问题肠道。20.短暂4毫升的疫苗都是直接通过内窥镜小液滴分布于窦的粘膜,与患者在左外侧位置。另一组八个志愿者(长篇岁;四个男人和四个女人;五无症状携带者,两个有消化不良的症状,一个十二指肠溃疡患者)接受了疫苗在小肠如前所述。20.进行gastroduodenoscopy和介绍了内窥镜Treitz-that的韧带,大约30厘米远的幽门括约肌和疫苗通过内窥镜在20毫升的总量。
七个额外H幽门感染志愿者(22-50岁;四个男人和三个女人;所有人被招募为无症状携带者)研究外周血T细胞的激活。此外,八个健康志愿者H幽门感染(22-36岁;5个男人和三个女人)在健康的志愿者招募来确定MAdCAM-1表达式。
样本采集
Heparinised静脉血收集前和最后的免疫接种后一周志愿者,并用于分析抗体分泌细胞(ASC)。第一次,四个窦的活检直径2毫米,包括上皮和固有层也收集了从局部麻醉下每个志愿者。胃活检也来自八个未受感染的人。活检是立即嵌入在10月化合物,在液态氮冷冻,随后用于MAdCAM-1的免疫组织化学检测。一个额外的从每个志愿者在福尔马林固定,切片和胃炎的等级从0到3(没有,轻度,中度或严重),根据悉尼升级系统。21
七个H幽门感染志愿者流血一次静脉血的集合,用于T细胞活化的研究。
隔离的单核细胞(跨国公司)
跨国公司是隔绝heparinised血液通过梯度离心法Ficoll-Hypaque(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典)。接口收集跨国公司,与冷洗了三次磷酸缓冲盐(PBS),以及在寒冷的PBS resuspended补充1% (v / v)胎牛血清或Iscove培养基的5%胎牛血清和100μg /毫升的庆大霉素(英国爱丁堡Gibco欧洲)(完全培养基)。细胞悬浊液被保存在冰前进一步分离或化验ASC数字。
检测循环ASC的粘附分子
细胞表面整合素的表达α4β7和l-selectin通过孤立的ASC决心使用有关酶联免疫斑点技术。结合immunomagnetic细胞分类和22简而言之,顺磁珠(Dynabeads;Dynal,奥斯陆,挪威)涂以单克隆抗体克隆第1幕(一种礼物DJ Ringler博士Leukosite Inc .,剑桥,麻萨诸塞州,美国)或Dreg-56 (Pharmingen,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国),指定整合素α4β7和l分别-selectin。涂布珠子与跨国公司停业,洗和混合和磁选后产生的积极的和消极的选择相同数量细胞悬浊液resuspended在完全培养基。然后他们被化验频率的所有特定的IgA免疫球蛋白分泌细胞和整体V霍乱弧菌特定的IgA, IgM分泌细胞使用有关酶联免疫斑点技术两个颜色。4,5,23这些特殊的同形像选择基于我们之前的分析研究,表明施诱发只有弱循环IgM反应,和整个细胞的组成部分疫苗只产生免疫球蛋白反应可以忽略不计。24,25
ASC表达一定的百分比计算标记数除以总数ASC正分数的正面和负面的ASC分数化验在同一频率。未分离细胞化验在平行于积极的和消极的选择细胞悬浮液和斑点的和积极的和消极的ASC分数一致对应(80 - 120%)内点的总和与未分离细胞井孵化。
流通的粘附分子检测T细胞
外周血T细胞是准备从跨国公司停业7 non-immunised志愿者通过隔夜孵化2-aminoethylisothiouroniumbromide氢溴酸盐治疗羊红细胞。CD4 +和CD8 +细胞被孤立于外周血T细胞悬液通过孵化Dynabeads涂有CD4和CD8抗体,分别(Dynal)。珠子被孵化与detachabead随后删除解决方案(Dynal)根据制造商的指示。其余non-T细胞抗体隔离后获得的分数大约三分之一的T细胞由B细胞(CD19 +)和三分之二单核细胞CD14 +),由流式细胞术,被用作辅助T细胞刺激细胞的来源。根据表达进一步分离l-selectin和α4β7执行使用相同的单克隆抗体,通过DNA结合链接器从Dynal Cellection珠子,根据制造商的指示。孤立的CD4 +和CD8 +细胞被孵化的Cellection珠准备,磁选后,使用DNAse珠子被裂解。这个过程导致了八个不同的细胞群:CD4 +l-selectin +、CD4 +l-selectin−、CD4 +α4β7 +、CD4 +α4β7−,CD8 +l-selectin +、CD8 +l-selectin−、CD8 +α4β7 +和CD8 +α4β7−细胞。磁分离T细胞亚群是有文化的一式三份,报1.5×105细胞每一起1.5×104辅助细胞圆底96孔板(Nunc、鲁开德、丹麦)。所使用的媒介是人类AB Iscoves中补充5% +血清3μg /毫升l谷氨酰胺,100μg /毫升的庆大霉素。T细胞培养与10μg /毫升的刺激H幽门膜蛋白(MP)准备,准备如前所述,4和使用1μg /毫升的多粘菌素B抑制任何残余脂多糖活动一个小时。并行文化刺激了50μg /毫升破伤风类毒素(TT);疫苗与几乎所有的瑞典人已多次非肠道接种)或10μg /毫升phytohaemaglutinin(骨螺诊断有限公司、庙山、英国),这是作为一个积极的控制。T细胞培养5天,1μCi3H标记胸苷(国际公司Amersham小都,英国)被添加到每个在过去的8 - 14小时的文化。把放射性物质的数量确定β-scintillation计数器,刺激指数(SI)计算每分钟计数(cpm)值除以获得与cpm值刺激后在相应的文化中没有的抗原。
免疫组织化学检测MAdCAM-1
从窦的Cryosections(8μm厚),十二指肠活检是安装在SuperFrost / Plus-glasses (Menzel-Glazer,布伦瑞克,德国),空气干燥,固定在冰冷的丙酮10分钟。部分是孵化用鼠标IgG1单克隆抗体特定人类MAdCAM-1(克隆1 aØ3,请提供的M Briskin博士Leukosite Inc .),使用未稀释的,或血管性血友病因子特定的鼠标IgG1单克隆抗体(Dako、斯特鲁普、丹麦),在PBS稀释1分25秒在室温下20分钟。同形像匹配的无关紧要的小鼠抗体(Dako)包含在每个实验作为消极的控制。后两个洗液PBS的部分是孵化与辣根过氧化物酶共轭antimouse免疫球蛋白(Dako)在PBS稀释40 5%人类AB血清。结合抗体被孵化与3形象化,3-diaminobenzidine(向量实验室Inc .,伯林盖姆,加利福尼亚,美国)在黑暗中在室温下5 - 10分钟。最后,部分与迈耶的苏木精复染色10秒钟,脱水,安装Mountex (Histolab、Goteborg、瑞典)。在徕卡显微镜检查整个组织部分在200×放大和组织区域测定与徕卡Qwin软件(德国徕卡)。分段交叉MAdCAM-1积极和血管性血友病阳性血管数表示为各自的船只数量每毫米2。
统计评估
T细胞亚群之间的差异进行评估通过魏克森讯号等级测试。
结果
归巢受体表达在B细胞激活胃或肠道免疫
的表达l-selectin和整合素α4β7确定循环细胞诱导的胃或肠道管理施和整体V霍乱弧菌生物,使用有关酶联免疫斑点技术immunomagnetic细胞排序和组合。我们曾使用这种技术来展示实质性差异归巢受体表达之间循环ASC口周围的和系统性的免疫工作。11志愿者参与的这部分研究分析了肠,胃,和外周血ASC频率,在我们的陪同。20.这两种免疫方案诱导ASC反应类似的大小由IgA和免疫球蛋白分泌细胞。在这项研究中,疫苗特定的ASC是用来检查归巢受体表达在B细胞活化后胃和肠道抗原,分别。的表达l-selectinα4β7类似于细胞诱导的免疫路线。因此粘膜归巢受体整合素α4β7被几乎所有的IgA表达,免疫球蛋白ASC引起肠道免疫,而这些ASC coexpressed的大约一半l-selectin(图1)。同样,几乎所有的循环施特定IgA和免疫球蛋白ASCα4β7胃引起的免疫表达,只有一个较小的ASC coexpressing的分数l-selectin(图1)。
归巢受体表达霍乱毒素B亚基(施)特异性抗体分泌细胞(ASC)引起的肠或胃免疫工作。循环淋巴细胞收集后七天胃或肠道免疫和分离方面的表达α4β7 (A)和l分别-selectin (B)。所有特定的频率IgA免疫球蛋白分泌细胞产生的细胞群的有关酶联免疫斑点化验,确定和表达为ASC的算术平均值(SEM)百分比表达各自的标记。
免疫诱导循环IgA, IgM分泌细胞疫苗的反应整个细胞组成部分。应答器的频率与施然而远低于特定的ASC,和整个细胞特定的ASC的频率也低于所有特定的ASC的频率。然而,归巢受体表达非常相似整个细胞特定的ASC引起的胃和肠道免疫,无论产生的同形像,整个细胞特定的多数ASC造成免疫方案都α4β7 +和l-selectin−(数据没有显示)。
归巢受体表达在循环H幽门特异性T细胞
循环特异性T细胞很难检测后粘膜免疫,因此我们决定研究胃抗原T细胞反应H幽门国会议员和系统性抗原TTH幽门受感染的细胞。CD4 +和CD8 +细胞的增殖反应积极的还是消极的l-selectin或α4β7决心,磁选后各自细胞子集和文化为五天H幽门国会议员或TT。所有不同的CD8 + T细胞的数量激增差(SI < 3在所有志愿者)刺激与议员或TT,没有结论性的人群之间的比较可以。CD4 +细胞数量另一方面回应不同的刺激以特有的方式。SI值刺激CD4 +α4β7 +细胞时获得的H幽门议员总是高然后获得当刺激相同数量的CD4 +α4β7−细胞(p < 0.02)。相反,更高的反应发现TT的CD4 +α4β7−细胞比CD4 +α4β7 +细胞(p < 0.05)(图2表达时)。l-selectin分析,两者兼而有之H幽门国会议员和TT活性细胞被发现主要集中在CD4 +l-selectin +细胞、CD4 +和响应l-selectin−数量(图要低得多2B)。因此,CD4 + T细胞反应H幽门国会议员被发现是优先α4β7 +和l-selectin +,应对TT主要是α4β7−和l-selectin +。
归巢受体表达在幽门螺杆菌膜蛋白(MP)和破伤风类毒素(TT)特定循环CD4 + T细胞。循环从H螺杆菌感染T细胞收集个人和CD4 +细胞分离与CD4孵化特定的磁珠。然后他们被进一步分离对intergrinα4β7 (A)或l-selectin (B)。每个细胞的子集是刺激H螺杆菌议员或TT,和扩散化验五天后。数据表示为算术平均值(SEM)的增殖指数α4β7 +和α4β7−细胞(A),和l-selectin +和l-selectin−细胞(B)。* * * p < 0.05, p < 0.02为比较积极的和消极的细胞与相应的抗原刺激。
内皮表达MAdCAM-1胃粘膜
评估胃炎根据更新后的悉尼系统显示未感染志愿者免费胃炎H幽门感染者有胃炎得分为1.9分(0.4)。Immunhistochemical MAdCAM-1表达式的分析在胃粘膜胃内皮细胞显示阳性染色H幽门感染和未感染的个体(无花果3)。H幽门感染者有3.5(1.8)(平均(SD)) MAdCAM-1 +船每毫米2胃粘膜。这个值没有明显不同,在未受感染的志愿者(3.6 (1.8))。此外,船舶的总数,冯Willebrandt因素取决于染色,在志愿者的两组相似。的H幽门感染志愿者每毫米4.5(2.1)的船只2胃粘膜和未受感染的个人每毫米4.5 (1.5)2。因此在胃MAdCAM-1表达式之间没有区别H幽门感染和未感染的个体。
粘膜addressin细胞粘附分子1 (MAdCAM-1)胃粘膜中表达。胃活检收集腔粘膜的感染(A)和幽门螺杆菌感染(B)个人,和MADCAM-1表达内皮细胞是由免疫组织化学。原来放大×200。
讨论
在这项研究中,我们表明,B和T淋巴细胞激活抗原存在于粘膜归巢受体整合素表达的胃粘膜α4β7。此外,的表达l-selectin,归航提供中介组织的淋巴组织,被认为在大多数H幽门反应性T细胞和B细胞诱导的一半胃免疫。内皮配体α4β7,MAdCAM-1,发现胃内皮细胞感染和未感染的个体。
共同粘膜免疫系统的存在已经令人信服地证明了学习迁移的肠道激活B细胞最终效应网站相关的肠道固有层和粘膜外分泌腺。26,27几项研究已经表明,粘膜激活T细胞也从他们归纳网站通过循环迁移到最后在粘膜表面效应的网站。12,13,28然而,有很大程度上的粘膜免疫系统。29-31甚至在肠道中,B细胞反应引起的口周围的和直肠抗原交付不同分布在整个肠道粘膜,和最接近的初始抗原相遇。32作为疫苗的发展的先决条件H幽门感染,我们最近检查免疫工作可以诱发胃免疫反应。5,20.这些研究显示,只有H幽门感染者有能力增加胃粘膜免疫后,B细胞反应和胃和肠道免疫诱导胃和十二指肠在这些人的反应。因此H幽门感染的粘膜似乎与小肠淋巴细胞归巢。在这些实验中,我们不能排除这种可能性,一些来自胃免疫抗原可能到达肠道归纳网站。然而,这是不太可能为疫苗通过内窥镜能准确提供小水滴,确保验货,流体分布在粘膜和吸收几乎立即。此外,所有的高结合容量神经节苷脂GM1,这是目前在所有有核细胞,可能导致快速捕获所有所有的胃粘膜疫苗。
为了更好地理解背后的机制胃淋巴细胞招聘,我们检查了由人类B细胞归巢受体表达激活抗原存在于胃。慢性H幽门感染不产生可检测循环B细胞自发分泌抗体的数量H幽门抗原,4目前还没有H幽门疫苗许可供人类使用。因此,我们选择研究B细胞反应两种不同类型的粘膜抗原特征,有效的蛋白免疫原施以及整个灭活V霍乱弧菌生物。这些研究表明,循环ASC胃引起的免疫携带相同的归巢受体细胞诱导的肠道免疫,几乎所有细胞中表达α4β7和coexpress不到一半l-selectin。相同的归巢受体曾被发现在B细胞诱导口周围的或直肠与相同的霍乱疫苗免疫接种。11这些结果表明,B细胞在任何网站在胃肠道诱导表达相同的归巢受体,因此一个公认的人类治疗性疫苗H幽门感染可能传递到小肠,而不是直接向胃粘膜。
T细胞与B细胞相比,循环具体H幽门抗原可以发现在大多数感染者的血液循环。T细胞特有的传播H幽门议员是α4β7 +族群中发现的。在以前的研究中,T细胞诱导肠道病原体轮状病毒或口头传递抗原也可以驻留在α4β7 + T细胞比例。10,13,33我们目前的研究结果因此加强之间的相似性在归巢受体使用细胞激活肠或胃抗原。之前的研究也表明,T细胞诱导肠外破伤风或腮腺炎疫苗接种优先α4β7是负面的。10,13这些结果证实了在目前的研究中,表明TT特异性T细胞造成皮下免疫工作主要是在α4β7−子集。然而,我们还展示了第一次注射用药物的免疫和TT引起特异性T细胞表达l-selectin。有些意外,最H幽门反应性T细胞也被发现l-selectin +分数。因此,表达式l-selectin不同B和T细胞激活胃抗原交付H幽门是否优先检测到特定的T细胞l-selectin +分数而胃霍乱疫苗接种引起的B细胞l-selectin +或l-selectin−。这可能是用假设来解释H幽门反应性T细胞检测到可能是记忆细胞而被检测出特定的ASC效应细胞疫苗。不同的表达l-selectin已经检测到所谓的中央内存和效应记忆T细胞,在某种意义上,中央记忆细胞表达l-selectin虽然效应记忆细胞l-selectin负面的。34
在最近的一项研究中,Michetti和同事35证明了整合素抗体抵御α4β7阻塞H猫属引起的感染,以前口服免疫H猫属声处理基于这些发现,我们检查如果增加淋巴细胞迁移H幽门感染人类粘膜引起粘膜的增加表达addressin MAdCAM-1,α4β7内皮配体。但是没有这样的胃粘膜感染和未感染的个体MAdCAM-1几乎相同的表达式。因此,其他机制必须负责增加淋巴细胞迁移到人类的胃H幽门感染。这些可能包括以前发现胃细胞间黏附分子1的表达增加H幽门被感染的人。17增加本地生产的B细胞吸引趋化因子1 (BCA-1),以及白介素8,咆哮,与增长相关的癌基因α(GRO-α)中也被检测到H幽门感染,36-38也可以导致胃淋巴细胞积累。
总之,在这项研究中我们已经证明,B细胞和T细胞激活抗原传递到胃粘膜携带粘膜归巢受体,类似在小肠细胞激活。加之胃内皮细胞表达MAdCAM-1的观察,可能部分解释了类似的导航行为在胃和小肠细胞的激活。这些观察结果还表明,一个潜在的未来的疫苗H幽门可能没有直接针对胃粘膜但可能传递到小肠。
确认
我们感谢所有的志愿者参与了这项研究。我们感谢安妮卡哈姆雷特博士帮助招募的志愿者,和卡米拉·约翰逊和胃肠病学部门员工卡大学医院的技术援助和慷慨的帮助。抗体的慷慨的供应第1幕和1 aØ3 Leukosite inc .)。这项研究得到了瑞典医学研究理事会(格兰特没有16 x - 13055),瑞典战略研究基金会,瑞典医疗社会,哥德堡皇家科学基金会,资助从阿斯利康研究中心,波士顿,麻萨诸塞州,美国。
略语
- ASC
- 抗体分泌细胞
- ELISPOT
- 酶联immunospot测定
- 施
- 霍乱毒素B亚基
- MAdCAM-1
- 粘膜addressin细胞粘附分子1
- 跨国公司
- 单核细胞
- 国会议员
- 膜蛋白
- PNAd
- 外周淋巴结addressin
- TT
- 破伤风类毒素
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐
- 如果
- 刺激指数
- cpm
- 每分钟计数