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条文本gydF4y2Ba

菜单条gydF4y2Ba
肠道免疫gydF4y2Ba
MIP-2由上皮细胞分泌的增加小鼠肠嗜中性粒细胞和淋巴细胞招聘gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. Y OhtsukagydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  2. J李gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  3. Stamm D SgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  4. ir桑德森gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba
  1. 一个gydF4y2Ba成人和儿科胃肠病学,圣巴塞洛缪和皇家伦敦医学和牙科学院,伦敦,英国,gydF4y2BabgydF4y2Ba发展胃肠病学实验室,哈佛大学临床营养研究中心,结合程序在儿科胃肠病学和营养,马萨诸塞州综合医院,波士顿,麻萨诸塞州02129,美国gydF4y2Ba
  1. 我博士R桑德森,成人和儿科胃肠病学,圣巴塞洛缪和皇家伦敦医学和牙科学院的套件31日统治,59岁的巴塞洛缪接近,英国伦敦EC1A 7,。gydF4y2Bai.r.sanderson在{}mds.qmw.ac.ukgydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba入侵肠道粘膜的白细胞是肠道炎症的特征但上皮的作用在策划这个招聘没有检查体内。培养肠上皮细胞分泌多种趋化因子,通常以应对代理存在于肠道内腔。巨噬细胞炎性蛋白- 2 (MIP-2)是一个吸引中性粒细胞的趋化因子,从肠道上皮细胞及其分泌增强炎症刺激如白介素- 1β。我们假设这种物质生产的MIP-2上皮细胞会增加白细胞迁移进入小肠。gydF4y2Ba

目的gydF4y2Ba研究趋化因子的影响从体内肠道上皮细胞分泌。gydF4y2Ba

方法gydF4y2BaMIP-2小鼠肠上皮细胞中表达使用的上皮细胞特定的启动子基因编码肠脂肪酸结合蛋白。这些转基因小鼠的肠道被分析。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba上皮细胞从转基因老鼠MIP-2表达野生型老鼠却不。中性粒细胞招聘、检查髓过氧化酶(MPO)染色和总MPO活性肠的每单位重量,显著增加在转基因小鼠小肠和结肠近端,这是被anti-MIP-2抗体治疗。上皮内和固有层淋巴细胞在转基因小鼠也增加了。他们表现出趋药性的活动MIP-2 Boyden钱伯斯和MIP-2受体(CXCR-2) mRNA表达经逆转录-聚合酶链反应。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba这些实验是第一个显示上皮细胞趋化因子在体内的功能作用,揭示一个意想不到的角色控制的中性粒细胞趋化因子MIP-2黏膜淋巴细胞迁移。gydF4y2Ba

  • 趋化因子gydF4y2Ba
  • 上皮细胞gydF4y2Ba
  • 肠粘膜gydF4y2Ba
  • 白细胞招募gydF4y2Ba
  • 转基因小鼠gydF4y2Ba

  • 略语gydF4y2Ba

    CMF-HBSSgydF4y2Ba
    CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba/毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba免费汉克斯平衡盐溶液gydF4y2Ba
    FabpigydF4y2Ba
    肠脂肪酸结合蛋白gydF4y2Ba
    IELgydF4y2Ba
    上皮内淋巴细胞gydF4y2Ba
    伊尔gydF4y2Ba
    白介素gydF4y2Ba
    LPLgydF4y2Ba
    固有层淋巴细胞gydF4y2Ba
    有限合伙人gydF4y2Ba
    脂多糖gydF4y2Ba
    MIP-2gydF4y2Ba
    巨噬细胞炎性蛋白- 2gydF4y2Ba
    MPOgydF4y2Ba
    髓过氧物酶gydF4y2Ba
    rt - pcrgydF4y2Ba
    逆转录-聚合酶链反应gydF4y2Ba
    细胞受体gydF4y2Ba
    T细胞受体gydF4y2Ba

    • http://dx.doi.org/10.1136/gut.49.4.526gydF4y2Ba

    来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba

      请求的权限gydF4y2Ba

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      小肠上皮细胞调节营养物质的吸收,作为外部环境的障碍。肠道上皮细胞也在黏膜免疫反应中起着重要的作用。首先,它控制着从腔通过抗原的免疫细胞在固有层或派尔集合淋巴结补丁。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba失去屏障功能,例如,缺乏钙粘蛋白的功能,导致肠道炎症。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba其次,肠上皮细胞是理想放置信号肠道环境的变化,通过免疫活性蛋白质的正常表达。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba候选信号包括趋化因子的分泌gydF4y2Ba4 -gydF4y2Ba和粘膜T抗原呈递细胞。gydF4y2Ba12 - 14gydF4y2Ba然而,没有体内观察还演示了肠道上皮细胞的信号功能。gydF4y2Ba

      体外实验一再表明上皮细胞系应对细菌病原体分泌趋化因子。gydF4y2Ba6 - 9gydF4y2Ba此外,变化在正常肠上皮细胞趋化因子的表达不同的内容。例如,丁酸,短链脂肪酸来自non-absorbed碳水化合物在肠道细菌的发酵,调节巨噬细胞炎症蛋白2的表达(MIP-2)和白介素8 (IL)在肠道上皮细胞。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba上皮细胞趋化因子也可能扮演一个角色在克罗恩病和溃疡性结肠炎。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba因此我们提出,由上皮细胞表达趋化因子在体内会导致增加白细胞招募到肠道粘膜。gydF4y2Ba

      MIP-2α趋化因子家族的成员还包括人类引发(这并不表示鼠标),人类GROα鼠KC / CINC和小鼠KC。MIP-2被认定为6 kDa肝素结合蛋白小鼠巨噬细胞分泌的细胞行生264.7与脂多糖刺激后(有限合伙人)。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba与引发人类,MIP-2趋化中性粒细胞和诱发局部中性粒细胞浸润贼当注入后的老鼠。gydF4y2Ba19gydF4y2BaMIP-2表达只在肠道上皮细胞与LPS刺激后或促炎细胞因子。这不是表达从体内健康的肠道上皮细胞分离。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba因此,诱导表达的MIP-2上皮使我们能够研究趋化因子的影响信号通过肠上皮细胞体内。为了产生MIP-2不断从肠道上皮细胞,我们联系一个上皮细胞特定基因的启动子的肠脂肪酸结合蛋白(Fabpi)gydF4y2Ba20 - 22gydF4y2BaMIP-2 cDNA和建立MIP-2转基因小鼠。因为这些老鼠产生MIP-2专门从他们的肠道上皮细胞,我们检查了肠道的变化和评估上皮细胞体内的免疫作用。gydF4y2Ba

      在本报告中,我们描述首次肠道上皮可以编排白细胞趋化因子的分泌的招聘进入体内肠,展示了积极参与肠道粘膜上皮细胞的免疫系统。gydF4y2Ba

      材料和方法gydF4y2Ba

      代MIP-2转基因小鼠gydF4y2Ba

      Fabpi-MIP-2构造使用包含SV40的JvSV质粒基因内区及其聚腺苷酸化网站,请提供的E施密特博士和博士P分类账。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba一个EcoR I-BamH我Fabpi启动子片段插入pUC13, J博士提供的戈登,然后克隆。该启动子序列包含所需的1200个碱基最大肠道上皮细胞的表达。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba然后从MIP-2 cDNA克隆派生cDNA,凯龙星有限公司提供的(美国加州维尔),用聚合酶链反应(PCR)与引物合成Xho我网站(意义:5′-CACACTCGAGCAGA CTCCAGCCACACTTCA-3′)和一个Xba我网站(反义:5′-TGTGTCTAGATTCTT CCGTTGAGGGACAGC-3′)。结果Xho I-MIP-2-Xba我互补dna插入到Fabpi-SV40 Fabpi启动子之间的质粒和SV40基因内区(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)。最后构建测序,然后Fabpi-MIP-2-SV40 DNA切除与EcoR之前我和Nsi卵母细胞注入由NIH的莱特博士消化系统疾病研究中心的核心(美国马萨诸塞州波士顿)。实验小组委员会批准的研究动物照顾马萨诸塞州综合医院,波士顿,和动物(科学程序)法案1986年,家庭办公室,伦敦。gydF4y2Ba

      Generation of macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) transgenic mice. (A) Diagrammatic representation of the plasmid containing the fatty acid binding protein of the intestine (Fabpi) promoter linked to the MIP-2 gene and the SV40 intron and polyadenylation site. MIP-2 cDNA was derived from a mouse MIP-2 sequence using polymerase chain reaction with primers synthesised with a Xho I site and an Xba I site. (B) Northern blot analysis of MIP-2 mRNA accumulation in the intestinal epithelium of wild-type and transgenic mice. MIP-2 mRNA was detected using an MIP-2 cDNA probe. Epithelial cells were removed from wild-type mice (lanes 1, 2) and from transgenic mice (lanes 5, 6). MIP-2 mRNA derived from IEC-6 cells stimulated with interleukin 1β (IL-1β) was used as a positive control (lanes 3, 4).
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1gydF4y2Ba
      图1gydF4y2Ba

      代的巨噬细胞炎性蛋白2 (MIP-2)转基因小鼠。(A)的图解表示包含肠脂肪酸结合蛋白的质粒(Fabpi)基因启动子与MIP-2 SV40内含子和聚腺苷酸化的网站。MIP-2 cDNA源自鼠标MIP-2序列用聚合酶链反应引物合成与Xho我站点和一个Xba我网站。(B)北部的污点分析MIP-2 mRNA积累在肠道上皮细胞的野生型和转基因小鼠。MIP-2信使rna检测使用一个MIP-2 cDNA探针。上皮细胞从野生型小鼠(通道1、2),从转基因小鼠(车道5、6)。MIP-2 mRNA源自IEC-6与白介素- 1β细胞刺激(IL-1β)被用作积极控制(车道3、4)。gydF4y2Ba

      MIP-2印迹分析gydF4y2Ba

      在基因组DNA的存在转基因检测到南部杂交利用基因组DNA的老鼠尾巴。DNA样本在1%琼脂糖凝胶分离和转移到Gene-Screen +膜(杜邦/欧宁,波士顿,麻萨诸塞州,美国)。杂交是使用MIP-2 cDNA标记与执行gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] dCTP(杜邦/欧宁)。对老鼠进行的实验都是年龄在3 - 6个月。gydF4y2Ba

      细胞的准备gydF4y2Ba

      每个样本被肠道和Ca而通红gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba/毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba免费汉克斯平衡盐溶液(CMF-HBSS;西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国),并删除所有派尔集合淋巴结补丁,隔离的上皮细胞,上皮内淋巴细胞(IELs),固有层淋巴细胞(lpl)。小肠纵向剖开,用CMF-HBSS轻轻清洗,横向切成小块。每一部分包含1毫米在CMF-HBSS孵化EDTA和搅拌20分钟去除上皮的四倍。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba细胞悬浊液是尼龙网过滤和离心。上皮细胞组成的细胞球,IELs,悬浮在RPMI 1640中含10%胎牛血清(σ),10毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺、0.05毫米2-mercaptoethanol 100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升。隔离lpl,其余肠被转移到烧瓶包含RPMI 1640与90 U /毫升胶原酶(σ)和2.5 U /毫升蛋白酶(σ),搅拌,在37°C水浴60分钟。细胞悬浊液,包含lpl、尼龙网过滤和离心。上皮细胞、IELs和lpl不连续Percoll纯化使用45 - 70%(σ)梯度如前所述。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba收集细胞表面的上皮细胞。污染有潜在固有层细胞上皮细胞是微不足道的使用这种技术。这些细胞在接口收集IELs和lpl和悬浮在RPMI。IELs和lpl、细胞生存能力评估通过台盼蓝染料排斥。IELs可行和lpl大于85%,染色准备IELs和lpl显示淋巴细胞的形态学特征与最小的上皮细胞污染。gydF4y2Ba

      迁移试验,作为控制系统从脾脏淋巴细胞分离聚蔗糖密度梯度离心法。gydF4y2Ba

      MIP-2 mRNA转移污点分析、mRNA rt - pcr和免疫印迹分析gydF4y2Ba

      杂交实验使用MIP-2互补脱氧核糖核酸信使rna后上皮细胞是由电泳分离和转移到尼龙膜,如前所述。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba总之,上皮细胞被转移到异硫氰酸胍盐缓冲和单一化。信使rna被苯酚萃取提取。的样品分离4-morpholinepropanesulphonic acid-formaldehyde琼脂糖凝胶和转移到Gene-Screen +膜(杜邦/欧宁)。插入与[标签gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] dCTP(杜邦/欧宁)和屁股是杂交。洗屁股在放射能照像−70°C。信使rna源自IEC-6细胞刺激IL-1β(1 ng / ml)作为一个积极的控制。测量信使rna,反转录聚合酶链反应(RT),放大是由特定MIP-2引物,如前所述。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba

      MIP-2蛋白被发现在匀浆免疫印迹之前报道。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba

      髓过氧物酶测量gydF4y2Ba

      CMF-HBSS灌注(25毫升)transcardially冲洗肠道血管内的血液所有组件。肠切除,然后轻轻洗CMF-HBSS和急冻液体NgydF4y2Ba2gydF4y2Ba。肠粘膜的中性粒细胞浸润被染色冰冻切片检查(4μm)髓过氧化酶(MPO)利用渴望耶茨的反应。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba部分与渴望孵化耶茨的试剂(σ):1毫克/毫升10毫升的0.1米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.6)包含1μl /毫升3%的HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba30分钟,与苏木精复染色之前通过光学显微镜检查。gydF4y2Ba

      测量功能的MPO活性、组织标本称重和单一化5毫升的50 mM磷酸盐缓冲剂(pH值6.0)在4°C,并在000离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟在4°C。MPO提取0.5%溴化hexadecyltrimethylammonium (HTAB;σ)50 mM磷酸盐缓冲剂(pH值6.0)25°C。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba样品在干冰冷冻,解冻,用三次。这是然后在000离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟。浮在表面的反应了gydF4y2BaogydF4y2Ba邻联茴香胺盐酸盐(σ)包含1μl /毫升的3% HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,MPO活性spectrophotometrically化验。结果表示每单位重量的肠道。小肠的厚度大于在结肠内主要是因为大量的肌肉和结缔组织。MPO活性的表达作为整个组织的单位重量的比例似乎因此更大比小肠结肠样本。然而,这并不能否定比较相似的器官转基因和野生型老鼠之间。gydF4y2Ba

      ANTI-MIP-2抗体治疗gydF4y2Ba

      山羊antimouse MIP-2抗体(σ)是通过静脉注入小鼠阻止MIP-2从上皮细胞分泌的影响。1天1 - 3,μg / g体重的抗体被注入到小鼠尾静脉丸。老鼠被牺牲在7天,中性粒细胞招募检查。作为对照,相同体积的磷酸缓冲盐水注入老鼠是被用来注入抗体在实验老鼠。gydF4y2Ba

      免疫组织化学分析gydF4y2Ba

      空肠黏膜迅速冻结在10月包埋介质使用液态氮冷却异戊烷和储存在−70°C到处理。(4μm厚度)冻结的部分被剪掉了和空气干燥。部分与冷丙酮固定10分钟和孵化单克隆仓鼠antimouse CD3抗体(145 - 2 - c11)。洗后,部分被孵化与生物素结合山羊antihamster IgG抗体(向量实验室,彼得伯勒、英国)含4%正常小鼠血清。部分被孵化与抗生物素蛋白过氧化物酶(σ)。过氧化物酶活性检测与3、3′-diaminobenzenzidine-tetra-hydrochloride(σ)三羟甲基氨基甲烷HCl液中含0.01% HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba。每个部分由光学显微镜与苏木精复染色检查。非特异性染色评估在部分没有主要的抗体染色。gydF4y2Ba

      评估IEL肠和LPL号码,至少10绒毛检查每个部分如前所述。gydF4y2Ba24gydF4y2BaIELs每100上皮细胞的数量为每个标本数。lpl的数量每1毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba由图像分析决定。gydF4y2Ba

      淋巴细胞亚群分析gydF4y2Ba

      免疫荧光染色法进行IELs和lpl检查他们的亚种群单克隆鼠antimouse T细胞受体(TCR) -αβ和TCR-γδ抗体(PharMingen,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。积极与FITC染色细胞被发现共轭antirat免疫球蛋白(Dako、威、英国)。这些抗体被用于推荐稀释根据生产的指令。单一的颜色流仪分析使用FACScan(美国加州圣何塞,正欲)。淋巴细胞是封闭的光散射特性,计算阳性细胞的比例相比,消极的控制细胞组成的沾FITC共轭antirat免疫球蛋白。gydF4y2Ba

      淋巴细胞迁移试验gydF4y2Ba

      二十四好Boyden趋化性室(正)是用来测量相比,应对MIP-2淋巴细胞迁移与il - 10,这是IEL对已知的趋化作用。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba上下两院都由一个聚乙烯吡咯烷酮分开自由聚碳酸酯膜与3μm毛孔。IELs和脾细胞(2×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba/ 0.2毫升)从野生型老鼠被放置在上部腔体的RPMI 1640媒体包含10 U /毫升的鼠标- 2重组:0,0.1,1μg /毫升的纯化重组小鼠il - 10(σ)和MIP-2(σ)有或没有10μg /毫升anti-MIP-2抗体(σ)被添加到低。所有的实验都是在重复完成。经过四个小时的潜伏期在37°C,淋巴细胞的数量在众议院。gydF4y2Ba

      分析CXCR-2表达的淋巴细胞gydF4y2Ba

      IELs和lpl从野生型老鼠汇集和单一化异硫氰酸胍盐缓冲溶液和苯酚,然后用氯仿混合,紧随其后的是异丙醇沉淀。互补脱氧核糖核酸合成了RT 42°C 30分钟,从0.5μg使用GeneAmp细胞总RNA的RNA PCR试剂盒(优秀的,Branchburg,新泽西,美国)根据制造商的协议。热循环和热从95°C编程5分钟紧随其后30周期为一分钟95°C,退火在62°C一分钟,随后扩展为一分钟72°C。PCR引物对小鼠CXCR-2 GAPDH如下:CXCR-2意义:5′- ct CCTTGGTGATGCTGGTCA-3′;反义:5′-AGAATTAAGATGGGCAGGGC-3′,导致331个基点PCR产物。GAPDH意义:5′-CTGGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′;反义:5′-CAGGGTTTCTTACTCCTTGG - 3′,产生423个基点PCR产物。rt - pcr产品在1%琼脂糖凝胶电泳用溴化乙锭染色的,是通过紫外线视觉效果。RNA提取整个脾脏被用作积极控制和PCR混合物没有RNA但蒸馏HgydF4y2Ba2gydF4y2BaO作为消极的控制。gydF4y2Ba

      统计分析gydF4y2Ba

      所有数据进行分析通过执行一个跟踪未配对的学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试;p < 0.05被认为是显著的。gydF4y2Ba

      结果gydF4y2Ba

      肠脂肪酸结合蛋白基因诱发MIP-2转录转基因老鼠的上皮细胞gydF4y2Ba

      上皮细胞的特定基因的启动子FabpigydF4y2Ba20.gydF4y2Ba与SV40的互补脱氧核糖核酸MIP-2基因的内含子及其聚腺苷酸化站点(无花果吗gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)。这种DNA构造注入C57BL / 6卵母细胞产生转基因小鼠。两个创始人包含转基因的幼崽被探测基因组DNA从老鼠尾巴SV40聚腺苷酸化序列。从一个创始人兼杂合的F1小鼠繁殖后代基因分型。MIP-2转基因小鼠发育正常,无腹泻,并显示在体重与野生型相比没有显著差异。gydF4y2Ba

      上皮细胞来源于野生型小鼠没有表现出MIP-2信使rna通过北部的屁股(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)和rt - pcr(数据未显示)。然而,这两种方法检测MIP-2成绩单MIP-2肠上皮的转基因小鼠。MIP-2蛋白质存在于上皮细胞的细胞质溶解产物从检查在西方墨迹。再一次,观察生产MIP-2在转基因老鼠而不是野生型小鼠(数据未显示)。gydF4y2Ba

      MIP-2表达式由上皮细胞导致中性粒细胞招募到小型和大肠gydF4y2Ba

      因为MIP-2称为中性粒细胞化学引诱物,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba我们检查是否MIP-2由肠上皮细胞分泌增加中性粒细胞招聘体内。组织学分析表明,MPO积极固有层的中性粒细胞增加MIP-2转基因小鼠(无花果gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。没有隐窝脓肿在野生型或MIP-2转基因小鼠。gydF4y2Ba

      Neutrophil recruitment increases in macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) transgenic mice. (A) Neutrophils in the mid jejunum were stained by myeloperoxidase (MPO) using the Hanker Yates' reaction. Magnification ×100. (B) Neutrophil recruitment is demonstrated by total MPO activity. MPO was extracted with 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide. Total MPO activity is expressed per unit weight of tissue derived from wild-type MIP-2 transgenic mice. Expression of MPO activity as a proportion of unit per weight of whole tissue appeared to be smaller in the small intestine than in the colon due to the heavier weight per unit length of the small intestine. Data are presented as mean (SD) of eight animals for each group. **p<0.01 versus wild-type.      
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2gydF4y2Ba
      Neutrophil recruitment increases in macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) transgenic mice. (A) Neutrophils in the mid jejunum were stained by myeloperoxidase (MPO) using the Hanker Yates' reaction. Magnification ×100. (B) Neutrophil recruitment is demonstrated by total MPO activity. MPO was extracted with 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide. Total MPO activity is expressed per unit weight of tissue derived from wild-type MIP-2 transgenic mice. Expression of MPO activity as a proportion of unit per weight of whole tissue appeared to be smaller in the small intestine than in the colon due to the heavier weight per unit length of the small intestine. Data are presented as mean (SD) of eight animals for each group. **p<0.01 versus wild-type.      
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2gydF4y2Ba
      图2gydF4y2Ba

      招募中性粒细胞增加巨噬细胞炎性蛋白2 (MIP-2)转基因小鼠。(A)中性粒细胞中空肠被髓过氧化酶(MPO)使用彩色渴望耶茨的反应。放大×100。(B)中性粒细胞招募了总MPO活性。MPO提取溴化hexadecyltrimethylammonium为0.5%。总MPO活性表示每单位重量的组织来源于野生型MIP-2转基因小鼠。MPO活性的表达整个组织的每单位重量的比例似乎在小肠结肠小的单位长度重量小肠。数据提出了平均每组(SD)的八个动物。* * p < 0.01与野生型。   gydF4y2Ba

      我们也量化入侵中性粒细胞通过测量MPO活动全厚度肠(无花果gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)。总MPO活性肠的每单位重量显著升高MIP-2转基因小鼠小肠,盲肠和结肠近端(p < 0.01)。总在组织MPO活性并不增加Fabpi启动子活性:MPO的活动远端结肠、肝脏和脾脏的转基因小鼠与野生型小鼠没有明显不同。确认是由于用转基因小鼠中性粒细胞招募MIP-2生产,老鼠接受检查anti-MIP-2抗体和嗜中性粒细胞招聘。中性粒细胞增加进入小肠被anti-MIP-2抗体治疗预防转基因小鼠(无花果gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

      Neutrophil recruitment due to macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) secretion was blocked with an anti-MIP-2 antibody. Anti-MIP-2 antibody was injected intravenously seven days and four days before examining the mice. Neutrophil recruitment was examined by measuring myeloperoxidase (MPO) activity per unit weight of tissue samples derived from wild-type and MIP-2 transgenic mice. Ab (−), mice received phosphate buffered saline only; Ab (+), mice received anti-MIP-2 antibody treatment. Data are presented as mean (SD) of eight animals for each group. **p<0.01.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3gydF4y2Ba
      图3gydF4y2Ba

      中性粒细胞招募由于巨噬细胞炎性蛋白2 (MIP-2)分泌受阻anti-MIP-2抗体。Anti-MIP-2抗体注射静脉注射7天,四天前检查老鼠。中性粒细胞招募了测量髓过氧化酶(MPO)活动每单位重量的组织样本来源于野生型和MIP-2转基因小鼠。Ab(−),老鼠收到磷酸缓冲盐;Ab(+),老鼠接受anti-MIP-2抗体治疗。数据提出了平均每组(SD)的八个动物。* * p < 0.01。gydF4y2Ba

      MIP-2表达式由上皮细胞诱导上皮内和固有层淋巴细胞的增加gydF4y2Ba

      淋巴细胞被染色计数CD3阳性细胞在肠道部分。更多的CD3阳性细胞存在于肠道样本MIP-2转基因小鼠(无花果gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。数字IELs和lpl都显著增加MIP-2转基因小鼠相比,年龄匹配的野生型小鼠(p < 0.01, p < 0.05,分别)(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

      Intraepithelial lymphocyte (IEL) and lamina propria lymphocyte (LPL) numbers were increased in the small intestine of macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) transgenic mice. (A) Lymphocytes were detected with an anti-CD3 Ab (145-2C11). Magnification ×100. (B) IELs were expressed as number of CD3 positive cells in the epithelium per 100 epithelial cells. LPLs were expressed as CD3 positive cells in the lamina propria per mm2. Data are presented as mean (SD) of six animals for each group. *p<0.05, **p<0.01.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4gydF4y2Ba
      Intraepithelial lymphocyte (IEL) and lamina propria lymphocyte (LPL) numbers were increased in the small intestine of macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) transgenic mice. (A) Lymphocytes were detected with an anti-CD3 Ab (145-2C11). Magnification ×100. (B) IELs were expressed as number of CD3 positive cells in the epithelium per 100 epithelial cells. LPLs were expressed as CD3 positive cells in the lamina propria per mm2. Data are presented as mean (SD) of six animals for each group. *p<0.05, **p<0.01.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4gydF4y2Ba
      图4gydF4y2Ba

      上皮内淋巴细胞(IEL)和固有层淋巴细胞(LPL)人数增加小肠的巨噬细胞炎性蛋白2 (MIP-2)转基因小鼠。(一)淋巴细胞检测到一个anti-CD3 Ab (145 - 2 - c11)。放大×100。(B) IELs CD3阳性细胞数目表示在每100上皮细胞上皮。lpl表达CD3阳性细胞在固有层每毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。数据提出了平均每组(SD)的六个动物。* * * p < 0.05, p < 0.01。gydF4y2Ba

      因为渗透IELs和lpl MIP-2转基因小鼠中,我们检查了TCR这些淋巴细胞各亚群使用FACScan(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。MIP-2转基因小鼠的分组人口TCR-αβIELs显著增加(p < 0.05)。尽管没有显著增加TCR-αβ阳性细胞在lpl的分组人口TCR-γδlpl的阳性细胞明显减少(p < 0.05)。gydF4y2Ba

      把这个表:gydF4y2Ba
      表1gydF4y2Ba

      T细胞受体(TCR) -αβ阳性T细胞渗透入粘膜MIP-2转基因小鼠gydF4y2Ba

      MIP-2 CHEMOATTRACTS黏膜淋巴细胞体外gydF4y2Ba

      以确定MIP-2诱导淋巴细胞浸润,迁移试验进行了体外。老鼠的反应IELs和脾细胞il - 10(作为一个积极的控制)与人类淋巴细胞中观察到。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba大约4×10gydF4y2Ba4gydF4y2BaIELs和脾细胞迁移到一个较低的自发室。然而,这种双重的增加1μg /毫升MIP-2(无花果gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。IELs和脾细胞的迁移反应MIP-2和il - 10依赖于细胞因子浓度。Anti-MIP-2抗体阻止IEL MIP-2和脾细胞迁移反应。gydF4y2Ba

      Macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) attracts lymphocytes, including intraepithelial lymphocytes (IEL) in vitro. Lymphocyte migration in response to interleukin 10 (IL-10) and MIP-2 in the absence or presence of anti-MIP-2 antibody (MIP-2/Ab) was studied using the Boyden chamber. Lymphocytes (2×105/0.2 ml) were placed in the upper chambers, and migrated cells were counted after four hours of incubation at 37°C. Each experiment was done in duplicate. Data are presented as mean (SEM) of six animals for each group. Significant differences were evaluated in assays between supernatants with or without anti-MIP-2 antibody. **p<0.01.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5gydF4y2Ba
      图5gydF4y2Ba

      巨噬细胞炎性蛋白2 (MIP-2)吸引了淋巴细胞,包括上皮内淋巴细胞(IEL)体外。淋巴细胞迁移在回应白介素10 (il - 10)和MIP-2没有或存在anti-MIP-2抗体(MIP-2 / Ab)使用Boyden室进行了研究。淋巴细胞(2×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba/ 0.2毫升)被放置在上面的房间,和迁移细胞数在四小时的潜伏期在37°C。每个实验做了一式两份。数据提出了平均(SEM)每组六个动物。上层清液之间的显著差异进行评估在化验有或没有anti-MIP-2抗体。* * p < 0.01。gydF4y2Ba

      因为粘膜淋巴细胞体外MIP-2所吸引,我们检查了MIP-2受体的表达,rt - pcr CXCR-2,这些细胞。CXCR-2 mRNA在IELs证实和lpl表达在IELs CXCR-2相对高于在lpl(无花果gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

      Analysis of CXCR-2 expression on lymphocytes from wild-type mice. Agarose gel stained with ethidium bromide showing reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) products for CXCR-2 (331 bp) and GAPDH (423 bp). Expression of CXCR-2 and GAPDH mRNA was confirmed in intraepithelial lymphocytes (IEL) and lamina propria lymphocytes (LPL) isolated from wild-type mice. RNA extracted from whole spleen was used as a positive control and PCR mixture without RNA but distilled H2O was used as a negative control. Representative of three independent experiments.
      " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6gydF4y2Ba
      图6gydF4y2Ba

      分析CXCR-2表达野生型小鼠的淋巴细胞。琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色显示逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),产品CXCR-2(331个基点)和GAPDH(423个基点)。CXCR-2和GAPDH mRNA的表达在上皮内淋巴细胞(IEL)和确认固有层淋巴细胞(LPL)与野生型老鼠。RNA提取整个脾脏被用作积极控制和PCR混合物没有RNA但蒸馏HgydF4y2Ba2gydF4y2BaO作为消极的控制。代表三个独立的实验。gydF4y2Ba

      讨论gydF4y2Ba

      肠上皮细胞的主要功能是吸收营养,同时提供一个外部世界的物理和免疫障碍。然而,上皮细胞与肠道环境直接接触,产生多种趋化因子的影响腔的内容,包括细菌,细菌的产品,和化学刺激。gydF4y2Ba6尺11寸gydF4y2Ba这些发现表明,肠道上皮细胞可能积极改变粘膜免疫反应。先前的实验肺显示中性粒细胞被趋化因子,可能发布的上皮细胞使用外部刺激,α-quartz。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba尽管小心实验证明通过阻断趋化因子特异性抗体,这些实验不排除这种可能性,同样的外部刺激也激活non-epithelial细胞组织。gydF4y2Ba

      因此我们建立了转基因小鼠的上皮细胞分泌MIP-2通过上皮细胞特定的启动子,Fabpi。因为这只在上皮细胞启动子是活跃的,gydF4y2Ba20 - 22gydF4y2Ba这项技术允许我们直接检查上皮细胞的影响。在这项研究中,我们表明,趋化因子表达式从肠道上皮细胞改变了体内粘膜免疫系统。中性粒细胞入侵到固有层在MIP-2显著增加转基因小鼠与野生型小鼠相比。中性粒细胞的增加是在小肠和结肠近端大于远端结肠或直肠。此观察对应的已知活动Fabpi启动子,我们用于调节表达MIP-2转基因老鼠。gydF4y2Ba20.gydF4y2BaFabpi启动子是最强的小肠上皮细胞,成为弱从近端到远端结肠;中性粒细胞招募的分布与这个表达式。同样,在转基因小鼠的肝脏和脾脏MPO活动(Fabpi启动子活性)没有显著不同于野生型老鼠。我们还证明了增加中性粒细胞浸润了小肠被anti-MIP-2抗体(无花果gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。这证明了增加中性粒细胞浸润到MIP-2转基因小鼠的小肠直接由于MIP-2无关的,而不是一个建立的转基因小鼠的影响。gydF4y2Ba

      MPO活性的比较是有效的在比较野生型和转基因动物肠道的同一区域。然而,它不可能推断中性粒细胞招募从每重量MPO活性变化的组织之间的不同部分小肠。这是因为大量的浆膜组织不同部分之间存在着很大的差别。小肠上部的重量单位长度远远大于大肠。此外,不同制剂的大肠保存不同数量的浆膜组织单位长度。因此差异比较时出现整个大肠与个别段。gydF4y2Ba

      增加IEL数量发生在疾病状态,包括腹腔疾病和奶牛的牛奶敏感肠病。gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba许多因素可以调节IEL数量,包括αgydF4y2BaEgydF4y2BaβgydF4y2Ba7gydF4y2Ba淋巴细胞表面表达和MAdCAM-1表达内皮细胞。gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba体外研究显示人类IELs被各种细胞因子,吸引了包括il - 10和趋化因子引发,咆哮,MCP-1, MIP-1。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba目前的研究表明,MIP-2吸引淋巴细胞,尤其是TCR-αβ阳性细胞,肠道粘膜。因为大多数TCR-αβ周边T细胞,我们怀疑这些从外周血T细胞迁移,而不是在肠上皮细胞增殖。我们证实了体外MIP-2黏膜淋巴细胞趋化现象的,因为它增加了人口的IELs Boyden室以剂量依赖的方式。这样不仅可以通过趋化因子的分泌上皮细胞编排中性粒细胞入侵还可以调节淋巴细胞的数量。唯一受体在鼠标交互的描述到目前为止MIP-2 CXCR-2。这种受体的表达被rt - pcr证实IELs和lpl(无花果gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。有趣的是,CXCR-2 mRNA的表达比lpl在IELs相对较高。最近的一项研究表明,干扰素γ维护CXCR-2淋巴细胞上的表达。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba干扰素γ可能影响淋巴细胞在上皮车厢比固有层,导致更高的CXCR-2 mRNA表达IELs(无花果gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

      这些实验是为了测试假设上皮细胞基因表达显著影响粘膜免疫系统。工作不是为了检查时的炎症性肠病模型可以从无限制的开发由上皮细胞趋化因子的分泌。上皮细胞可能发挥作用在一代的炎症在这样的条件下,它是唯一重要的细胞似乎不太可能在其启动。组织炎症性肠病的改造是一个重要的组成部分。这种变化是引起的因素,包括转化生长因子β,肿瘤坏死因子α,基质金属蛋白酶。没有直接试图改变这些蛋白的表达。理论上招募白细胞可以间接地改变这些蛋白质的浓度但没有显著的T细胞激活这些影响会小。gydF4y2Ba

      在这个报告中描述的转基因小鼠表现出嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润黏膜由于一个单一的上皮细胞所表达的趋化因子。小鼠没有表现出症状,腹泻或减肥。我们不会期望一个趋化因子的分泌上皮足以导致病状态。在炎症,许多不同的趋化因子表达的肠上皮细胞刺激后在不同的时间。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba这种现象会增加白血球信号的复杂性。然而,本文第一次表明体内分泌的趋化因子通过直接改变了粘膜上皮细胞的免疫系统。在小肠上皮细胞可以调节炎症细胞对刺激做出反应,可能从肠内腔分泌趋化因子。gydF4y2Ba

      确认gydF4y2Ba

      我们感谢Drs e·施密特和P分类账JvSV质粒;J博士戈登Fabpi启动子;博士和卵母细胞注射的导体。我们感谢TT麦克唐纳教授他的评论手稿。这项工作得到了国家卫生研究院的资助后:AI43472, DK47753, DK43351, DK40561;圣巴塞洛缪医院联合研究委员会,伦敦,英国;Uehara纪念基金会,东京,日本;和医学研究委员会。gydF4y2Ba

      略语gydF4y2Ba

      CMF-HBSSgydF4y2Ba
      CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba/毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba免费汉克斯平衡盐溶液gydF4y2Ba
      FabpigydF4y2Ba
      肠脂肪酸结合蛋白gydF4y2Ba
      IELgydF4y2Ba
      上皮内淋巴细胞gydF4y2Ba
      伊尔gydF4y2Ba
      白介素gydF4y2Ba
      LPLgydF4y2Ba
      固有层淋巴细胞gydF4y2Ba
      有限合伙人gydF4y2Ba
      脂多糖gydF4y2Ba
      MIP-2gydF4y2Ba
      巨噬细胞炎性蛋白- 2gydF4y2Ba
      MPOgydF4y2Ba
      髓过氧物酶gydF4y2Ba
      rt - pcrgydF4y2Ba
      逆转录-聚合酶链反应gydF4y2Ba
      细胞受体gydF4y2Ba
      T细胞受体gydF4y2Ba

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