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背景克罗恩病(CD)是一种原因不明的慢性炎性肠道疾病复发。它的特点是慢性影响的任何部分小肠粘膜溃疡但通常被发现在回肠和结肠近端。
的目标是研究开展提供信息关于特定细胞粘蛋白基因的表达在CD患者回肠。
患者和方法粘蛋白基因的表达分析患者回肠黏膜的CD和控制通过原位杂交和免疫组织化学。
结果在健康回肠粘膜,CD患者显示模式与主要的表达与正常对照组相同MUC2和MUC3,较小的表达MUC1和MUC4,没有表达MUC5AC,MUC5B,MUC6,或MUC7。涉及粘膜的模式有点类似虽然异构观察健康回肠粘膜。重要的是,一个特定的粘蛋白基因表达模式是在回肠黏膜溃疡边缘附近观察溃疡相关的细胞谱系,外观MUC5AC和MUC6mrna和肽通常局限于胃(MUC5AC和MUC6)和十二指肠(MUC6),然后消失MUC2。
结论我们的研究结果表明,凝胶形成黏蛋白(尤其是MUC5AC和MUC6)可能在上皮黏膜受伤后伤口愈合作用和炎症性肠病除了粘膜保护。
- 黏蛋白
- 民大基因
- 克罗恩氏病
- 溃疡相关的细胞谱系
略语
- CD
- 克罗恩氏病
- UACL
- 溃疡相关的细胞谱系
- TFF
- 三叶草的因素
- vWF
- 血管性血友病因子
来自Altmetric.com的统计
克罗恩病(CD)是一种原因不明的慢性炎性肠道疾病复发。它的特点是慢性影响的任何部分小肠粘膜溃疡但通常被发现在回肠和结肠近端。1肠道上皮覆盖着一层连续的粘液,它提供了一个物理屏障之间的底层上皮和积极代理存在于胃肠道腔。2主要是由于其组成粘蛋白粘液属性O糖蛋白具有高密度和粘弹性。
迄今为止,八个人类上皮粘蛋白基因的特征:MUC1- - - - - -4,MUC5AC,MUC5B,MUC6- - - - - -7。3,4额外的部分提出了互补MUC8,5MUC9,6MUC11,MUC12。7已经取得了很大进展最近在我们对这些基因的结构的理解,让他们的产品分类分为两类:膜锚定黏蛋白和分泌黏蛋白。膜固定黏蛋白由小粘蛋白MUC1和两个大的黏蛋白MUC3 MUC4。分泌黏蛋白由小粘蛋白MUC7和大型凝胶形成黏蛋白MUC2, MUC5AC、MUC5B, MUC6集群p15.5 11号染色体上的基因。黏蛋白广泛表达于胃肠道在一个高度组织和细胞特定的方式。8
定量和定性的变化黏蛋白和炎症性肠病的一个特性可能导致受损粘膜的完整性。大部分的定性变化相关文献中报道改变黏蛋白的糖基化的部分。是不为人熟知的各种粘蛋白基因产物。9在之前的报告中,使用定量点污点分析,我们表明,粘蛋白基因的表达是异构在CD患者中,有轻微下降表达水平在健康和回肠粘膜。10目的是提供进一步的信息关于管制CD的粘蛋白基因的表达,我们用原位杂交和免疫组织化学研究的表达MUC1-4,MUC5AC,MUC5B,MUC6-7患者回肠黏膜的CD和表明,粘蛋白基因(尤其是粘蛋白基因的11个p15家庭)显示不正常粘膜中的表达模式接近溃疡。黏蛋白的潜在作用粘膜愈合除了粘膜保护进行了探讨。
患者和方法
病人和协议
11个患者光盘(CD 1 - 11)(七个雌性,雄性4个;平均年龄29岁,范围18 - 67)对粘蛋白基因表达进行了评估。使用定义的标准CD的诊断成立。11患者纯回肠参与或ileocolonic CD。他们接受手术,因为症状性狭窄,脓肿瘘或医学治疗失败。在手术过程中,一个ileoscopy系统执行评估宏观和组织学检查回肠黏膜的完整性30厘米以上未来吻合,如前所述。12回肠活检系统在10厘米,30厘米以上未来吻合。样本也在宏观上从手术标本获得正常粘膜和病变。完成这项研究,从手术标本中获取额外的样本来自8个病人12 - 19 (CD)(六个女性,两个男性;平均年龄31岁,范围20-53)在附近粘膜溃疡的利润率。
控制、回肠活检标本被从14个病人(CT 1 - 14)(11个女性,三个男性;平均年龄38岁,范围17-60)接受了肠易激疾病内镜。没有发现这些患者的内镜病变。
所有患者知情同意了伦理委员会的批准。
组织
样本立即沉浸在4%多聚甲醛在磷酸缓冲或10%甲醛至少6日到24日小时根据样本容量和进一步嵌在石蜡。部分(3μm厚)切割和安装在胶覆盖幻灯片进行原位杂交分析。串行部分是安装在silan覆盖幻灯片免疫组织化学和组织学分析。部分是经常沾haematoxylin-eosin-saffron和阿斯特拉蓝色或三色的第一次组织学分析。
组织学研究
部分是沾haematoxylin-eosin和May-Grunwald-Giemsa组织学研究。活检是得分为炎性病变的存在在一个标准化的方式,如前所述。10,13这一点包括炎症变化的特点等的强度在固有层单核和多形核细胞浸润,炎症细胞和上皮细胞之间的相互作用(cryptitis,隐窝脓肿)、上皮细胞损伤的特点和结构变化。此外,杯状细胞增生(多)和粘液增加内容记录作为礼物或缺席。炎症的强度变化相应评分从1到13,分别缺席和严重的炎性变化。
原位杂交
杂交过程
杂交步骤如前所述。14短暂、组织部分deparaffinised,水化,孵化2μg /毫升蛋白酶K(罗氏诊断、Meylan、法国)15分钟,再固定在4%多聚甲醛在磷酸缓冲盐15分钟。部分被沉浸在0.1三乙醇胺(σ,L 'Isle d 'Abeau Chesnes,法国)含0.25%乙酸酐10分钟。部分在4×prehybridised SSPE, 1×Denhardt 45分钟的缓冲和杂交一夜之间在20 - 100 42°Cμl 4×SSPE的解决方案包含50%的甲酰胺(v / v) 0.1%N-lauroylsarcosine (w / v), 1.2米磷酸钠(pH值7.2),1×Denhardt的缓冲区,酵母tRNA 3毫克/毫升、二硫苏糖醇20毫米,7.5×103金刚石/μl35标记寡核苷酸。post-hybridisation洗之后,幻灯片蘸LM-1乳液(Amersham, Les乌里,法国),接触了1 - 3周后,复染色和甲基绿pyronin(σ)。
以下控件进行:(i)竞争的研究治疗组织部分大量过剩的未标记的寡核苷酸相同或不同的35年代标记探针;(2)验证没有背景的仔细检查non-epithelial结构(血管、肌肉和结缔组织);和(3)组织从CD患者和对照组在相同条件下并行测试。
得分
杂交信号的强度是半定量的得分为:−,缺席;+,弱(可见放大×200);+ +,温和(可见放大×100);+ + +,强(可见放大×40);+ + + +,很强(宏观上可见)。
免疫组织化学
染色过程
染色过程进行了使用一个自动化的应用(ES, Ventana医疗系统,斯特拉斯堡,法国)和三个步骤间接过程基于biotin-streptavidin-peroxidase方法。微波预处理后柠檬酸缓冲(pH值6.0)两个10分钟周期,组织部分孵化了四分钟用新鲜甲醇阻断内源性过氧化物酶、过氧化氢3%和32分钟正常山羊血清中磷酸缓冲盐阻止非特异性结合位点。部分被孵化与主要抗体32分钟37°C。抗体被用于稀释MUC2的1/1000,MUC5AC、和MUC5B MUC6的1/250。与生物素化的二次洗涤后,部分被孵化山羊antirabbit兔多克隆抗体或抗体antimouse抗体单克隆抗体的八分钟37°C,与streptavidin-peroxidase共轭八分钟37°C,然后用diaminobenzidine发达(σ)0.03%的过氧化氢。部分被经常用苏木精复染色。
以下控件进行:消极的控制:(i)幻灯片没有主要的抗体;(2)仔细检查non-epithelial结构(血管、肌肉和结缔组织);积极的控制:包含已知的正常组织表达MUC2(小肠)、MUC5AC(支气管),MUC5B(支气管),和MUC6(腔)在每个自动运行。9,14,19
结果
组织学研究
控制
所有内镜活检在宏观上进行健康回肠粘膜组织学上正常控制的得分(0/13)。
CD患者
回肠活检获得的宏观上未受影响的地区从CD患者正常(分数0/13),除了一位病人(CD 7)与中度炎症(分数4/13)。相对增加表面杯状细胞的数量(增生)或粘液含量的增加不明显在这些活检。
从回肠病变活检获得患者的CD,意思是组合结构和炎症评分高(10/13,范围7 - 13)。溃疡的病变主要由相邻的粘膜炎症的显示特征与温和上皮损伤和结构变化。杯状细胞增生4例指出。此外,溃疡相关的细胞谱系(UACL)中观察到的两种情况(n = 2/11)。UACL也指出在四个样本(n = 4/8)附近粘膜溃疡。UACL一直以赖特和同事20.作为一个特定的解剖结构出现在靠近溃烂。组织学检查UACL可以分为三个部分:腺泡的部分,这源于相邻肠隐窝的基地;管,来自这些腺泡和成长的核心一个相邻的绒毛;通过导管和表层细胞迁移和取代土著血统。20.,21
粘蛋白基因表达
原位杂交粘蛋白基因mrna在克罗恩病的患者回肠粘膜。(A, B)原位杂交MUC2 (A)和MUC3 (B) mrna在回肠黏膜健康。MUC2探针(A),标签是强烈的杯状细胞和位于细胞核周围的地区都在绒毛和隐窝而在MUC3探针(B),标签是中等强度和位于高脚杯,吸收细胞绒毛(放大×200)。(汉英)原位杂交MUC2 (C), MUC3 (D)和MUC4 (E) mrna在涉及回肠粘膜显示标签在一个给定的样本的异质性(放大(C)×200 (D和E)×100)。(岗)原位杂交MUC6 (F)、MUC5AC(胃肠道),MUC2 (J, K), MUC4 (L), MUC3 (M, N)和MUC1 (O) mrna在回肠粘膜毗邻溃疡溃疡相关的细胞谱系(UACL)。(F) MUC6 mRNA在新形成的腺泡的腺体的谱系。观察(胃肠道)MUC5AC mRNA的上部导管的上皮细胞,最终开发新腺体上皮细胞,达到并迁移到支架表面绒毛表面的35年代贴上MUC5AC探针(G, I)而缺席的杂交信号35年代贴上MUC5AC探测器和一个大超过未标记的MUC5AC探针(H)(负控制)。(J, K) MUC2信使rna中没有检测到腺泡的表面(J)或细胞(K)的新血统而强烈的信号在周围的杯状细胞。(左)与MUC4观察微弱信号探测和导管上皮细胞的表面。(M, N)观察微弱信号的上皮细胞表面的管道35年代贴上MUC3探针(M)而缺席的杂交信号35年代贴上MUC3探测器和一个大超过未标记的MUC3探针(N)(负控制)。(O) MUC1的观察微弱信号探测的上皮细胞UACL(放大(f i、k - n)×200 (J)×100 (O)×400;所有的部分都与甲基绿pyronin复染色)。
免疫组织化学粘蛋白基因相关肽在回肠黏膜的节段性回肠炎患者。(A)涉及回肠粘膜相邻溃疡沾haematoxylin-eosin-saffron和阿斯特拉蓝色显示UACL(放大×100)。(B-G)免疫组织化学MUC6 (B)、MUC5AC (C、F), MUC5B (D)和MUC2 (E, G)在溃疡相关的细胞谱系(UACL)。(B) MUC6肽观察腺泡的细胞而(C、F) MUC5AC出现在表面细胞;整个UACL MUC5B肽观察;(E, G) MUC2肽没有检测腺泡的(E)或表面细胞(G)的新血统而强劲染色观察周围的杯状细胞(放大(B)×400(汉英)×100 (F, G)×250;所有的部分都与苏木精复染色)。
正常对照组
正如所料,MUC2和MUC3是主要的粘蛋白基因表达在正常回肠粘膜。MUC2mrna和肽检测在杯状细胞和绒毛都Lieberkuhn的隐窝。MUC3mrna高脚杯和吸收细胞中发现了一个很大的优势在绒毛上。此外,MUC1和MUC4mrna经常被发现在正常回肠黏膜的标签是软弱和异构的上皮隐窝的优势。MUC5AC,MUC5B,MUC6,MUC7没有检测到正常的回肠粘膜。
CD患者
健康的回肠粘膜
在健康患者回肠粘膜CD,杂交模式在正常对照组与观察,与主要的表达MUC2和MUC3,较小的表达MUC1和MUC4,没有表达MUC5AC,MUC5B,MUC6,或MUC7(图1A、B)。
涉及回肠粘膜
在涉及患者回肠黏膜的CD,杂交模式有点类似与观察相同的病人或健康回肠粘膜正常粘膜的控制,无论炎症状态,与主要的表达MUC2和MUC3和较小的表达MUC1和MUC4。然而,标签是异构的分布和强度在给定样本无论调查,减少或增加信号的强度取决于区域检查(图1一部)。
此外,特定的杂交模式在UACL附近粘膜溃疡,出现MUC5AC,MUC5B,MUC6mrna和缩氨酸和消失MUC2。MUC6mrna和肽腺泡的细胞中观察到的新血统起源于隐窝附近溃疡和下方的管道因这些腺泡(无花果1F,2一个,2B)。MUC5ACmrna和肽观察本质上表面的上皮细胞和导管的上部(无花果1胃肠道、2 c, 2 f)。MUC5B信使rna和肽只是偶尔发现UACL(无花果2相比之下,D)。MUC2mrna和肽没有检测到UACL而观察一个强烈的信号在周围粘膜内杯状细胞(无花果1J,1K,2E,2G)。
MUC4信使rna检测表面和管细胞而不是腺泡的细胞(图1L)。MUC3观察mrna在所有上皮细胞的谱系虽然最强烈的信号是局限于表面和上管细胞(图1米,1N)弱的mRNA的表达MUC1也被发现在整个UACL(图1O)。
重叠MUC6和MUC5AC杂交模式的某些部分导管。一个信号也被检测到的MUC1,MUC3,MUC4,MUC5B探测器在同一管细胞。
MUC7不涉及回肠黏膜的CD患者中发现通过原位杂交。
讨论
我们使用原位杂交和免疫组织化学分析粘蛋白基因的表达在回肠19 CD患者。据我们所知,唯一的其他研究描述特定细胞粘蛋白基因的表达在CD是由维斯和他的同事们22他分析了MUC2和MUC3mRNA表达七个病人和报道中的肠道粘膜正常杂交模式不管或静止炎症粘膜表现活跃。
在这项研究中,我们发现患者的健康回肠粘膜CD显示正常杂交模式与主要的表达MUC2和MUC3,MUC2杯状细胞中表达在绒毛在隐窝,和MUC3杯状和绒毛吸收细胞本质上。MUC1和MUC4只是偶尔发现在正常和健康的回肠粘膜,可能由于样本的位置(近端或远端)沿着回肠,正如前面提出的。23的确,MUC1和MUC4不是在小肠,除了回肠和结肠,和十二指肠布鲁尼尔腺MUC1只有。MUC5AC,MUC5B,MUC6,MUC7没有检测到正常或健康的回肠粘膜。这些发现符合之前的报道在小肠粘蛋白基因表达。14,19,22 - 24
患者参与回肠黏膜的CD,虽然这种杂交模式是比得上观察健康回肠粘膜和正常对照组与主要的表达MUC2和MUC3和较小的表达MUC1和MUC4,标签是异构的分布和强度取决于研究的领域。这种异质性可能反映出典型的细胞学变化,伴随CD。25,26
更有趣的是,我们表明,至少有六个粘蛋白基因,MUC1,MUC3,MUC4,MUC5AC,MUC5B,MUC6附近,被表达在回肠粘膜溃疡在所谓UACL。这血统中可以看到所有的疾病与慢性胃肠道粘膜溃疡但最常见的是发现在小肠在CD和十二指肠溃疡疾病。在小肠,它生长的基础从隐窝附近溃疡和固有层中都形成一个新的腺,最后导致导管的腺体分泌物进行表面。从导管上皮细胞继续迁移到恢复上皮绒毛表面。20.因此虽然这血统一直被视为“幽门”或“布鲁尼尔腺化生基于形态学标准及组织化学,这是现在被广泛接受的UACL是一个独特的细胞谱系新创和不是化生。UACL分泌大量的中性黏蛋白与肠道杯状细胞,分泌酸性黏蛋白。20.我们表明,UACL表达MUC1mrna,证实了以前的发现免疫组化染色对粘蛋白的不同部分使用抗体提高核心蛋白质(SM3、HMFG1和HMFG2)。20.UACL还表示MUC3和MUC4大型膜锚定黏蛋白mrna编码。
的染色体11 p15粘蛋白凝胶形成分泌黏蛋白基因编码,MUC5AC,MUC6,并在较小程度上MUC5Bmrna和肽不表达在正常成人回肠UACL而异常表达MUC2这是一个主要粘蛋白基因表达在正常肠UACL并不表示。这些发现说明一个可能的作用至少MUC5AC MUC6在伤口愈合后慢性粘膜溃疡。此外,UACL是区分细胞谱系20.,27和上皮细胞显示不同的粘蛋白基因的表达模式根据他们的家族内的位置。MUC5AC表达在上皮细胞表面和上部的管道而MUC6表达在上皮细胞的腺泡的腺体和更深层次的管道的一部分。在正常的胃肠道,MUC5AC和MUC6是主要的成人胃粘蛋白基因表达,在哪里MUC5AC表达在上皮细胞表面和坑吗MUC6表示在颈部粘液细胞和贲门的和窦的腺体。14,19,28MUC6也广泛表达于十二指肠布鲁尼尔腺。19此外,MUC5AC暂时表达在胚胎和胎儿肠。23MUC5AC也表达了MUC6和MUC5B前上皮在胚胎和胎儿胃和十二指肠,cytodifferentiation。19,24,29日粘蛋白基因的表达模式在UACL因此非常类似于观察成人胃和十二指肠,但更像发展中胃和十二指肠,确认之前的组织化学研究。30.我们的结果强化了这一观念:UACL重申Brunner腺分化计划和获得胃腺的增生性组织。27一个杂交模式之间的重叠MUC1,MUC3,MUC4,MUC5AC,MUC5B,MUC6可以观察到在某些部分的导管,最有可能对应于增殖区。27
除了黏蛋白,UACL表达一些生长因子如表皮生长因子。20.UACL也表达转录本编码三个三叶草因素(tff) TFF1 (pS2), TFF2(解痉药肽)和TFF3(肠道三叶草的因素)。21,27,31日,32三叶草的因素是小半胱氨酸丰富蛋白质和三个分子内二硫键构成TFF域。33,34这些肽表达的优先胃肠道粘蛋白表达细胞,随后,黏蛋白,黏液层的成分。三叶草的因素与11 p15基因显示惊人的相似粘蛋白基因表达模式在胃肠道。35-37这是在最近的一项研究证实由朗曼和他的同事们38显示co-expression TFF1和MUC5AC在胃里,co-expression TFF2和MUC6在胃和十二指肠,co-expression TFF3和MUC2的小肠和结肠。同一作者表明co-expression TFF1和MUC5AC和TFF2 MUC6留在UACL CD。MUC2,MUC5AC,MUC5B,MUC6集群p15.5 11号染色体上。39同样地,三个人类三叶草肽基因TFF1,TFF2,TFF321号染色体q22.3集群。40个人相似的表达模式民大和TFF基因显示两个集群的协调监管胃肠道上皮细胞。
三叶草因素的生物活性在粘膜保护和修复已经建立在体外和体内研究。33,34然而,他们调解功能的机制尚不清楚。虽然除了层的结肠上皮细胞系tff或黏蛋白单独提供保护,tff和黏蛋白提供了更好的保护。41事实上,三叶草因素增加净化粘蛋白制剂的粘度、粘膜保护增加黏蛋白的性质,TFF2和黏蛋白相互作用抑制质子通过黏液层渗透。42此外,tff组合和黏蛋白促进受伤的单层上皮的赔偿。43因此参数积累有利于合作的作用的凝胶形成黏蛋白和三叶草因素粘膜保护和上皮伤口愈合。
所有黏蛋白的特点是一个大型的中央地区组成的衔接着重复图案丰富的丝氨酸和苏氨酸残基(潜在的高度O糖基化的)。在凝胶形成黏蛋白,这个地区是在半胱氨酸富域类似于D, B, C,和CK(胱氨酸结)域的pro-von血友病因子(vWF)。D和CK域被认为是重要的二聚体和低聚物的形成。44最近,Tomasetto和他的同事们45展示了小鼠TFF1之间的直接交互和小鼠凝胶形成黏蛋白Muc2和Muc5ac通过两个vWF-like C域。因此,诱人的猜测每个粘蛋白是与一个特定的TFF。在这种背景下,胃肠道,TFF1可能主要与MUC5AC, TFF2 MUC6, TFF3 MUC2。支持这一假说,体外TFF3与胃黏液糖蛋白(主要组件对应于MUC5AC和MUC6)已被证明是更有效的比有结肠黏液(基本上由MUC2糖蛋白)。41然而,vWF-like C域缺乏MUC6的羧基末端区,46表明附加黏蛋白的序列可能与三叶草因素或MUC6不与三叶草互动因素。
总之,我们已经表明,11 p15粘蛋白凝胶形成黏蛋白基因编码显示异常表达模式在CD患者回肠黏膜溃疡附近,与外表的MUC5AC,MUC6,MUC5B,消失MUC2。我们的研究表明,凝胶形成黏蛋白(尤其是MUC5AC和MUC6)可能在上皮黏膜受伤后伤口愈合作用和炎症性肠病除了粘膜保护和与三叶草因素可能造成上皮归还。
确认
这项工作是支持由“协会倒说是关于癌症”,“Ligue靠le癌症”,“F Aupetit基金会”,欧盟财团”采取协调一致的行动:黏蛋白在支气管的炎症性疾病的病理生理学和胃肠道上皮细胞”。我们感谢我Carlstedt博士伦德古都,瑞典,提供MUC2, MUC5AC、MUC5B抗体,和L教授大卫,研究院Patologia e Immunologia分子达大学波尔图,葡萄牙,提供MUC6单克隆抗体。我们感谢伊丽莎白Deschodt和玛丽上帝优秀的技术援助。
略语
- CD
- 克罗恩氏病
- UACL
- 溃疡相关的细胞谱系
- TFF
- 三叶草的因素
- vWF
- 血管性血友病因子