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肝脏疾病
识别的新颖的分子和致病通路在原发性胆汁性肝硬化:互补脱氧核糖核酸基因差异表达分析肝内数组
免费的
  1. N个Shackel,
  2. P H麦吉尼斯,
  3. C一个雅培,
  4. M D戈雷尔,
  5. G W麦考汉
  1. 哦明天胃肠病学和肝脏中心纪念癌症医学和细胞生物学研究所皇家王子阿尔弗雷德医院和悉尼大学,澳大利亚悉尼
  1. 教授G麦考汉,纪念癌症医学和细胞生物学研究所锁袋没有6,新城,新南威尔士州,2042年,澳大利亚g.mccaughan在{}centenary.usyd.edu.au

文摘

背景原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种自身免疫性疾病,进步的肝损伤的发病机制了解甚少。

目的为中国人民银行相关的发病机制提供新的见解肝损伤使用cDNA数组分析,同时检查许多基因的表达。

方法利用cDNA数组的874个基因,中国人民银行与原发性硬化性胆管炎(PSC)相关的肝硬化和十几肝脏。10基因的差异表达实时定量证实了反向transcriptase-polymerase连锁反应(rt - pcr)。

结果数组分析确定了许多差异表达基因,是重要的炎症,纤维化增生,信号、细胞凋亡和氧化应激。中国人民银行是与表达增加有关Th1、Th2型免疫反应的分子。纤维化相关基因表达特点upregulation结缔组织生长因子和转化生长因子beta3。表现出更多的细胞凋亡相关分子表达增加,符合凋亡作为一个更积极的和管理的过程,在PSC比中国人民银行相关的肝硬化。许多基因的表达增加Wnt和notch通路与这些高度保守的途径在PBC发病机制有关。c-jun的观察增加表达,原癌基因,c-fos相关抗原1在中国人民银行与Wnt通路活动增加相一致。Wnt通路的四个组件的微分表达式,Wnt-5a, Wnt-13,弗里茨,β-连环蛋白定量rt - pcr证实了。

结论许多基因与肝内炎症、纤维化和肝硬化再生调节在中国人民银行。特别是,增加大量的表达式果蝇同系物是中国人民银行。

  • 原发性硬化性胆管炎
  • 细胞凋亡
  • 纤维化
  • 结缔组织生长因子
  • Wnt
  • Th1 / Th2
  • 脑衍生神经营养因子
  • 切口

http://dx.doi.org/10.1136/gut.49.4.565

来自Altmetric.com的统计

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    发病的原发性胆汁性肝硬化(PBC)包括免疫介导的损伤胆管和线粒体抗原的特点是多种自身抗体(antimitochrondrial抗体(AMA))。1 - 3调查中国人民银行集中的发病机制主要是线粒体抗原,3AMA描述,2和胆管周围免疫渗透的性质。1胆道上皮的目标可能是由于线粒体的异常表达抗原胆道支架表面的上皮细胞。4异常的线粒体抗原表达被认为导致击穿公差导致免疫介导肝损伤。3另一种假设,中国人民银行的结果免疫反应启动由于传染病正在调查中。5

    在中国人民银行、胆道上皮损伤和进步的肝损伤导致肝硬化似乎主要是由于细胞介导的免疫反应。单核细胞CD4渗透在中国人民银行的特点是激活的+和CD8+T淋巴细胞主要Th1反应。6 - 9然而,我们观察到肝内upregulation白介素2 (IL)但不是干扰素(IFN) -γ在中国人民银行,这意味着中国人民银行并不普遍符合Th1范式。10

    大多数病人的T细胞识别纯化oxo-acid脱氢酶线粒体多酶的复杂的抗原11但这些抗原的自身抗体的作用是有争议的。2,12有证据表明“分子拟态”13交叉反应抗原是免疫反应引起的最初的目标微生物。14存在交叉反应抗原可能是考虑到AMA的滴定度2和T细胞反应15,16线粒体抗原并不总是与疾病严重程度甚至是疾病的存在。绑定的AMA纯化胆道上皮细胞明显不同各种暗示有多种上皮抗原的抗体与抗原决定基交叉反应性。17,18

    中国人民银行的免疫反应导致进步胆管损伤和组织纤维化。许多纤维介质造成的中国人民银行可能出现胆道上皮细胞与纤维发生的释放生长因子如表皮生长因子(EGF)、碱性纤维母细胞生长因子(FGF)、转化生长因子β(TGF),和血小板衍生生长因子(PDGF)。19,20.这些纤维介质导致活化的肝星状细胞(HSC)释放基本FGF,肝细胞生长因子(HGF),及护。自分泌与PDGF刺激HSC激活,基本FGF,和鉴定及刺激的胆道上皮细胞EGF和HGF有助于维持发起纤维发生的刺激。21,22炎症介质如单核细胞趋化因子- 1 (MCP-1)被认为是刺激中国人民银行纤维化反应。20.

    基因差异表达的分析理解肝损伤的发病机制是一个重要的方法。经典方法检验单个候选基因的mRNA表达如生长因子(例如,结缔组织生长因子(CTGF)23)、细胞因子(例如,引发10)和趋化因子(例如,IP-1024)。不幸的是,基因差异表达的检测方法如北部污点分析和半定量的反向transcriptase-polymerase连锁反应(rt - pcr)是费力而探索一些基因。在肝损伤的致病过程,如炎症、增殖,凋亡,和纤维化,是相互关联的,越来越多的基因被确定为在每个致病过程中发挥重要作用。显然,方法可以同时检查差很多基因的表达可能会导致显著的进步在理解致病通路参与了肝损伤。因此,在本研究中我们使用互补DNA(互补)阵列分析在中国人民银行检查肝内差异基因表达。介绍了多种新颖的观察差异表达基因和通路参与上述致病过程。有趣的是,Wnt通路是强烈与中国人民银行首次病理学。

    方法

    组织和RNA隔离

    总RNA分离结束阶段肝硬化中国人民银行(n = 6)和结束阶段肝硬化原发性硬化性胆管炎(PSC) (n = 4)组织获得肝脏外植体。十几组织获得移植供肝活检(n = 4)和正常肝(远离肿瘤边缘)在肝转移切除术(n = 4)。组织机构伦理委员会批准后得到和澳大利亚医学研究委员会的指导方针。慢性炎性活动和结束阶段肝硬化明显在肝硬化的标本。RNA提取用异硫氰酸胍解散和异丙醇沉淀被描述。10多聚腺苷酸+信使RNA合成阵列探测器是隔绝的四个人使用oligo-dT RNA样本18纤维素(罗氏分子系统公司Branchburg,新泽西,美国)的标准方法。25正常化的样品池是意味着数组的个体差异分析。26

    互补脱氧核糖核酸阵列分析

    两个尼龙膜基础cDNA数组被使用:(a)阿特拉斯人类基因阵列1.0(588个基因和九个看家基因)和(b)阿特拉斯细胞因子/受体数组(268个基因和九个看家基因)(Clontech实验室,Inc .,帕洛阿尔托,加州,美国)(图1)。一个列表的所有基因这两个数组与基因功能的总结www.clontech.com/atlas。

    Examples of cDNA arrays. ATLAS Cytokine Receptor Array (268 genes and nine housekeeping genes) (A) and ATLAS Human Gene Array 1.0 (588 genes and nine housekeeping genes) (B), both probed with32P-2′ deoxy-cytidine 5′ triphosphate (dCTP) labelled primary biliary cirrhosis (PBC) mRNA (pooled from four subjects). The magnified portion of the ATLAS Cytokine Receptor Array compares the32P-dCTP signal from the PBC and normal liver probes. Upregulation of monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) in PBC (in the small broken line boxes) is shown (C). Regression analysis (D); this example compares signals generated using the PBC probe with signals generated using a probe derived from non-diseased tissue (the normal liver probe) for each gene on the ATLAS Human Gene Array 1.0. The regression line equation was PBC=2.0684×non-diseased0.83854, r2=0.76, p<0.0001. The extent of differential expression for each gene was determined as a ratio of the raw array signal intensity to the signal intensity calculated from the regression line formula.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    互补脱氧核糖核酸数组的例子。阿特拉斯细胞因子受体数组(268个基因和九个看家基因)(A)和阿特拉斯人类基因阵列1.0(588个基因和九个看家基因)(B),探讨了32p 2′5′deoxy-cytidine三磷酸(dCTP)称为原发性胆汁性肝硬化(PBC) mRNA(汇集从四个科目)。ATLAS的放大部分细胞因子受体数组进行比较32从中国人民银行和正常肝调查P-dCTP信号。Upregulation的单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)在中国人民银行(小虚线框)(C)所示。回归分析(D);这个例子比较信号使用中国人民银行生成探测器与信号生成使用探测来自十几组织(正常肝探针)为每个基因在人类基因图谱数组1.0。回归直线方程是中国人民银行= 2.0684×十几0.83854,r2= 0.76,p < 0.0001。确定了每个基因的差异表达的程度作为一个原始的阵列信号强度比回归线的信号强度计算公式。

    探针从肝硬化PBC、肝硬化PSC供肝,和正常肝组织杂交图谱细胞因子数组和人类基因阵列地图册。探针合成进行推荐的厂家做了一些调整。在第一个链互补脱氧核糖核酸的合成,1 - 2μg多聚腺苷酸+信使rna被贴上20μl 7.5μlα的反应32P-dCTP(10μCi /μl 3000 Ci /更易;NEN生命科学产品公司,波士顿,麻萨诸塞州,美国)1μl上标二世RT(美国Gibco-BRL马里兰州),4μl 5×反应缓冲区,2μl 100毫米二硫苏糖醇、0.5μl核糖核酸酶抑制剂(Promega Corp .,麦迪逊,威斯康辛州,美国),1μl基因特定的引物组合(Clontech),水,和2μl deoxy-nucleotides(核苷酸)(5毫米2′脱氧-三磷酸腺苷5′(dATP), 2′5′deoxy-thymidine三磷酸(dTTP), 2′5′deoxy-guanosine三磷酸(dGTP)和50μM 2′5′deoxy-cytidine三磷酸(dCTP);英国白金汉郡英国Amersham淀粉微球生物科技有限公司)在48°C了40分钟。非公司核苷酸被使用基于树脂浓度自旋- 200列推荐的制造商(Clontech)。调查的最终浓度2 - 4×106CPM /毫升杂交为大约15小时每个数组膜表达Hyb杂交方案在68°C (Clontech)。数组膜清洗SSC含量的减少。信号从数组中膜量化使用gs - 525分子成像和分子分析软件(Bio-Rad实验室Inc .,赫拉克勒斯,加州,美国。此外,所有数组都暴露在电影(电影女士与女士屏幕;美国伊士曼柯达公司,纽黑文,康涅狄格州)。的信号从一个空白部分cDNA数组作为背景。个人基因表达每个数组是调整的背景。

    管家基因的选择

    回归的情节,比如图中所示1D,泛素并没有表现出显著的微分表达式和被选为管家基因。数据使用的其他八个管家基因并不因为磷脂酶A2和hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase信号小于两倍的背景,和大脑特定的微管蛋白α1亚基,细胞质beta-actin, MHC抗原c - 4α亚基类,和3 -磷酸甘油醛脱氢酶差异表达在肝硬化。

    灵敏度和重现性的cDNA数组

    超过95%的互补脱氧核糖核酸斑点杂交后的数组有可检测的信号。信号强度在数组不同的四个数量级。低丰度信号被定义为信号小于两倍的背景和代表至少61%的阵列信号。考虑到使用3290 P示踪探测灵敏度最大化信号被排除在后续分析由于开花或膜污染。原始的看家基因信号从肝硬化肝脏大比正常或供肝的探测器探测,导致我们的实验。差别优先检测,而不是对这些数据只有当使用至少一个以上的信号是50%或更多的背景。

    两两比较基因表达决心从四个不同的信号强度与探测(中国人民银行肝硬化,PSC肝硬化,供体组织和正常组织)。数据给出了一个比所产生的两种方法之一:

    (1)
    信号强度转换为比例调整的背景和管家基因(泛素)表达:
    ((基因探针−背景从探针)/(管家基因探针−背景从探针))/((基因探针B−背景从探测器B) /(管家基因探针B−背景从探测器B))。
    (2)
    回归分析,这种方法不需要调整背景或管家基因信号(图1D)。权力非线性回归分析用对数刻度,因为信号强度不同的四个数量级。计算每个观测信号除以每个信号,从回归线公式计算来自所有信号在每个成对组织比较。

    报道比例比较使用的每个基因的表达产生了更大的价值的方法。个人基因表现出大于1.5倍upregulation讲与炎症的致病过程,纤维化增生,压力反应/氧化应激、细胞凋亡、细胞内信号通路。讲基因致病过程根据阵列制造商的指导方针和已知的基因功能。许多基因可以被包含在多个类别,所以基因分为致病过程使用这种下行层次结构:(i)细胞内信号和核,(ii)细胞凋亡,(3)炎症,(iv)增殖,(v)纤维化和(vi)应激反应/氧化应激相关基因,和(七)uncategorised基因。

    此外,比较个体基因表达数据绘制图形;基因集群根据微分表达式的性质和范围的三个比较。集群使用集群和TreeView软件(M艾森,斯坦福大学)。27这个层次聚类方法使用成对平均连锁分析和基因功能的先验知识。

    定量rt - pcr

    在个别病人标本确认微分表达式,信使rna的基因被量化使用修改发布实时rt - pcr的方法。28基因化验:Wnt-5a Wnt-13, CTGF,细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN),基质细胞衍生因子1受体(CXCR4) follistatin,分泌卷曲的相关蛋白3 (FRITZ),β-连环蛋白,Jagged-1,补丁同系物(PTC)。

    短暂5μl总RNA(5μg)主要是用3μl oligo-dT (500 ng)18底漆(罗氏诊断,印第安纳波利斯,印第安纳州,美国),然后反向转录50分钟的42°C。反应混合物(20μl)也包含4μl 5×反应缓冲区,2μl 100毫米二硫苏糖醇、0.5μl核糖核酸酶抑制剂(Promega), 1μl 10毫米核苷酸(Amersham), 1μl上标二世(Gibco-BRL)和3.5μl H2o .互补脱氧核糖核酸合成后的总量是80μl H2o .两个互补脱氧核糖核酸RNA样本样本准备,然后储存在−70°C,直到需要。每一个实时PCR反应包含1μl cDNA、10×2.5μl TaqMan反应缓冲区(美国加州福斯特城PE生物系统,),4μl MgCl 25毫米20.5μl 10毫米核苷酸1μl正向和反向引物5毫米,0.18μl AmpliTaq黄金(5.5 U / l)聚合酶(PE生物系统),0.25μl 50×Sybr Green1(分子探针,尤金,俄勒冈州,美国),和H2O为25μl总量。循环参数95°C 10分钟紧随其后40 95°C的周期为30秒,40秒坡道,60°C 30秒,20第二个斜坡,为一分钟72°C, 17第二坡道,30秒荧光测量。这个测量解决感兴趣的基因从primer-dimers等非特异性扩增的产物,并通过使用测量温度范围从82到86°C(每个产品由熔点分析)。28反应进行的重复使用一个应用生物系统公司合并(ABI) 7700型序列检测器(PE生物系统)和分析使用ABI棱镜序列检测器的软件v1.6.3 (PE生物系统)。一个基因特定DNA标准包含在每个试验。确认单一PCR产物是由凝胶分析和放大PCR证实了产品的身份测序(ABI 373测序仪使用化学染料终结者;体育生物系统)。管家基因,泛素是量化的互补。

    引物序列是:Wnt-5a向前5′GCAATGTCTTCCAAGTTC 3′,反向5′AAGTGGCACAGTTTCTTC 3′;Wnt-13向前5′GAGTGTCAGCACCAATTCC 3′,反向5′CACCCCAGTCAAAAGTCC 3′;CTGF向前5′TCCCACCCAATTCA AAAC 3′,反向5′CAAAATAGCAGGCAT ATTACTCG3′;趋化因子受体CXCR4向前5′TCAGT GAGGCAGATGACAG 3′,反向5′TCCC AATGTAGTAAGGCAG 3′;EMMPRIN向前5′ACAAGATCACTGACTCTG AGGAC3′,反向5′TTCTCAATGTG TAGCTCTGACC 3′;follistatin向前5′CCTCAACCCATCTTTCAAC 3′,反向5′CCCCTTCTGATTCTTTCC 3′;β-连环蛋白向前5′CATTACAACTCTCCA CAACC 3′,反向5′CAGATAGCACCTTC AGCAC 3′;弗里茨提出5′CAGTAGT GGAGGTGAAGGAG 3′,反向5′GAGTC CAAGATGACGAAG 3′;PTC向前5′CCCCAACAAAAATTCAACC 3′,反向5′CATCATCCACACCAACACC 3′;Jagged-1向前5′GGACTATGAGGGCAAGAAC 3′,反向5′CCTTTCCACCCATTTTTAC 3′;和泛素向前5′GTTGATCTTT GCTGGAAAAC 3′,反向5′AATGCCTTC CTTGTCCTG 3′。

    统计分析

    所有结果都表示为(SEM)。统计比较使用非参数Mann-Whitney U进行测试。统计分析了使用Statview 4.5.1(美国加州Abacus概念)和回归土地使用KaleideGraph生成3.0(美国宾夕法尼亚州协同软件)。

    结果

    基因分析的中国人民银行

    基于聚类的基因相对表达(无花果2)表示基因组织同样调节或表达下调,快速筛选基因感兴趣的团体。聚类分析显示,超过70%的基因表达有一个类似的模式相比,中国人民银行和PSC相关的肝硬化十几组织。虽然基因表达的模式是类似的,有差异的基因差异表达程度的中国人民银行和PSC相关肝硬化与十几组织。微分表达式所有数据由色彩强度描绘在图2和补充材料聚类图(请参阅网站补充数据www.gutjnl.com)。此外,补充材料聚类图包括垂直(基因)系统树图标签与单个基因的名字。

    Clustering of the 874 genes. Each line across all comparisons represents a single gene with upregulation indicated in increasing red and downregulation indicated in increasing green. Genes were clustered according to the nature and extent of their differential expression over the three comparisons. There was more than 70% similarity in the patterns of expression in primary biliary cirrhosis (PBC) and primary sclerosing cholangitis (PSC) associated cirrhosis compared with non-diseased tissue (indicated by the broken lines with asterisks). This graphical depiction of the data identifies groups of genes, such as those that had increased expression in: PBC compared with both non-diseased tissue and PSC associated cirrhosis (A); both PBC and PSC associated cirrhosis compared with non-diseased liver (B, C); PBC compared with PSC associated cirrhosis in addition to both of these diseases compared with non-diseased liver (C); and PSC but not PBC compared with non-diseased liver (D).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    874个基因的聚类。每一行所有比较代表一个单基因与upregulation表示增加红色表示差别和对这些增加绿色。基因集群根据微分表达式的性质和范围的三个比较。有70%以上相似的表达模式在原发性胆汁性肝硬化(PBC)和原发性硬化性胆管炎(PSC)相关的肝硬化与十几组织与星号(虚线)。这个基因的数据确定组的图形化描述,比如增加了表达:中国人民银行相比十几组织和PSC相关肝硬化(一个);中国人民银行和PSC相关肝硬化与十几肝脏(B, C);中国人民银行与PSC相关肝硬化除了这两种疾病与十几肝脏(C);和PSC但不是中国人民银行与十几肝脏(D)。

    差异基因表达在中国人民银行

    最感兴趣的调节基因、Wnt-13 follistatin, Jagged-1表达水平在中国人民银行超过十几或PSC相关肝硬化肝脏(补充material-see网站)。脑衍生神经营养因子(BDNF)受体(Trk3),蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶1,干细胞蛋白质(sci或TAL-1),和Wnt-2大大增加在中国人民银行和PSC相关肝硬化与十几组织(补充material-see网站)。Ephrin A3是最引人注目的是表达下调基因和迁移抑制因子相关蛋白8 (MRP-8 / calgranulin)和受体细胞毒性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体明显下调中国人民银行和PSC相关肝硬化(补充material-see网站)。

    基因upregulation在2.0倍或更大的提出了无花果3和4。补充材料表列出基因表现出1.5倍或更大的微分表达式,而整个cDNA数组微分表达数据的补充材料聚类图(见网站)。

    Upregulation of inflammatory, fibrosis, and apoptosis associated genes. Inflammation associated genes (A), fibrosis associated genes (B), and apoptosis associated genes (C) that were upregulated 2.0-fold or greater in primary biliary cirrhosis (PBC) compared with non-diseased liver tissue. Apoptosis associated gene upregulation of 2.0-fold or greater in primary sclerosing cholangitis (PSC) associated cirrhosis compared with non-diseased liver tissue is also shown (D). Genes marked with an asterisk were upregulated greater than twofold in PBC compared with both non-diseased liver tissue and PSC associated cirrhosis (*A–C). Genes marked with two asterisks were upregulated greater than twofold in PSC associated cirrhosis compared with both non-diseased liver tissue and PBC (**D).  
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    Upregulation炎症、纤维化和细胞凋亡相关基因。炎症相关基因(A)、肝纤维化相关基因(B), (C)和细胞凋亡相关基因调节2.0倍或更大的原发性胆汁性肝硬化(PBC)与十几肝脏组织。细胞凋亡相关基因upregulation 2.0倍或更高的原发性硬化性胆管炎(PSC)相关的肝硬化与十几肝组织相比也显示(D),带星号的基因调节大于两个十几肝组织和PSC相比,中国人民银行相关肝硬化(a - c *)。与两个星号标记的基因调节相比,PSC相关肝硬化大于两个十几肝组织和中国人民银行(* * D)。 

    Upregulation of Drosophila homologues. Drosophila homologues that were upregulated 2.0-fold or greater in primary biliary cirrhosis (PBC) compared with non-diseased liver tissue. Genes marked with an asterisk were upregulated greater than twofold in PBC compared with both non-diseased liver tissue and primary sclerosing cholangitis associated cirrhosis.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    Upregulation果蝇同系物。果蝇同系物调节2.0倍或更高的原发性胆汁性肝硬化(PBC)与十几肝脏组织。基因标有星号是调节大于两倍相比,中国人民银行十几肝组织和原发性硬化性胆管炎相关的肝硬化。

    微分表达式相比,中国人民银行十几肝脏

    炎症(图3一个)。

    趋化因子受体CXCR4和flt3受体是最大幅度增加炎症相关的基因,每个都有超过6倍的增加表达与十几相比,中国人民银行组织。Th1和Th2细胞因子的反应是观察。相关联的Th2细胞因子il - 4、IL-5 IL-13和Th1分子lymphotoxin-beta IFN-γ受体β亚基,和肿瘤坏死因子受体增加相比,中国人民银行十几肝脏。增加趋化因子趋化因子受体CXCR4的表达中国人民银行和MCP-1被观察到。flt3受体CXCR4,髓核细胞分化抗原,IL-3, IL-5, IL-15, IL-17, granulocyte-macrophage集落刺激因子是调节大于三倍相比,中国人民银行十几肝脏。

    纤维化(图3B)。

    最具戏剧性的增加纤维化类别是CTGF和TGF-beta3,在中国人民银行增加大于10倍。值得注意的是,血小板活化因子受体,FGF受体1,FGF受体3,半胱氨酸丰富FGF受体,酸性FGF, PDGF受体增加在中国人民银行。有趣的是,调节介质的纤维化包括几个TGF家庭成员,TGF-beta3, TGF-beta2, TGF-beta1(1.5倍,见补充材料的网站)。重要的是,认识到纤维介质如EMMPRIN增加中国人民银行(1.7倍,见补充材料的网站)。显然,整合素α5和6 (VLA-5和6;CD49e CD49f),我们在炎症(图的范畴3),也与纤维发生。

    再生、生长和增殖(补充material-see网站)

    许多高度保守的基因的表达Wnt和notch通路和四个生成相关基因增加了中国人民银行。事实上,这一类的16个基因,表现出大于三倍增加表达式,13要么果蝇同系物(图4)或神经基因。的果蝇同系物包括Wnt-2 Wnt-13、Wnt-5a Wnt-10b / Wnt-12 Wnt通路,和Jagged-1 Jagged-2, notch 1, notch-2, notch-4 notch通路(图4)。基因相关的调节生成脑源性神经营养因子受体/ Trk3,脑源性神经营养因子、神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)和ret原癌基因(GDNF受体复杂)的一部分(补充material-see网站)。许多基因的胰岛素增长轴,如胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP) 6、IGFBP-2和胰岛素受体增加在中国人民银行。此外,周期蛋白d1,细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CDKN) 1 c, CDKN-1A, CDKN-3也增加了中国人民银行。Delta-like蛋白质、共济失调毛细血管扩张、Erb B4 CDKN-1C, IGFBP-6增加三倍或更高版本相比,中国人民银行十几组织。

    胞内信号和核(补充material-see网站)。

    突触相关蛋白97和干细胞蛋白质(sci或Tal-1)在中国人民银行增加大于九倍。许多基因参与细胞内信号通路在中国人民银行增加了表达。包括基因承认下游Wnt信号的目标,包括c-jun、原癌基因,c-fos相关抗原1,β-连环蛋白。许多转录因子包括helix-loop-helix蛋白质通过1一下r21和锌指多发性内分泌瘤1轨迹和介质的几个途径,包括Erb B通路,换能器的Erb B2是一个组件,在中国人民银行增加。

    压力反应/氧化应激(补充material-see网站)

    的压力反应的特点是增加表达热休克蛋白(HSP) 70.1, HSP90A,和HSP27基因在氧化应激包括glutathione-S-transferase M1,二恶英诱导细胞色素P450 1 b1和胞质超氧化物歧化酶1。

    Uncategorised基因(补充material-see网站)

    许多基因没有分类,因为他们有多个或差特征函数。Follistatin、prorelaxin-H2 ephrin相关基因包括ephrin B型受体2和3和ephrin类型受体3在中国人民银行更大的表达式。视黄酸结合蛋白II可以认为是纤维化相关,但这样的基因的细胞起源的信使rna是未知的,是uncategorised。

    细胞凋亡基因(图3C)

    只有proapoptotic早反应蛋白质NAK1 /古墓孤儿受体29日在中国人民银行增加大于双重的。

    微分表达式与PSC相比,中国人民银行

    基因upregulation与PSC相比,中国人民银行相关肝硬化帮助识别基因优先参与中国人民银行的发病机制与另一种类型的“胆”肝硬化。炎症相关基因IL-3, il - 4、IL-5 IL-15, IL-17,趋化因子受体CXCR4表达与PSC相比,中国人民银行相关的肝硬化(无花果3)。CTGF和TGF-beta3表达式比PSC在中国人民银行相关的肝硬化(图3B)。

    许多哺乳动物同系物的高度保守的基因参与最初生长和再生中确定果蝇增加与PSC相比,中国人民银行相关的肝硬化。包括弗里茨,Wnt-13 Wnt-5a notch 1, notch-2, notch-4, Jagged-1 Jagged-2,平和(无花果4)。此外,GDNF受体ret与PSC增加相比,中国人民银行。被认为在某些应激相关基因的差异表达,尤其是HSP27。

    细胞质相关信号和核基因数据显示惊人的中国人民银行之间的差异和PSC相关的肝硬化。增加大于80倍的转录起始因子250 kDa亚基(TAFII250)被认为与PSC相比,中国人民银行相关的肝硬化。有趣的是,c - src的表达,Rad52 c-myb与PSC相比,中国人民银行更大。相比之下,一些信号相关基因如neural-cadherin和几个致癌基因,如平和p56-lck显著调节与中国人民银行相比,PSC(补充material-see网站)。

    显著uncategorised基因表现出更强的表达式——卵泡在中国人民银行与PSC过分生长,弗里茨,prorelaxin H2,肾素结合蛋白,血管紧张素ⅱ1型受体,thrombomodulin。

    中国人民银行一个有趣的区别和PSC相关的肝硬化是与中国人民银行相比,许多细胞凋亡相关基因调节在PSC(无花果3D)。其中包括抑制剂细胞凋亡蛋白(IAP) 1, IAP-2, IAP-3, bcl - 2四抗凋亡相关蛋白,bcl - 2、bcl - 2 A1, Bcl-x,和bcl - 2腺病毒E1B 19 kDa相互作用的蛋白质,和pro-apoptotic分子贝克,Bik,伯灵顿的bcl - 2家族。

    数组数据的统计分析

    相关系数回归分析后的阿特拉斯人类基因阵列和阿特拉斯细胞因子受体数组数据,分别为:中国人民银行与正常肝r2= 0.77和0.85;中国人民银行与供肝r2= 0.84和0.93;和中国人民银行与PSC相比r2= 0.86,0.85,p < 0.001为所有三个比较。

    有190个基因都常见的cDNA数组。四探针的两个数组有很强的相关性的760重复信号(r2= 0.76,p < 0.001)。同样,760年的重复信号被减去相比比较的回归比决定中国人民银行或与十几PSC相关的肝硬化组织。760年重复的信号显示的平均差只有0.084 (0.017)。

    基因差异表达的两种方法确定被减去相比,对于每个基因,比由回归分析的比率由泛素表达的调整(见方法)。与正常的三个比较,中国人民银行,捐赠者,PSC,共有2359个基因差异表达的决定使用,发现两种方法之间的平均差是0.29(0.058)比单位。此外,我们减去,对于每个基因,产生的比率捐赠者和正常肝脏样本在每个相比之下,中国人民银行。1572年重复的比较显示,平均捐赠和正常肝的区别只有0.10(0.058)比单位,表示密切相似的两种类型的十几肝脏。

    定量rt - pcr

    选择10个基因的表达增加,主要与纤维化和Wnt通路相关的基因,对个别病人的标本证实,包括所有标本分析cDNA数组(无花果5)。基因表达被量化实时rt - pcr在两个单独的互补脱氧核糖核酸合成的两倍。CTGF表达是最丰富的基因为4.6×106(0.4×106每μg)相关基因副本在中国人民银行的总RNA。Wnt-13是最丰富的成绩单量化,只有64册/μg十几肝脏的总RNA。互补脱氧核糖核酸数组比较PBC和十几肝脏显示增加的13.6×CTGF, 7.2×趋化因子受体CXCR4, 1.7×EMMPRIN,——卵泡10.7×过分生长,5.7×Wnt-13, 3.6×Wnt-5a, 1.8×β-连环蛋白,4.4×FRITZ, 7.9×Jagged-1,和6.7×PTC(列车自动控制系统)。因此,数组和rt - pcr数据整合。

    Differential gene expression examined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Quantitative real-time RT-PCR data (mean (SEM)) on mRNA from primary biliary cirrhosis (PBC) (n=6), primary sclerosing cholangitis (PSC) associated cirrhosis (n=4), hepatitis C virus (HCV) cirrhosis (n=6), and non-diseased donor liver (n=4). The depicted differential expression data are in two groups: (A) follistatin, CXC chemokine receptor 4 (CXCR4), connective tissue growth factor (CTGF), and extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) and (B) Drosophila homologues including Wnt-13, secreted frizzled related protein 3 (FRITZ), beta-catenin, and Jagged-1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    差异基因表达研究反向transcriptase-polymerase连锁反应(rt - pcr)。实时定量rt - pcr数据(意味着(SEM))的mRNA原发性胆汁性肝硬化(PBC) (n = 6),原发性硬化性胆管炎(PSC)肝硬化(n = 4)有关,丙型肝炎病毒(HCV)肝硬化(n = 6),和十几供肝(n = 4)。微分表达式描述数据在两组:——卵泡(A)过分生长,科学家趋化因子受体4 (CXCR4)、结缔组织生长因子(CTGF)和细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)和(B)果蝇同系物包括Wnt-13分泌卷曲的相关蛋白3 (FRITZ),β-连环蛋白和Jagged-1。

    讨论

    肝内cDNA阵列分析是一种新的方法来研究基因表达的肝硬化。利用这种方法我们已经确定了很多新颖有趣的分子途径的差异在mRNA水平相比,中国人民银行与十几肝脏和PSC肝硬化肝脏有关。识别与炎症相关的基因的差异表达、纤维化、细胞凋亡、增殖,再生,神经细胞,和Wnt和notch通路使识别的分子途径可能参与了PBC发病机理。

    小说的观察微分表达式包括许多Wnt和notch通路的基因,这两种方式是高度保守的,最初中确定果蝇发展和分化。观察是一致的增加Wnt信号而不是增加营业额Wnt通路组件。除了下游β-连环蛋白表达增加,最经典的基因激活Wnt通路增加在中国人民银行,包括原癌基因,c-jun c-fos相关抗原1,周期蛋白d1。肝硬化的Wnt通路的确切功能尚不得而知。多个Wnt通路基因与肿瘤发生但肝细胞癌的发病率在中国人民银行小于其他类型的肝硬化。Wnt通路在成人器官的生理作用了解甚少。Wnt响应转录因子T细胞因子4是极大地表达在正常成人肝但其生理功能未知。30.造血祖细胞的分化涉及Wnt通路的基因,31日在的后肾间充质上皮转换需要Wnt表达式,32和监管机构的角色Wnt通路和T细胞因子4在脊椎动物肠道上皮细胞分化的可能。30.替换的滑膜成纤维细胞常住人口的类风湿性关节炎患者不成熟的骨髓间充质细胞是伴随着增加Wnt-5a / Fz5的表情。33Wnt-5a表达的增加,弗里茨和β-连环蛋白在中国人民银行,PSC和丙肝肝硬化(无花果5)表明,Wnt通路是活跃在各种形式的肝硬化。然而,Wnt通路基因检测的频率在中国人民银行表明它可能扮演一个更具体的角色在PBC发病机理(无花果4)。显然更详细检查Wnt通路的肝硬化是必要的。

    诺(受体)/锯齿状(配体)通路在人类疾病的部分特征。34Jagged-1基因的突变负责Alagille综合症。35Jagged-1表达式在成人肝脏局部区域三个肝细胞和胆管上皮细胞。36notch 1、2和3以及Jagged-1 2涉及的决心α-β和γδT细胞CD4+与CD8+胸腺细胞谱系的选择。37,38细胞命运决定函数Wnt和切口途径分享部分解释为Wnt蛋白质之间的相互作用蛋白质与受体和绑定的监管蓬乱的卷曲的和切口受体。39,40观察到的Wnt基因差异表达和notch通路关系PBC发病机理仍有待确定。

    记录Wnt和notch通路的功能是调节生长和再生相关的分子,follistatin和苯丙酸诺龙。因此——卵泡的过分生长和苯丙酸诺龙增加中国人民银行和PSC相关肝硬化。Wnt和FGF表达抑制苯丙酸诺龙活动——卵泡虽然Wnt和notch通路调节过分生长。41,42——卵泡肝内过分生长刺激增殖和凋亡。Follistatin可以加速部分肝切除术后肝再生。43,44相反,苯丙酸诺龙的自分泌抑制剂肝细胞DNA合成,45阻碍肝细胞增殖和功能的维修质量恒定的肝脏。46Follistatin激活素结合蛋白,一般——卵泡的影响,过分生长是由苯丙酸诺龙对着干。47,48苯丙酸诺龙注入静脉注射会导致肝小叶中央静脉周围细胞凋亡,切除——卵泡增加过分生长产生影响。49——卵泡的机制过分生长调节控制肝增长并不理解。EGF、鉴定及去甲肾上腺素、胰高血糖素,所有的已知影响肝细胞再生,——卵泡上调过分生长mRNA表达肝细胞。50Wnt的可能关系,等级/锯齿状,——卵泡和过分生长/苯丙酸诺龙通路可能是一个常见的链接影响肝细胞增殖,特别是在中国人民银行或任何形式的更一般的肝硬化。互补dna阵列技术是一种无与伦比的手段,同时检查潜在功能相关基因的mRNA表达的Wnt等——卵泡等级/锯齿状,过分生长/苯丙酸诺龙通路在肝细胞增殖。

    中国人民银行原则的特点是肝内炎症。中国人民银行的特点是我们cDNA阵列分析涉及混合Th1、Th2免疫反应。先前的研究普遍认为中国人民银行主要涉及Th1反应。51原位杂交研究PBC患者9和中国人民银行的一个动物模型52显示增加IFN-γ表达式与Th1反应一致。然而,混合Th1、Th2细胞因子表达一直观察不同动物模型的中国人民银行53我们之前表现出显著的肝内2,il - 6,引发,并在中国人民银行及表达式。10此外,中国人民银行病人衍生周边T细胞克隆异构Th1 / Th2概要文件。16检查一些细胞因子可能歪曲Th1 / Th2概要文件。我们的数据突出强度cDNA阵列原理分析同时检查许多基因的表达。

    纤维化相关基因表达是由互补脱氧核糖核酸数组定义良好的分析。增加生长因子如FGF-1和FGF-3在中国人民银行符合已知通路肝星状细胞的旁分泌和自分泌的刺激。54胆道上皮细胞和肝细胞的免疫介导的损伤或MCP-1等细胞因子信号,很可能这些profibrotic分子的额外来源。55表达的增加及2和3康科德,所有证据及亚型调节肝纤维化。56,57及、CTGF和EMMPRIN调节在中国人民银行和PSC(无花果3B)。CTGF HSC产品鉴定及刺激后发布的,所以他们的微分表达式预期有关。23,58相比之下,EMMPRIN不是已知人类肝硬化的纤维化的中介。EMMPRIN表达的肿瘤和上皮细胞与成纤维细胞相互作用导致的金属蛋白酶- 1的表达,增加MMP-2,(胶原酶)和MMP-3 (stromelysin 1)。59 - 63

    上面的讨论主要集中在微分与十几肝脏基因表达相比,中国人民银行。这样的微分表达式通常可能参与了肝硬化或炎症而不是具体的为中国人民银行。因此,中国人民银行与另一个“胆”肝硬化,PSC。的整体基因档案数据显示,调节肝脏基因表达这两种疾病有点类似同样70%的检测基因表达。然而,中国人民银行有差异与不同的致病途径一致。最引人注目的是戏剧性的细胞凋亡相关基因的表达差异之间的两种类型的肝硬化。这种差异是一致的细胞凋亡在PSC更加活跃和积极监管比中国人民银行相关的肝硬化。没有直接比较PBC和PSC之间的细胞凋亡。细胞凋亡和细胞增殖过程有着明显的联系。目前,研究尚未涉及细胞凋亡在中国人民银行的增殖反应。 However, abnormal apoptosis leading to persistence of dysplastic biliary epithelial cells is thought to be involved in the pathogenesis of cholangiocarcinoma complicating PSC.64年

    细胞生长和分化所产生的信号反应显然是重要的人类肝脏疾病的发病机理。观察到的信号相关差异基因表达符合中国人民银行特定转录相关基因。TAFII250表达中国人民银行超过十几和PSC肝脏是有趣的。TAFII250 TATA框结合蛋白相关因素(TAF),参与细胞周期蛋白基因的转录的转录因子TFIID组装,特别是细胞周期蛋白和细胞周期蛋白D1。65年细胞系没有正常TAFII250功能逮捕在G1和细胞周期蛋白基因的转录是逮捕。66年为什么这样一个戏剧性的差异TAFII250表达式出现在中国人民银行还不清楚,需要进一步研究。

    检测肝内神经基因的表达预期的新兴连接这样的肝星状细胞分化的基因。然而,大量的这类基因发现很有趣。小说的微分表达神经基因Trk3, GDNF、ret,突触相关蛋白97年观察到的。Trk3,脑源性神经营养因子受体,这是增加中国人民银行和PSC,是生成(NT)相关联。NT相关蛋白质包括神经生长因子配体(神经生长因子),NT-3,请,NT-6, GDNF,和受体TrkB TrkC,神经生长因子受体p75NTR。67年GDNF尚未在肝脏,但学习与发展;其受体ret突变负责多发性内分泌瘤2和巨结肠病。68 - 70nt不是特定神经细胞;T细胞、B细胞和巨噬细胞产生炎症期间nt。71 - 73神经元标记表达式的增加也可能反映神经形成伴随血管生成增加肝硬化。然而,肝细胞基因差异表达神经起源可能起源于肝星状细胞,有神经表型包括p75NTR表达和可能起源于神经嵴。54,74 - 79

    许多警告与利用cDNA数组和实验整个肝组织。互补脱氧核糖核酸表示数值数组数据和统计分析传达其精度和重现性。然而,这种技术的力量而不是量化的差异表达基因的识别个体的基因表达。量化并确认个人基因表达增加,技术,如北部污点或定量rt - pcr是必需的。80年,81年肝细胞是整个肝脏的主要contributant准备mRNA。然而,其他细胞类型如胆道上皮细胞、肝星状细胞,内皮细胞,枯氏细胞、T细胞和巨噬细胞可能做出重要的贡献。在中国人民银行与胆管损失总额的比例mRNA池源于胆道上皮是未知的。基因表达具体由一个细胞类型可能显著差异表达,尽管小cDNA数组比率。未来的研究将从孤立的细胞各亚群分析mRNA。这些研究需要谨慎的解释,因为隔离方法可能激活细胞,特别是当涉及到细胞培养,并移除交互存在实体器官,如与其他类型的细胞和细胞外基质。此外,微分mRNA的表达不需要导致相应的生物活性蛋白的微分表达式。

    总之,这里给出的数据是一个重要的进步记录许多新的观察和多个基因差异表达的同时观察在小说和中国人民银行之前确定致病通路。许多研究了这些基因在体外或体内实验与肝脏病理生理学无关。然而,考虑到我们已经讨论了基因的中心角色与肝等价物过程如炎症、纤维化、细胞凋亡、信号、扩散,重要的再生,他们很有可能在中国人民银行的发病机制。许多基因,如EMMPRIN,趋化因子受体CXCR4——卵泡抑素——过多,和CTGF与肝硬化不管病因学有关。PSC的使用作为一个肝硬化胆道炎症比较帮助识别基因潜在的重要的中国人民银行和PSC微分的发病机理。最后,观察到的差异基因表达的Wnt和切口途径尤其是涉及这些高度保守的果蝇在PBC发病途径。这是第一次Wnt通路已被卷入任何形式的肝硬化。未来的研究将需要本地化的基因表达和功能的直接分析肝脏病理学相关的通路。

    确认

    威康基金会和克莱夫和维拉Ramaciotti基金会资助购买7700型序列检测器。N Shackel获得澳大利亚国家健康与医学研究理事会先生古斯塔夫Nossal奖学金。

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    略语

    ABI
    应用生物系统公司合并
    AMA
    antimitochrondrial抗体
    脑源性神经营养因子
    脑衍生神经营养因子
    CDK
    细胞周期蛋白依赖激酶
    互补脱氧核糖核酸
    互补脱氧核糖核酸
    CTGF
    结缔组织生长因子
    CXCR
    科学家趋化因子受体
    dATP
    2′脱氧腺苷三磷酸5′
    dCTP
    2′5′deoxy-cytidine三磷酸
    dGTP
    2′5′deoxy-guanosine三磷酸
    核苷酸
    deoxy-nucleotides
    dTTP
    2′5′deoxy-thymidine三磷酸
    EMMPRIN
    细胞外基质金属蛋白酶诱导物
    表皮生长因子
    表皮生长因子
    FGF
    纤维母细胞生长因子
    弗里茨
    卷曲的相关蛋白质分泌3
    Fz
    卷曲的
    GDNF
    神经胶质细胞衍生神经营养因子
    HGF
    肝细胞生长因子
    HSC
    肝星状细胞
    HSP
    热休克蛋白
    IAP
    细胞凋亡蛋白的抑制剂
    干扰素
    干扰素
    IGFBP
    胰岛素样生长因子结合蛋白
    伊尔
    白介素
    MCP
    单核细胞化学引诱物蛋白质
    MMP的
    基质金属蛋白酶
    MRP-8
    迁移抑制因子相关蛋白8
    神经生长因子
    神经生长因子
    NT
    生成
    中国人民银行
    原发性胆汁性肝硬化
    聚合酶链反应
    聚合酶链反应
    PDGF
    血小板衍生生长因子
    PSC
    原发性硬化性胆管炎
    PTC(列车自动控制系统)
    补丁同系物
    RT
    逆转录酶
    sci
    干细胞的蛋白质
    TAF
    TATA盒结合蛋白相关的因素
    TAL-1
    干细胞的蛋白质
    TGF
    转化生长因子

    补充材料

    脚注

    • 网站e字母x

    • 额外的数据出现在肠道的网站www.gutjnl.com