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背景肝损伤后肝星状细胞(HSC)变换成myofibroblast-like细胞(激活)和I型胶原蛋白的主要来源,强效胶原酶抑制剂组织金属蛋白酶抑制剂1和2 (TIMP-1和TIMP-2)在肝纤维化。生殖激素松弛素已报道减少皮肤和肺成纤维细胞胶原蛋白和TIMP-1表达式,从而有可能在肝纤维化antifibrotic活动。
的目标是松弛素对HSC激活的影响。
方法隔离后,HSC激活文化在塑料和暴露于耻骨松弛激素(1 - 100 ng / ml)。胶原蛋白沉积是由天狼星红染色绑定和放射性标记脯氨酸掺入。基质金属蛋白酶(MMP)和TIMP表达式被zymography和北部的分析评估。转化生长因子β1 (TGF-β1)mRNA和蛋白水平量化分析和ELISA,北部。
结果接触活化HSC的耻骨松弛激素导致浓度依赖减少胶原合成和沉积。有一个平行的减少TIMP-1 TIMP-2分泌进入HSC的媒体,但没有观察白明胶酶表达的变化。分析表明,北部主要HSC不断暴露于松弛素,降低了TIMP-1 mRNA表达但一成不变的I型胶原蛋白,胶原酶(MMP-13),α平滑肌肌动蛋白,TGF-β1 mRNA的表达。
结论这些数据表明,耻骨松弛激素调节HSC有效的胶原蛋白沉积,至少部分,由于模式的变化矩阵退化。
- 松弛素
- 肝星状细胞
- 肝纤维化
- I型胶原蛋白
略语
- HSC
- 肝星状细胞
- TIMP
- 的金属蛋白酶组织抑制剂
- MMP的
- 基质金属蛋白酶
- α-SMA
- α-平滑肌肌动蛋白
- TGF-β1
- 转化生长因子β1
- DMEM
- 杜尔贝科的最小的重要媒介
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐
- BSA
- 牛血清白蛋白
- 柠檬酸
- trichloracetic酸
- 创新领导力4
- 四氯化碳
来自Altmetric.com的统计
肝纤维化的特点是增加肝细胞外基质蛋白沉积,尤其是I型胶原蛋白。压倒性的证据表明,肝星状细胞(HSC、脂肪细胞、脂肪储存,或伊藤细胞)是肝纤维发生的重要的效应细胞。1,2肝损伤后肝星状细胞成为激活、增殖和myofibroblast-like表型进行转换。除了矩阵表达蛋白质,尤其是I型胶原蛋白,3,4活化HSC也表达基质金属蛋白酶降解和强有力的金属蛋白酶抑制剂的金属蛋白酶组织抑制剂1和2 (TIMP-1和TIMP-2)。5 - 9我们和其他人推测纤维化的进展结果增加细胞外基质的合成分子加上TIMP-1和TIMP-2表达升高。Antifibrotic策略可能因此有效地针对矩阵合成减少或增加矩阵退化。
松弛素、胰岛素样生长因子的激素,在怀孕期间血清检测,扮演着重要的角色在启动子宫颈和interpubic韧带的结构改造为分娩做准备。10 - 12研究表明松弛素的影响都由减少胶原合成和胶原酶的生产和proteoglycanase的增加。13,14这些观察了感兴趣的潜在作用松弛素作为antifibrotic代理。人类皮肤成纤维细胞刺激炎性细胞因子的过度生产胶原蛋白对松弛素通过减少I型和III胶原蛋白的生产和增加procollagenase的合成和分泌,和减少TIMP-1表达式。15同样,硬皮病成纤维细胞行减少I型胶原蛋白的过度表达与松弛素对治疗的反应。16这些结果表明,在体外,松弛素可能调节矩阵营业额的降解胶原过度的情况。
体内,重组人类松弛素减少胶原蛋白积累在皮肤纤维化和啮齿动物模型与变更有关的组织间质中的胶原原纤维。17随后,松弛素是证明显著减少胶原蛋白积累在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型。18从肾纤维化模型的证据表明,松弛素的antifibrotic效果的差别可能部分由对这些转化生长因子β1 (TGF-β1)。19TGF-β1已经报道,此外,在一些系统中,进而抑制松弛素释放。20.
在这里的研究报道中,我们检查的影响人类松弛素的I型胶原蛋白的表达,重组TIMPs,基质金属蛋白酶(MMPs)在文化HSC激活。我们的研究结果表明,松弛素减少有效的胶原蛋白沉积可能导致I型胶原蛋白的合成和差别直接从对这些间接由于HSC TIMP-1合成减少,影响可能不是由内生TGF-β1表达式。
方法
HSC隔离和文化
分离从正常男性Sprague-Dawley老鼠和培养HSC如前所述。7文化受到重组人类松弛素1 - 100 ng / ml(很多63601;Connetics Corp .)、美国加州帕罗奥多市)不断从隔离或从天5 - 7(活化HSC)不同时间的说明。提供汇合的单层膜激活细胞的胶原蛋白合成化验,老鼠和人类HSC激活(> 7天在初级文化)通道到多井盘子。21
量化的HSC的胶原蛋白沉积
主HSC(激活文化对塑料的血清)暴露在松弛素1 - 100 ng / ml 48小时。细胞被洗井和胶原蛋白沉积是沾Picro天狼星红染色,描述由制造商(Biocolor、贝尔法斯特、英国)。22游离染料被清洗和绑定复杂氢氧化钠溶解在0.5%。胶原蛋白是由分光光度法测定的数量在540 nm和结果表示为一个百分比的未经处理的控制。
通过培养HSC量化的胶原蛋白生产
胶原蛋白合成HSC是由测量的3H脯氨酸的胶原蛋白使用修改Postlewaite和同事的方法23凯恩斯和墙壁。24早期通过HSC被播种到12孔板,直到接近融合发展。细胞无血清的洗涤和孵化杜尔贝科的最小基本培养基(DMEM)补充用抗生素,25μg /毫升抗坏血酸,0.01%的牛血清白蛋白(BSA)和重组松弛素0 - 100 ng / ml的总量500μl /。24小时后媒体与新媒体取代了包含上述添加+ 1μCil- (2、3、4、53H]脯氨酸(Amersham,小都,英国)。24小时后细胞上层的收获和细胞细胞溶解在TE(10毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液,1毫米EDTA, pH值7.5)进行DNA定量。
上层清液被分成4×100μl整除,装上96多屏幕过滤板(微孔英国有限公司,沃特福德,英国)和化验重复测量总蛋白的生产或生产蛋白质耐消化的高纯度细菌胶原酶(non-collagenous蛋白质)。每口井的胶原蛋白生产是使用以下公式计算:
(3H脯氨酸掺入(总蛋白)]−[3H脯氨酸掺入(non-collagenous蛋白质)]/ DNA含量(μg /)
总共35μl 0.2米三羟甲基氨基甲烷/ 0.3 M氯化钙液pH值7.5和15μl 50毫米N-ethylmalemide被添加到每个好而另外50 U /高度纯化的细菌胶原酶(沃辛顿公司,新泽西,美国)添加到井分配确定non-collagenous蛋白的生产。板块在孵化37°C 90分钟。蛋白质被沉淀用50%三氯乙酸(TCA)和孵化冰一小时。盘子洗与10%柠檬酸和结合放射性每口井由闪烁扫描。
DNA量化
HSC培养在不同浓度的松弛素的存在与否是细胞溶解的磷酸缓冲盐(PBS)或TE,用和DNA内容由添加bisbenzamidazole(宏彻33258)(微孔)或PicoGreen(分子探针、莱顿、荷兰),然后由氟量计量化。25
收集HSC的媒体和RNA的提取条件
HSC培养不同时间的血清包含媒体洗了三次在无血清DMEM和孵化2.5毫升新鲜血清含有抗生素和自由媒体0.01% BSA松弛素1 - 100 ng / ml不同时间的如前所述。媒体被离心收集和澄清。细胞层细胞溶解在4 M异硫氰酸胍盐之后,RNA是孤立的酸/苯酚方法如前所述。26
胶原酶的定量
胶原酶活性测定条件主要媒体或早期通过HSC的不断培养和松弛素100 ng / ml 1 - 3天,如前所述。21
北部的分析
整除10μg总RNA电泳和转移到尼龙膜。TIMP-1探针,MMP-13, I型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) TGF-β1,和β-actin转录有关cDNA使用Megaprime DNA标签工具包(Amersham)和α-32P] ATP (Amersham)。一夜之间杂交膜清洗后在0.2% 55°C钠十二烷基硫酸/ 0.15 M氯化钠,0.015 M柠檬酸钠,pH值7,和接触x雷电影−70°C或风暴磷成像仪屏幕(分子动力学,森尼维耳市,加州,美国)。
TGF-β1定量
积极和媒体总TGF-β1条件培养HSC测量使用商业ELISA(研发系统,阿宾顿,英国)。样本化验直接量化活跃TGF-β1或酸活化后,这一过程激活任何潜在TGF-β1因此允许测量总TGF-β1(潜伏+活动)。一夜之间,ELISA,盘子被涂用单克隆反人类的TGF-β1抗体,洗,然后屏蔽。标准和样本添加了两个小时,然后孵化与生物素化的进一步两小时反人类的TGF-β1抗体。Streptavadin合(剑桥大学生物科学,剑桥,英国),然后四甲基联苯胺解决方案以及过氧化物酶底物(σ,普尔,英国)是用于检测。颜色开发停止了硫酸和板在540海里。
体内的肝纤维化模型
确定体内松弛素的影响,肝纤维化是由四氯化碳诱导(三地4)在28天实验时间的松弛素由一个渗透微型泵。
二十八天渗透微型真空泵(模型2号ml4;Alza公司,美国加州帕罗奥多市)装载2.0毫升0.2毫克/毫升耻骨松弛激素或PBS(控制)。男性Sprague-Dawley泵下植入皮下注射异氟烷麻醉大鼠体重200 - 300克。六个动物收到PBS和创新领导力428天(控制)和六个动物收到松弛素和创新领导力428天(耻骨松弛激素治疗)。交付的渗透微型泵持续松弛素剂量约为0.5 - -0.6毫克/公斤/天。动物腹腔内注射0.2毫升/ CCl 100 g无菌4用橄榄油在1:1每周两次。所有的动物收到人道关怀,免费获取标准的食物和水。研究符合英国内政部准则和一般健康的老鼠每天监测。在研究结束的时期,动物被杀,血收集测定血清松弛素浓度(由ELISA Connetics corp .),肝脏切除和衡量。
每个肝羟脯氨酸含量测定(如前所述)27与一些细微的修改。
结果
松弛素活化HSC减少胶原合成和沉积的文化
松弛素的体外效果在HSC胶原蛋白分泌是量化天狼星红染色法和分光光度法。孵化的HSC 48小时耻骨松弛激素诱导一个温和但一致的剂量依赖性降低胶原蛋白沉积在组织培养板的数量(无花果1)(0.05 > p > 0.01, n = 7,松弛素10和100 ng / ml而控制配对t测试)。松弛素对胶原合成的影响,活化HSC放射性标记了脯氨酸掺入到胶原蛋白组织培养上清液中。耻骨松弛激素治疗(100 ng / ml)导致胶原蛋白合成减少40%在24小时内(无花果1B) (0.05 > p > 0.01, n = 5,松弛素1、10和100 ng / ml而控制配对t测试)。一个验证性的实验评估胶原蛋白合成3H脯氨酸掺入了一段人类HSC的文化与耻骨松弛激素(100 ng / ml) 24小时导致胶原蛋白生产减少71%。
松弛素对肝星状细胞(HSC)的影响胶原沉积。主要HSC培养在松弛素的存在三个浓度。(A)胶原蛋白沉积在组织培养板由天狼星红绑定,量化描述的方法。松弛素对HSC所示与未经处理的控制(定义为100%)。结果平均百分比变化七个独立的实验中观察到(* p < 0.05,配对t检验)。(B)松弛素对胶原合成的影响所决定的3H脯氨酸掺入。结果意味着比例五个独立的实验中观察到(*配对t检验p < 0.05)。
分泌TIMP-1 HSC和TIMP-2受接触松弛素
Zymographic技术被用来研究MMP与TIMP分泌HSC(无花果2)。24小时后的松弛素曝光,减少浓度依赖TIMP-1 TIMP-2观察。白明胶酶A和B被活化HSC持续分泌(无花果2)。然而,松弛素没有诱导的分泌的改变发酵菌或活动形式的白明胶酶a或b没有活动归因于分泌鼠间质胶原酶MMP-13 zymography在任何观察到的实验。此外,没有检测到胶原酶的活动14C标记胶原原纤维化验条件媒体的HSC暴露于耻骨松弛激素(100 ng / ml)一至三天,或任何的控制文化。
白明胶酶的识别(凝胶)A和B zymography和组织金属蛋白酶的抑制剂1和2 (TIMP-1和TIMP-2)条件的反向zymography媒体培养肝星状细胞(HSC)。5天的文化主要HSC在无血清培养条件下不同松弛素浓度为24小时。受到zymography和反向zymography上层清液,所述的方法。与Coomassie蓝染色后,乐队对应的预期分子量白明胶酶B (92 kDa)和白明胶酶(72 kDa)被观察到。没有检测基质金属蛋白酶13日活动的证据。增加金属蛋白酶激活孵化缓冲显示暗带光背景对应的预期分子量TIMP-1 (kDa 29日)和TIMP-2 (kDa 22日)。这个反向光密度分析酶谱表明TIMP-1降低了48%,TIMP-2 83%,以应对100 ng / ml松弛素。结果是代表两个独立的实验。
TIMP-1但不是I型胶原蛋白mRNA由耻骨松弛激素调节
调查是否松弛素调节I型胶原蛋白mRNA水平,HSC培养在不同浓度的松弛素的存在与否。总RNA受到northern然后对I型胶原蛋白mRNA。这显示无显著差异在I型胶原蛋白mRNA表达与接触松弛素7天期的三个独立的实验(图3)。此外,mRNA表达无显著变化对大鼠间质胶原酶(MMP-13)或α-SMA中检测出三个独立的实验。然而,暴露于100 ng / ml耻骨松弛激素导致的TIMP-1 mRNA表达略有下降;光密度分析表明下降38%相对于β-actin回应100 ng / ml的松弛素(意思是两个独立的实验)。
北部的污点分析肝星状细胞(HSC)培养一系列松弛素的浓度。总RNA提取主要HSC培养7天的松弛素的存在与否。北部的分析和探索膜与[α-顺序32P]标签随机启动cDNA探针,所描述的方法。结果是代表两个独立的实验。TIMP-1,的金属蛋白酶组织抑制剂1;MMP-13,基质金属蛋白酶13;α-SMAα平滑肌肌动蛋白。
松弛素不调解表达式或活化的HSC TGF-β1
的差别减少胶原蛋白沉积和对这些TIMP-1观察到耻骨松弛激素治疗文化活化HSC是一致的,差别TGF-β1对这些基因的表达和激活TGF-β1测定。北方的分析主要从激活RNA或早期通过HSC,不断培养与松弛素100 ng / ml一至五天了没有改变TGF-β1 mRNA表达相对于控制文化(图4)。的分泌量TGF-β1出现在条件媒体培养HSC被ELISA量化。图5显示代表三个独立的实验结果使用初级HSC,证明没有改变活性(图的水平5(图)或潜在的(全部)5B) TGF-β1回应文化与耻骨松弛激素24 - 72小时。同样,没有潜在的变化或活跃TGF-β1分泌到月初的媒体通道HSC暴露于耻骨松弛激素与控制文化(n = 2)。一个进一步实验进行人类HSC通道,又没有水平的差异活动或总TGF-β1被认为人类HSC的条件媒体接触松弛素100 ng / ml为24小时。
北部污点分析转化生长因子β1 (TGF-β1)mRNA在肝星状细胞(HSC)培养存在与否的耻骨松弛激素24小时(100 ng / ml)。从第五天主要提取的总RNA HSC (A)或通过P1 HSC (B)和10μg整除受到northern和TGF-β1探测。底部面板显示了北部印迹和顶部面板溴化乙锭染色的28 S和18 S核糖体乐队作为一个控制。
![Northern blot analysis of hepatic stellate cells (HSC) cultured with a series of concentrations of relaxin. Total RNA was extracted from primary HSC cultured for seven days in the presence or absence of relaxin. Northern analysis was performed and the membranes probed sequentially with [α-32P] labelled random primed cDNA probes, as described in the methods. The results are representative of two independent experiments. TIMP-1, tissue inhibitor of metalloproteinase 1; MMP-13, matrix metalloproteinase 13; α-SMA, alpha smooth muscle actin.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/49/4/577/F3.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
转化生长因子β1 (TGF-β1)水平条件培养HSC的媒体。初级(第五天)肝星状细胞在无血清培养条件孵化在(+)或耻骨松弛激素缺乏(−)100 ng / ml 24 - 72小时和活跃的总量和潜在TGF-β1所决定的。水平的活跃TGF-β1表示在(A)和潜在的(总−活跃)TGF-β1 (B)。结果显示代表三个独立的实验之一。
松弛素减少胶原蛋白沉积在体内的肝纤维化模型
松弛素的体内效应对肝纤维化的发展是研究使用CCl老鼠4模型和连续皮下注入重组松弛素。松弛素的有效交付证实了测量血清松弛素治疗组的实验周期结束。平均血清松弛素面为18.8 ng / ml(范围0.7 - -41.7)。松弛素是未经处理的雄性小鼠的血清检测不到。CCl 28天后4中毒、耻骨松弛激素治疗导致显著降低肝重量相对于控制肝脏(表示为(SEM), 17.8(0.57)克耻骨松弛激素治疗v控制20.1 g (0.56);由Mann-Whitney p > 0.05;每一组n = 6)。肝羟脯氨酸水平相对较低的耻骨松弛激素治疗组相对于对照组(耻骨松弛激素治疗1.29(0.06)μmol / g湿重v控制1.85(0.12)μmol / g湿重)。进一步分析,确定正常大鼠肝脏羟脯氨酸含量为0.95松弛素μmol / g湿重(n = 3)。松弛素对肝脏的总肝羟脯氨酸含量显著减少相对于控件(耻骨松弛激素治疗22.9 (1.7)v控制37.2(2.9)μM;由Mann-Whitney检验p < 0.01;为每个组n = 6)
讨论
我们提出了数据证明重组人类松弛素降低了有效的间质胶原蛋白沉积在组织培养和体内的肝纤维化模型。体外,我们检测了松弛素对HSC的影响,随着HSC显然认定为有一个重要的角色在肝纤维发生矩阵内稳态。HSC培养在塑料假设一个激活表型,以I型胶原蛋白升高,TIMP-1, TGF-β1表达式。我们的结果表明,文化活化HSC松弛素显示一致的处理剂量依赖性降低胶原蛋白的沉积而控制文化。我们试图确定这些变化的机制,所以研究I型胶原蛋白的蛋白质生物合成的水平,MMP-13, TIMP-1 TIMP-2, TGF-β1。我们也描述了松弛素的影响在I型胶原蛋白水平的成绩单,MMP-13 TIMP-1,α-SMA。总体而言,我们的研究结果表明,在该模型中松弛素介导的减少胶原蛋白沉积直接通过减少I型胶原蛋白合成、间接减少TIMP-1 TIMP-2表达式,从而可能提高矩阵退化。此外,我们的数据显示,这种效果不是TGF-β1的差别,通过对这些基因的表达介导的。最后,松弛素测试在一个良好并可重复的肝纤维化动物模型,研究其影响体内肝纤维化的发展。符合我们细胞培养数据,我们的结果在这个初步研究表明,治疗耻骨松弛激素导致肝脏大小减少针对纤维化损伤与总肝羟脯氨酸含量显著下降。
体外,文化主要HSC在塑料是一个建立模型,模拟的表型变化的过程发生在肝损伤后肝星状细胞的活化起。胶原蛋白沉积在细胞层评估使用的天狼星红染色法测定证明显著降低胶原蛋白的量由主要HSC培养松弛素的存在。确定沉积与胶原蛋白合成,减少我们对胶原合成使用放射性标记脯氨酸掺入在有限时间内HSC培养和没有松弛素。化验给一个明确的可再生的和显著影响胶原合成和分泌,证明耻骨松弛激素减少胶原蛋白合成率和总胶原沉积的文化HSC激活。
北部分析用于评估I型胶原基因表达在文化主要HSC激活、确定监管松弛素I型胶原在mRNA水平。没有发现一致的变化由于文化与耻骨松弛激素,结果在人类皮肤成纤维细胞不同于观察。15尽管I型胶原蛋白mRNA水平可能受蛋白介导的变化稳定,28连续松弛素暴露长达七天的时间HSC隔离未能引起mRNA的任何变化。这些结果表明,耻骨松弛激素调节胶原蛋白沉积在这些细胞的转化或翻译后水平。此外,有效的沉积可能也取决于基质降解速率的变化
我们继续检查金属蛋白酶的表达和TIMPs HSC,因为他们可以直接调节胶原蛋白水平通过矩阵退化和营业额。符合假设松弛素诱发一个矩阵退化在HSC表型,温和但一致的降低TIMP-1 mRNA表达和分泌减少明显的剂量依赖TIMP-1和TIMP-2活动,由反向zymography,松弛素暴露后了。这个结果是重要的潜在的重要性金属蛋白酶抑制剂,特别是TIMP-1,在体内肝纤维化的进展8,9,21,29日,30.在体外活化的HSC表现型的收购。8,21松弛素的直接影响成纤维细胞表达TIMP已经记录。15,31日,32然而,我们发现没有松弛素介导增强胶原酶(MMP-13)表达式。这些发现并不排除关键矩阵退化发生在集中和当地的方式立即毗邻HSC。尿激酶纤溶酶原激活物活性,因此已经局部纤溶酶原激活物在HSC细胞表面。33白明胶酶A和B,持续分泌的HSC在松弛素的存在,已经被证明有弱溶胶原的活动34但并不受松弛素。
我们探讨了假设所观察到antifibrotic松弛素的影响可能是介导的差别,通过对这些内生TGF-β1。松弛素和TGF-β1系统可以被认为是相互对立的效果。此外,TGF-β1 HSC在自分泌的方式和表达的上调TIMP-1表达式。35,36相对于控制,TGF-β1 mRNA表达持平在初级和通道HSC早期暴露于耻骨松弛激素分泌也没有差异的潜在TGF-β1对松弛素的反应。这表明,松弛素的影响在HSC不是通过TGF-β1介导。
最后,松弛素在三地检测其效果4诱导大鼠肝纤维化。松弛素治疗诱导显著减少肝脏重量和整体相对于羟脯氨酸含量控制。这些数据表明,观察松弛素对胶原蛋白的影响和TIMP表达组织文化反映在体内的肝纤维化模型。松弛素的血清水平达到大大超出人类的生理水平达到900 pg / ml在怀孕的前三个月。37减少肝脏羟脯氨酸含量在这个模型是比得上在啮齿动物模型的肺纤维化治疗耻骨松弛激素18但不那么引人注目的观察与啮齿动物皮肤纤维化。17综上所述,数据显示,重组人类松弛素调节结缔组织纤维化的沉积在啮齿动物模型虽然跨越物种的作用可能会减弱。然而,这些研究代表的概念验证需要进一步评估松弛素在纤维模型的有效性。更详细的研究松弛素的作用在调节提出了预先存在的纤维损伤。
总之,我们的结果是一致的与之前报道的能力松弛素抑制胶原蛋白沉积,促进胶原降解胶原蛋白过表达的情况下。我们报告的大小变化是其他啮齿动物的研究中观察到的类似。17,18我们的研究代表了一个概念验证,松弛素是值得进一步研究的代理修改在肝脏纤维化的能力。
确认
这项工作是由英国医学研究理事会(格兰特博士没有G84/4764支持EJ Williams)。JP Iredale本是一个高级临床研究员和MRC合作小组的一员,感激地承认英国肝脏的支持信任和威塞克斯医疗信托。
略语
- HSC
- 肝星状细胞
- TIMP
- 的金属蛋白酶组织抑制剂
- MMP的
- 基质金属蛋白酶
- α-SMA
- α-平滑肌肌动蛋白
- TGF-β1
- 转化生长因子β1
- DMEM
- 杜尔贝科的最小的重要媒介
- 美国公共电视台
- 磷酸缓冲盐
- BSA
- 牛血清白蛋白
- 柠檬酸
- trichloracetic酸
- 创新领导力4
- 四氯化碳